放射性药物99mTc-HL91在大鼠脑缺血模型的初步研究

http://www.100md.com 《中华放射医学与防护杂志》 1999年第4期

     作者：周颖 屈婉莹 李萌 陈方 姚稚明 朱明 朱霖

    单位：周颖、屈婉莹、姚稚明、朱明 100730 北京医院核医学科，李萌 神经外科；陈方 北京协和医院核医学科；朱霖 国家标准物质研究中心

    关键词：锝；HL91；大鼠；脑缺血

    中华放射医学与防护杂志/990422

    【摘要】 目的 探讨国内首次合成的放射性药物^99mTc-HL91在脑血管疾病诊断中应用的可能性。方法 对^99mTc-HL91进行一般性质、标记率、体外稳定性、异常毒性和正常小鼠体内生物分布等实验。建立15只大鼠脑缺血模型，并在该模型上进行^99mTc-HL91体内分布和乏氧显像研究。结果 ①HL91药盒标记简便，安全稳定。②正常小鼠静脉注射^99mTc-HL91后血中放射性迅速下降，肝、肾和胃肠道的放射性较高，心肺清除很快，正常脑组织摄取低。③处死前脑部显像及处死后离体脑组织显像均于注射^99mTc-HL91 4小时后可见患侧脑组织较对侧放射性增高，且显示的缺血区范围大致相似。④在不同时相离体脑组织显像图上， 利用感兴趣区技术，计算患/健侧大脑中动脉供血区脑组织放射性比值分别为0.98±0.06、0.99±0.05、1.29±0.03、1.56±0.14、1.66±0.06，除1与2、8与12小时外，其余各组间两两比较差异均有显著性(P<0.05～P<0.001)。 ⑤体外测量缺血侧脑组织与正常脑组织单位重量放射性比值随注射放射性药物的时间延长而逐渐增高。结论 ^99mTc-HL91在缺血缺氧脑组织滞留增加，清除速度减缓。实验研究和临床应用于脑显像时可能在注射后4小时为宜。

    Use of hypoxia imaging agent99mTc-HL91 in rat cerebral ischemia models

    ZHOU Ying, QU Wan-ying, LI Meng, et al.

    Department of Nuclear Medicine, Beijing Hospital, Beijing 100730,China.

    【Abstract】 Objective To explore the possibility of diagnosis for cerebrovascular disease by a novel synthetic hypoxia agent^99mTc-HL91 used in rat cerebral ischemia models. Methods Pharmacological experiments of ^99mTc-HL91 were carried out including common properties, radiochemical purity, stability in vitro, anomalous toxicity test and biodistribution in mice. Fifteen cerebral ischemic rat models were established and received 99mTc-HL91 scintigraphy. Results ①HL91 kits were labeled with 99mTc easily and showed high radiochemical purity and stability.②Rapid clearance in blood, heart and lungs and high activity in liver, kidneys and intestines were observed. Relatively low uptake in brain was identified. ③ The radioactivity in ischemic brain tissue increased significantly at 4h postinjection in both rat images and isolated brain images.④The radioactivity ratios of lesion to normal brain tissue by drawing ROIs in isolated brain planar images were 0.98±0.06，0.99±0.05，1.29±0.03，1.56±0.14 and 1.66±0.06 at 1，2，4，8 and 12 h postinjection, respectively. There were significant differences among all groups except for 1 h and 2 h, 8 h and 12 h postinjection (P<0.05～P<0.001). ⑤ The radioactivity ratios in per unit weight of ischemic to normal brain tissues were gradually increasing. Conclusion Increased retention ratio and decreased clearance rate of ^99mTc-HL91 in the hypoxic, ischemic brain tissue have been proved. It is appropriate to perform imaging at 4 h postinjection.

    【Key words】 Technetium HL91 Rat Cerebral ischemia

    乏氧组织显像剂是目前国际上放射性药物的研究热点之一。它能被结构完整具有代谢功能的细胞摄取，在细胞内的代谢取决于组织氧水平^[1]。目前已能够利用放射性核素标记乏氧显像剂，通过单光子发射计算机断层成像(SPECT)和正电子发射计算机断层成像(PET)，非创伤性地了解组织的乏氧状态。少量的在大鼠、沙土鼠、猫等脑缺血模型的实验研究和个别的初步临床研究所得到的结果表明，乏氧显像剂能滞留于急性缺血仍存活尚未坏死的脑组织^[2-7]。本研究目的是将国内首次合成的99mTc标记的新型乏氧组织显像剂HL91进行一般性质、无菌、无热源、异常毒性及动物体内生物分布等实验；建立大鼠脑缺血模型；并在该模型上进行^99mTc-HL91的乏氧显像研究，探讨其在脑血管疾病诊断中应用的可能性。

