预测肿瘤内在辐射敏感性方法之现状
作者：薛文成 王宝勤
单位：薛文成 110015 沈阳，沈阳军区总医院；；王宝勤 北京放射医学研究所
关键词：
中华放射医学与防护杂志/990535 为了实现肿瘤放射治疗的个体化，首先要选择适合于放射治疗的病人，然后再根据病人临床表现、正常组织及肿瘤组织的辐射敏感性等情况综合判断，制定出适合的治疗方案。其中，肿瘤组织原位辐射敏感性主要取决于肿瘤细胞本身固有的辐射敏感性，因而国际上众多的研究主要集中在建立快速、灵敏、准确预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法。为了研究方便，目前大量的研究集中在体外培养肿瘤细胞株的研究上。随着预测方法的进一步成熟，研究对象必将转到临床肿瘤活检组织上来。目前的研究主要集中在以下方面。
一、细胞水平
1.细胞集落形成实验
, 百拇医药
定量接种细胞，射线照射后继续培养一段时间，计数集落形成数。集落形成率=集落数/接种细胞数；存活分数(SF)=照射后集落形成率/未照射集落形成率。这类方法有普通培养法、极限稀释法，以及用于活检组织原代培养的软琼脂集落形成法、粘着肿瘤细胞培养系统等方法。研究表明，2 Gy照射后肿瘤细胞的存活分数(SF2)与放疗后病人2年存活率、局部控制率、复发率等密切相关[1]。这些方法的缺点是比较繁琐、费时，不适合临床应用，但是可作为评价体外实验方法的标准。
2.肿瘤细胞生长动力学参数——肿瘤细胞潜在倍增时间(Tpot)
定义：假设无细胞丢失的情况下，肿瘤细胞数量倍增所需时间。
Tpot的测定方法，多数研究用的是流式细胞仪分析法。主要原理：体内注入胸腺嘧啶类似物溴脱氧尿核苷(Brdurd)，一定时间后经组织活检采集标本，制备单细胞悬液，抗体标记后上流式细胞仪分析，即可计算出肿瘤细胞潜在倍增时间(Tpot)。其特点：可同时分析出细胞动力学的其他参数，如细胞分裂指数(LI)等，可为临床提供更多的信息。
, 百拇医药
Tpot方法是目前实际应用于临床放疗研究的少数方法之一。有许多研究报道了其在指导临床放射治疗方面的价值。但也有报道认为价值不大[3，4]。对该方法的实验室间质量控制调查结果表明，该方法的每一个步骤，各个实验室间的变异范围在38.1%～95.4%之间[5]。由此可见，该方法的标准化也可能是Tpot真正成为临床实用指标，指导临床放疗计划实施的关键所在。另外，与其他反映细胞增殖的参数如用Ki-67等抗体检测的细胞生长分数联合应用有可能更好地预测疗效。
3.细胞凋亡
目前常用的检测细胞凋亡的方法有形态学观察，流式细胞技术，DNA电泳(DNA Ladder)，DNA3’末端标记等，但各种方法的特异性、灵敏度都不是很理想。
细胞凋亡与肿瘤细胞辐射敏感性的关系，一般认为，放射治疗后产生了速发型凋亡的组织，其辐射敏感性相对较高，而迟发型凋亡与辐射敏感性的关系有待进一步研究[6]。组织自发型凋亡与辐射敏感性的关系，报道结果不一致[7，8]。
, 百拇医药
细胞凋亡的另一项应用是评价正常组织的辐射敏感性，从而筛选出对辐射敏感的个体[9]。
4.CB-细胞微核法
原理：微核是由细胞有丝分裂时未进入主核的染色体断片或整条染色体所形成，该法利用松胞素B在一定浓度下可以阻止细胞质分裂而不阻止细胞核分裂的特点，通过双核特征容易分辨出一次丝裂细胞，通过双核细胞中形成的微核数检测辐射敏感性。
特点：该法较为简便、快速，缺点是①高剂量照射易干扰细胞再增殖；②对于某些类型的肿瘤细胞，细胞凋亡也是其主要死亡形式，细胞凋亡的发生大大地影响该方法的正确性。
对于某些类型的组织细胞，该法与细胞集落存活试验有良好的相关性，但是对于另外一些有显著凋亡的组织细胞，基于微核形成和细胞凋亡的总细胞死亡(TCD)分析是更可取的方法[10，11]。
, 百拇医药
二、染色体水平