    材料和方法

    1.实验动物：昆明小鼠(北京协和医院动物中心提供)，雄性，体重18～20 g。Wistar大鼠(北京医科大学动物中心提供)，雌雄不限，体重300～350 g。

    2.主要试剂及用品：HL91(4，9-二氮-3，3，10，10-四甲基十二烷-2，11-二酮肟)、DTPA(二乙三胺五乙酸)冻干药盒由国家标准物质研究中心耐思达新技术发展公司提供。一支HL91冻干品含HL 91 1 mg，一支DTPA冻干品含DTPA 20 mg、SnCl2^.2H2O 1 mg。^99mTcO-4淋洗液由中国原子能科学研究院同位素所提供。麻醉药复方氯胺酮注射液为军事医学科学院毒物药物研究所产品。栓塞血管所用单股非吸收性尼龙缝线为爱惜康公司生产，规格为6/0。涂线用的硅树脂胶系江门市振兴化工厂产品。

    3.主要仪器：美国GE STARCAM 4000XC SPECT，配置针孔准直器。北京综合仪器厂F-1901井型γ闪烁计数器。日本Topcon OMS600手术显微镜。

    4.标记方法：取HL91冻干品一支，加入185～2 035 MBq(5～55 mCi)/2 ml新淋洗的Na^99mTcO4注射液，使之全部溶解。另取一支DTPA药盒(每支含1 mg SnCl2^.2H2O)，用4 ml生理盐水溶解，然后迅速取出40 μl(含10 μg SnCl2^.2H2O)注入上述标记药盒中，摇匀后室温下放置10分钟即可。

    5.理化性质及质量控制方法：①一般理化性质：用pH试纸测量药盒生理盐水溶液的酸度，目测标记产物颜色和澄清度及冻干品药盒外观。②标记率或放化纯度测定：采用双体系检测。纸层析法：新华1号层析纸支持，甲醇展开。硅胶薄层层析法：ITLC-SG层析板(Gelman公司生产)支持，生理盐水展开。③标记物体外稳定性实验：标记物在室温下放置4小时后，或用生理盐水稀释后，重新测定标记率。④无菌、无热源和异常毒性实验：参照中国药典1995版二部附录所述的方法进行。

    6.小鼠体内动态分布：按常规方法进行。30只正常昆明小鼠，分为5组，每组6只，每只尾静脉注射5.55 MBq(150 μCi)/0.2 ml ^99mTc-HL91，分别于5分钟、30分钟、1、2、4小时不同时相处死动物，处死后即刻取血100 μl，并剥离心、肺、肝、脾、肾、胃、肠、肌肉、脑等脏器，称重，测量放射性计数，计算不同时相血和各脏器每克组织百分剂量(%ID/g)分布值。

    7.制作大鼠脑缺血模型：参照Zea Longa和Roussel的方法[8，9]，将15只Wistar大鼠，肌肉注射复方氯胺酮(0.07～0.13 ml/kg)麻醉后，仰卧固定，在显微镜下(放大10～20倍)切开颈部皮肤，暴露并分离左侧颈总动脉分叉、左侧颈外动脉及颈内动脉颅外段，电凝颈总、外动脉。将头端7 mm范围内涂有一层硅胶的尼龙缝线(6/0, 20 mm长)，经颈外动脉上的切口，插入颈内动脉，并向颅内方向深入约15～17 mm，遇阻力而停止，栓子头端即可达左大脑中动脉起始部，然后电凝颈内动脉，缝合皮肤。

    8.大鼠脑缺血模型摄取^99mTc-HL91的研究：15只大鼠脑缺血模型分为5组，每组3只，所有模型均于栓塞1小时后静脉注射^99mTc-HL91 185 MBq(5 mCi)/0.5 ml，分别于1、2、4、8、12小时不同时相分组处死动物，开颅取脑。处死前对大鼠脑部及处死后对新鲜离体脑组织在针孔准直器下行静态后位平面显像。采集矩阵256×256，放大倍数为2.0。显像后将左、右两侧大脑和小脑、两侧大脑、两侧视交叉前后5 mm脑组织(相当于大脑中动脉主要供血区)称重，测放射性计数，计算患(左)/健(右)侧脑组织单位重量放射性比值。另外，将在针孔准直器下采集的离体脑组织的静态平面显像图，利用感兴趣区(ROI)技术，分别于左、右两侧大脑中动脉供血区脑组织处各画一个20×20象素大小的感兴趣区，计算左/右两侧感兴趣区内放射性计数比值。