刘新帆等(1997)综述了检测染色体畸变做为肿瘤细胞辐射敏感性指标的研究进展[12]，这里不再重复。
三、DNA分子水平
众所周知，DNA双链是射线所致细胞损伤和死亡的敏感靶分子之一，DNA双链断裂和细胞死亡之间的关系已明确。因而，目前众多的研究都集中在DNA双链断裂及修复的检测上。
较早用于检测DNA双链断裂(dsb)及修复的方法有中性滤膜洗脱法等，由于繁琐、灵敏度差，现在已不用。目前的研究方法有以下几种。
1.脉冲电场凝胶电泳(PSFE)
原理：在特定的电泳条件下，已发生双链断裂的DNA片断在脉冲电场作用下从原点泳动进入凝胶，而更大的DNA分子仍留在原点，不能进入凝胶，根据两部分DNA量来计算DNA双链断裂程度。应用该方法检测dsb及修复，目前较为一致的认识是细胞的修复能力，即DNA双链断裂的重接率与细胞辐射敏感性相关，其敏感性指标为dsb半修复时间。文献报道dsb半修复时间与SF2有明显的相关性[13，14]。
, 百拇医药
PSFE法存在的问题有：①电泳装置不同，即使相同类型的装置，其电泳时间，脉冲交替时间等差异较大，而这些参数对DNA双链的泳出有很大的影响。②所需照射剂量仍然偏高，与临床分割放疗剂量相差较大。
2.梯度电压电泳(GVGE)
原理：在一个电压逐步增加的连续电场中，大分子DNA的泳动受到迟滞，而较小DNA分子片断则进一步泳动进入凝胶形成区带。该法的灵敏度为检测小于10 Mbp的DNA片断，而所有哺乳动物的染色体分子量均大于该检测限。该法只需普通电泳仪，无论是灵敏度还是DNA片段检测限，较之于PSFE都有提高[15]。
3.彗星电泳
彗星电泳也叫单细胞凝胶电泳，受照射的细胞与琼脂糖混合，经裂解后电泳，断裂的DNA片断或游离残断泳动出细胞外形成区带，由于单细胞荧光图像形似彗星，故称为“彗星”实验。彗星电泳与其他电泳方法相比较有以下特点：①该法可检测单个细胞DNA损伤(改变裂解液pH值，可检测出DNA单链断裂，DNA双链断裂，DNA超螺旋结构的丧失)，辅以图像分析、计算机处理，可实现定量检测。②所需照射剂量最小可到0.1 Gy。③无须用同位素标记DNA。④电泳时间，裂解细胞时间可在半小时内完成。因此它是一种更快速、灵敏的检测方法，也更适应临床活检标本细胞量少，临床放射治疗分割照射剂量γ射线在2 Gy，快中子在1 Gy左右的实际情况。不足之处是需要较为昂贵的图像处理仪对结果进行定量。
, 百拇医药
目前，该方法的研究仅限于体外培养细胞的研究[16-18]，有待结合临床做进一步的研究。
四、基因水平
基因是细胞生命活动的控制调节中心，现在已知与细胞辐射敏感性有关的基因有：癌基因如ras、raf、c-myc等；细胞凋亡相关基因如p53、bcl-2、bad、bax、bcl-x等。这些基因与辐射敏感性的关系比较复杂，以p53基因为例[19]，同样是基因突变，由于突变位点不同而引起细胞辐射敏感性增加或辐射耐受增加。此外，基因间的相互作用还远未阐明，加之目前检测方法的局限性，基因检测作为肿瘤辐射敏感性的指标还是不太可能。
五、其他
原位缺口平移(ISNIT)技术检测DNA损伤，DNA末端标记技术等也是可能的方法。
, 百拇医药
综上所述，目前看来较为有希望的指标和方法有Tpot法，脉冲电泳或梯度电压电泳、彗星电泳检测DNA双链断裂(损伤)及修复，CB-细胞微核法等。染色体早熟凝集(PCC)加荧光原位杂交(FISH)检测染色体畸变预测肿瘤细胞辐射敏感性也有一定的可靠性，但操作繁琐，不方便临床应用。细胞凋亡和辐射敏感基因的研究，虽然目前看来离实际应用还很远，但学术价值较高。
参考文献
1 West CML,Hendry JH.Intrinsic radiosensitivity as a predictor of patient response to radiotherapy.Radiat Res,1992,52:4453-4457.
2 祝捷，曹世龙，曹晓波，等.人鼻咽癌细胞CNE潜在性倍增时间(Tpot)与其放射后再增殖.中华放射肿瘤学杂志，1996，5：81-84.
, 百拇医药
3 Hlatky L,Hahnfeldt P,Olesiak M.Measurement of potential doubling time for human tumour xenografts using the cytokinesis-block method.Cancer Res,1996,156:1660-1663.
4 Bourhis J.Wilson G,Eschwege F.et al.Potential doubling time and clinical outcome in head and neck squamous cell carcinoma treated with 70Gy in 7 weeks.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1996,35:471-476.
5 Hanstermans K,Begg AC,Ramaekers M,et al.Can measurement of potential doubling time(Tpot)be compared between laboratories? A quality control study.Cytometry,1995,19:154-163.
, 百拇医药
6 Olive PL,Durand RE.Apoptosis:an indicator of radiosensitivity in vitro?Int J Radiat Biol,1997.71:695-707.
7 Levine EL,Renehan A,Gossiel R,et al.Apoptosis,intrinsic radiosensitivity and prediction of radiotherapy response in cervical carcinoma.Radiother Oncol,1995,37:1-9.
8 Wheele JA,Stephens LC,Tornos C,et al.Apoptosis as a predictor of tumour response to radiation in stage IB cervical carcinoma.Int J Radiat Biol Phys,1995,32:1487-1493.
, 百拇医药
9 Ozsahin M,Ozsahin H,Shi Y,et al.Rapid assay of intrinsic radiosensitivity based on apoptosis in human CD4 and CD8 T-lymphocytes.Int J Radiat Biol Phys,1997,38:429-440.
10 Bush C,McMillan TJ.Micronucleus formation in human tumour cells:lack of correlation with radiosesitivity.Br J Cancer,1993,67:102-106.
11 Abend M,Rhein A,Gilbertz KP,et al.Correlation of micronucleus and apoptosis assay with reproductive cell death.Int J Radiat Biol,1995,67:315-326.
, http://www.100md.com
12 刘新帆，殷蔚伯，谷铣之.肿瘤放射敏感性预测PCC+FISH方法.中华放射肿瘤学杂志,1997，6：122-124.
13 Ruiz de Almodovar,Nú
ez JM,McMillan MI.Initial radiation-induced DNA damage in human tumour cell lines:a correlation with intrinsic cellular radiosensitivity.Br J Cancer,1994,69:457-462.
14 Wei K,Wandl E,K
rcher KH.X-ray induced DNA double-strand breakage and rejoining in a radiosensitive human renal carcinoma cell line estimated by CHEF electrophoresis.Strahlenther Onkol,1993,169:740-744.
, http://www.100md.com
15 Zhou PK,Hendry JH,Margison GP.Comparative measurements of radiation-induced DNA double-strand breaks by graded voltage and pulsed-field gel electrophoresis.Int J Radiat Biol,1997,71:95-100.
16 P
ller F,Bauch T,Sauerwein W,et al.Comet assay study of DNA damage and repair of tumour cells following boron neutron capture irradiation with fast d(14)+Be neutrons.Int J Radiat Biol,1996,70:593-602.
, 百拇医药
17 M
ller WU,Bauch J, Streffer C, et al.Comet assay studies of radiation-induced DNA damage and repair in various tumour cell lines.Int J Radiat Biol,1994,65:315-319.
18 王军，陈艳，李艳春，等，中性单细胞凝胶电泳测定DNA双链断裂.中华放射肿瘤学杂志，1996，5：39-42.
19 Blank KR,Rudoltz MS,Kao G D,et al.The moleculation of apoptosis and implications for radiation oncology.Int J Radiat Biol,1997,71:455-466.