    9.统计学处理：所有计量资料结果以均数±标准差表示，两样本均数比较行非配对t检验。

    结果

    1.^99mTc-HL91的一般特性：^99mTc-HL91注射液pH值为7～9，系无色透明液体。采用纸层析法和硅胶薄层层析法双体系展开，测定的放化纯度均在93.5%～98.6%之间，室温放置4小时后重复测定标记率仍大于90%，标记物用生理盐水稀释后，标记率保持不变。无菌、无热源及异常毒性实验结果符合规定。

    2.^99mTc-HL91在小鼠体内分布：不同时相^99mTc-HL91在正常小鼠的体内分布见表1。正常小鼠静脉注射^99mTc-HL91后血中放射性迅速下降，肝、肾和胃肠道的放射性较高，心肺清除速度很快，^99mTc-HL91在正常脑组织摄取低。

    表1 99mTc-HL91小鼠体内每克组织百分剂量分布(±s,n=6)

    器官

    99mTc-HL91的分布(%ID/g)

    注药后5分钟

    注药后30分钟

    注药后1小时

    注药后2小时

    注药后4小时

    血

    0.54±0.06

    0.14±0.05

    0.06±0.02

    0.05±0.01

    0.06±0.02

    心

    0.91±0.25

    0.16±0.02

    0.08±0.01

    0.06±0.01

    0.10±0.01

    肺

    1.25±0.15

    0.32±0.08

    0.10±0.02

    0.07±0.02

    0.06±0.01

    肝

    8.69±2.19

    11.40±1.28

    10.56±1.75

    10.27±3.14

    9.60±1.72

    脾

    0.72±0.13

    0.13±0.03

    0.09±0.02

    0.08±0.02

    0.09±0.01

    肾

    4.90±0.52

    1.72±0.71

    0.66±0.37

    0.33±0.10

    0.20±0.03

    胃

    0.93±0.19

    1.11±0.33

    0.50±0.17

    0.56±0.18

    0.46±0.12

    小肠

    4.69±0.78

    8.71±4.43

    14.65±2.60

    12.03±2.13

    2.13±1.07

    肌肉

    1.11±0.27

    0.15±0.07

    0.08±0.01

    0.03±0.01

    0.03±0.02

    脑

    0.04±0.02

    0.04±0.01

    0.03±0.00

    0.03±0.00

    0.03±0.00

    3.注射99mTc-HL91后1小时和2小时模型大鼠脑部静态显像示患侧脑组织较对侧放射性增高不明显，自4小时起可见患侧脑组织较对侧放射性增高，8、12小时缺血脑组织亦呈放射性增高。于不同时相处死大鼠后离体脑组织静态显像与上述结果相同，且显示缺血区范围大致相似。在1、2、4、8、12小时不同时相离体脑组织显像图上，分别勾划感兴趣区计算患/健侧大脑中动脉供血区脑组织放射性比值见表2，除1小时组与2小时组，8小时组与12小时组之间差异无显著性外，其余各组之间两两比较差异均有显著性(P<0.05～P<0.001)。

    表2 大鼠离体脑显像缺血/正常脑组织放射性比值

    编号

    放射性比值

    1h

    2h

    4h

    8h

    12h

    1

    0.91

    1.04

    1.28

    1.65

    1.59

    2

    1.00

    0.94

    1.26

    1.40

    1.71

    3

    1.02

    1.00

    1.32

    1.63

    1.67±s

    0.98±

    0.99±

    1.29±

    1.56±

    1.66±

    0.06

    0.05

    0.03＃

    0.14*＃§

    0.06**^＃＃§§

    注： 与1小时组比较*P<0.01，**P<0.001; 与2小时组比较^＃P<0.01，＃＃P<0.001;与4小时组比较^§P<0.05，^§§P<0.01

    4.表3显示了不同时相体外测量缺血侧脑组织与正常脑组织单位重量的放射性比值。它们随着注射放射性药物的时间延长而逐渐增高(P<0.05至P<0.001)。其中一只注药后12小时处死的脑缺血大鼠缺血区/正常脑组织放射性比值最大，为3.47。

    表3 大鼠体外测量不同时相患/健侧脑组织单位重量放射性比值

    时相(小时)

    放射性比值 (±s)

    大、小脑

    大脑

    MCA主要供血区

    1

    0.96±0.02

    0.98±0.01

    0.98±0.05

    2

    1.01±0.01*

    1.05±0.02**

    1.08±0.01

    4

    1.15±0.11*

    1.19±0.11

    1.47±0.04***

    8

    1.42±0.14**

    1.70±0.09***

    2.03±0.21**

    12

    1.70±0.40*

    2.12±1.18

    2.18±0.41**

    注： 与1小时组比较*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

    讨论

    本文作者所应用的^99mTc-HL91是将^99mTc-HL91-MISO去除硝基咪唑基团后形成的产物，合成更为简单，容易标记，标记率高，不具细胞毒性，使用安全，体外稳定。由于其为99mTc标记化合物，半衰期适中，一次可以注射较多的剂量，对机体造成的辐射损伤相对小，适用于具有普通SPECT仪器的医院，在临床推广应用上具有较好的前景。