(收稿:1998-05-12 修回1998-12-03), http://www.100md.com
单位：薛文成 110015 沈阳，沈阳军区总医院；；王宝勤 北京放射医学研究所
关键词：
中华放射医学与防护杂志/990535 为了实现肿瘤放射治疗的个体化，首先要选择适合于放射治疗的病人，然后再根据病人临床表现、正常组织及肿瘤组织的辐射敏感性等情况综合判断，制定出适合的治疗方案。其中，肿瘤组织原位辐射敏感性主要取决于肿瘤细胞本身固有的辐射敏感性，因而国际上众多的研究主要集中在建立快速、灵敏、准确预测肿瘤细胞辐射敏感性的方法。为了研究方便，目前大量的研究集中在体外培养肿瘤细胞株的研究上。随着预测方法的进一步成熟，研究对象必将转到临床肿瘤活检组织上来。目前的研究主要集中在以下方面。
一、细胞水平
1.细胞集落形成实验
, 百拇医药
定量接种细胞，射线照射后继续培养一段时间，计数集落形成数。集落形成率=集落数/接种细胞数；存活分数(SF)=照射后集落形成率/未照射集落形成率。这类方法有普通培养法、极限稀释法，以及用于活检组织原代培养的软琼脂集落形成法、粘着肿瘤细胞培养系统等方法。研究表明，2 Gy照射后肿瘤细胞的存活分数(SF2)与放疗后病人2年存活率、局部控制率、复发率等密切相关[1]。这些方法的缺点是比较繁琐、费时，不适合临床应用，但是可作为评价体外实验方法的标准。
2.肿瘤细胞生长动力学参数——肿瘤细胞潜在倍增时间(Tpot)
定义：假设无细胞丢失的情况下，肿瘤细胞数量倍增所需时间。
Tpot的测定方法，多数研究用的是流式细胞仪分析法。主要原理：体内注入胸腺嘧啶类似物溴脱氧尿核苷(Brdurd)，一定时间后经组织活检采集标本，制备单细胞悬液，抗体标记后上流式细胞仪分析，即可计算出肿瘤细胞潜在倍增时间(Tpot)。其特点：可同时分析出细胞动力学的其他参数，如细胞分裂指数(LI)等，可为临床提供更多的信息。
, 百拇医药
Tpot方法是目前实际应用于临床放疗研究的少数方法之一。有许多研究报道了其在指导临床放射治疗方面的价值。但也有报道认为价值不大[3，4]。对该方法的实验室间质量控制调查结果表明，该方法的每一个步骤，各个实验室间的变异范围在38.1%～95.4%之间[5]。由此可见，该方法的标准化也可能是Tpot真正成为临床实用指标，指导临床放疗计划实施的关键所在。另外，与其他反映细胞增殖的参数如用Ki-67等抗体检测的细胞生长分数联合应用有可能更好地预测疗效。
3.细胞凋亡
目前常用的检测细胞凋亡的方法有形态学观察，流式细胞技术，DNA电泳(DNA Ladder)，DNA3’末端标记等，但各种方法的特异性、灵敏度都不是很理想。
细胞凋亡与肿瘤细胞辐射敏感性的关系，一般认为，放射治疗后产生了速发型凋亡的组织，其辐射敏感性相对较高，而迟发型凋亡与辐射敏感性的关系有待进一步研究[6]。组织自发型凋亡与辐射敏感性的关系，报道结果不一致[7，8]。
, 百拇医药
细胞凋亡的另一项应用是评价正常组织的辐射敏感性，从而筛选出对辐射敏感的个体[9]。
4.CB-细胞微核法
原理：微核是由细胞有丝分裂时未进入主核的染色体断片或整条染色体所形成，该法利用松胞素B在一定浓度下可以阻止细胞质分裂而不阻止细胞核分裂的特点，通过双核特征容易分辨出一次丝裂细胞，通过双核细胞中形成的微核数检测辐射敏感性。
特点：该法较为简便、快速，缺点是①高剂量照射易干扰细胞再增殖；②对于某些类型的肿瘤细胞，细胞凋亡也是其主要死亡形式，细胞凋亡的发生大大地影响该方法的正确性。
对于某些类型的组织细胞，该法与细胞集落存活试验有良好的相关性，但是对于另外一些有显著凋亡的组织细胞，基于微核形成和细胞凋亡的总细胞死亡(TCD)分析是更可取的方法[10，11]。
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二、染色体水平
刘新帆等(1997)综述了检测染色体畸变做为肿瘤细胞辐射敏感性指标的研究进展[12]，这里不再重复。