    本研究中^99mTc-HL91小鼠生物学分布试验表明，正常小鼠注射^99mTc-HL91后血中放射性下降较快；肝、胃肠道放射性较高；双肾在早期摄取多，随后逐渐减少，至1小时已减少至不足早期摄取的1/7；提示^99mTc-HL91主要从泌尿系和胃肠道排泄。另外心肺清除速度很快，由于肝脏摄取高，心/肝比值低，可能影响对心肌病变(特别是下后壁心肌病变)的检测。但是^99mTc-HL91在正常脑组织摄取低，又不受摄取较高的肝脏、肾、胃肠道等脏器的影响，因而对于脑血管疾病所致脑组织损伤和脑部肿瘤的检测提供了便利。

    为了研究大鼠脑缺血的病理生理状况，自70年代末期就采用多种方法在啮齿类动物上制作全脑或局灶性脑缺血模型。由于方法繁琐，创伤大，模型结果不能满足研究需要等弱点，未能在研究中广泛应用。80年代后期，Zea Longa等^[8]提出不需开颅而通过颈内动脉放线的方法，间接阻断大鼠大脑中动脉起始部制造脑缺血模型。并证明这种模型在研究实验性暂时和永久局部脑缺血方面，模拟人类脑血管阻塞性疾病有非常重要的用途。90年代初期，Roussel等^[9]又对上述方法进行了改良，主要是在插入的颈内动脉的缝线上粘附一层硅树脂胶，然后插入颈内动脉。李萌等^[10]亦报道了用类似的方法建立大鼠局灶性脑缺血模型，并证实其方法可靠实用。本研究中制作脑缺血模型所不同的是将单股尼龙缝线头端7 mm范围内涂一层硅树脂胶，其干燥后柔软有弹性，插入时不易损伤血管内膜，并能适应不同管径的血管，能更好地达到阻塞血管的作用；另外缝线经颈外动脉上切口插入。由于术中创伤小，对血管和组织的破坏轻，动物死亡率低，具有较Zea Longa和Roussel方法更多的优点。

    本研究结果显示阻塞大脑中动脉所致大鼠脑缺血模型注射^99mTc-HL91后至2小时，体内及离体大鼠脑显像患侧脑组织没有明显的放射性增高，体外测量患侧(左)/健侧(右)脑组织单位重量放射性比值均小于1.1；自4小时后体内及离体脑显像均可清楚地显示缺血脑组织较对侧放射性增高，且范围大致相似；利用感兴趣区技术测得缺血脑组织/正常脑组织放射性比值大于或近似等于1.3；体外测量阻塞侧大脑中动脉供血区相应部位的脑组织/正常脑组织单位重量的放射性比值在4、8、12小时分别为1.47±0.04，2.03±0.21，2.18±0.41。这说明^99mTc-HL91在缺血缺氧脑组织中滞留率在一定时间段内随时间延长而增加，清除速度延缓，与文献报道相似^[3，4]。^99mTc-HL91能够选择性滞留于缺血部位的脑组织中，缺血/正常脑组织的放射性比值能够满足SPECT显像的要求，并能在病变组织中有一定的滞留时间，但是注射时间与得到阳性图像的时间间隔较长，提供的信息量低，这些不足之处仍需进一步改进。此外，HL91是去除了2-硝基咪唑基团的新型乏氧显像剂，这类乏氧显像剂除了可能与硝基咪唑相同的原理外，有文献报道还可能与线粒体的还原机制有关^[5]。但其真正的显像原理目前尚不清楚，有待于在以后的研究中深入探讨。

    总之，^99mTc-HL91以其标记方便，安全稳定，在缺血所致缺氧的脑组织中滞留增加，清除延缓等特性，在脑血管疾病的诊断中，对判断缺氧但存活的脑组织可能有良好的应用前景。

    本课题受国家攀登计划B项目资助(项目号：85-45-05-3)

    参考文献

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    8 Zea Longa E, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke, 1989,20:84-91.

    9 Roussel SA, Van Bruggen N, King MD, et al. Monitoring the initial expansion of focal ischaemic changes by diffusion-weighted MRI using a remote controlled method of occlusion. NMR Biomed,1994,7：21-28.

    10 李萌，裘明德，康笃伦.可恢复血流的大鼠局灶性脑缺血模型的研究.中华外科杂志，1990，28：768-770.

    (收稿:1999-04-12 修回:1999-05-17)

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/analecta/2003/08/29/67/218.htm