三、DNA分子水平
众所周知，DNA双链是射线所致细胞损伤和死亡的敏感靶分子之一，DNA双链断裂和细胞死亡之间的关系已明确。因而，目前众多的研究都集中在DNA双链断裂及修复的检测上。
较早用于检测DNA双链断裂(dsb)及修复的方法有中性滤膜洗脱法等，由于繁琐、灵敏度差，现在已不用。目前的研究方法有以下几种。
1.脉冲电场凝胶电泳(PSFE)
原理：在特定的电泳条件下，已发生双链断裂的DNA片断在脉冲电场作用下从原点泳动进入凝胶，而更大的DNA分子仍留在原点，不能进入凝胶，根据两部分DNA量来计算DNA双链断裂程度。应用该方法检测dsb及修复，目前较为一致的认识是细胞的修复能力，即DNA双链断裂的重接率与细胞辐射敏感性相关，其敏感性指标为dsb半修复时间。文献报道dsb半修复时间与SF2有明显的相关性[13，14]。
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PSFE法存在的问题有：①电泳装置不同，即使相同类型的装置，其电泳时间，脉冲交替时间等差异较大，而这些参数对DNA双链的泳出有很大的影响。②所需照射剂量仍然偏高，与临床分割放疗剂量相差较大。
2.梯度电压电泳(GVGE)
原理：在一个电压逐步增加的连续电场中，大分子DNA的泳动受到迟滞，而较小DNA分子片断则进一步泳动进入凝胶形成区带。该法的灵敏度为检测小于10 Mbp的DNA片断，而所有哺乳动物的染色体分子量均大于该检测限。该法只需普通电泳仪，无论是灵敏度还是DNA片段检测限，较之于PSFE都有提高[15]。
3.彗星电泳
彗星电泳也叫单细胞凝胶电泳，受照射的细胞与琼脂糖混合，经裂解后电泳，断裂的DNA片断或游离残断泳动出细胞外形成区带，由于单细胞荧光图像形似彗星，故称为“彗星”实验。彗星电泳与其他电泳方法相比较有以下特点：①该法可检测单个细胞DNA损伤(改变裂解液pH值，可检测出DNA单链断裂，DNA双链断裂，DNA超螺旋结构的丧失)，辅以图像分析、计算机处理，可实现定量检测。②所需照射剂量最小可到0.1 Gy。③无须用同位素标记DNA。④电泳时间，裂解细胞时间可在半小时内完成。因此它是一种更快速、灵敏的检测方法，也更适应临床活检标本细胞量少，临床放射治疗分割照射剂量γ射线在2 Gy，快中子在1 Gy左右的实际情况。不足之处是需要较为昂贵的图像处理仪对结果进行定量。
, 百拇医药
目前，该方法的研究仅限于体外培养细胞的研究[16-18]，有待结合临床做进一步的研究。
四、基因水平
基因是细胞生命活动的控制调节中心，现在已知与细胞辐射敏感性有关的基因有：癌基因如ras、raf、c-myc等；细胞凋亡相关基因如p53、bcl-2、bad、bax、bcl-x等。这些基因与辐射敏感性的关系比较复杂，以p53基因为例[19]，同样是基因突变，由于突变位点不同而引起细胞辐射敏感性增加或辐射耐受增加。此外，基因间的相互作用还远未阐明，加之目前检测方法的局限性，基因检测作为肿瘤辐射敏感性的指标还是不太可能。
五、其他
原位缺口平移(ISNIT)技术检测DNA损伤，DNA末端标记技术等也是可能的方法。
, 百拇医药
综上所述，目前看来较为有希望的指标和方法有Tpot法，脉冲电泳或梯度电压电泳、彗星电泳检测DNA双链断裂(损伤)及修复，CB-细胞微核法等。染色体早熟凝集(PCC)加荧光原位杂交(FISH)检测染色体畸变预测肿瘤细胞辐射敏感性也有一定的可靠性，但操作繁琐，不方便临床应用。细胞凋亡和辐射敏感基因的研究，虽然目前看来离实际应用还很远，但学术价值较高。
参考文献
1 West CML,Hendry JH.Intrinsic radiosensitivity as a predictor of patient response to radiotherapy.Radiat Res,1992,52:4453-4457.
2 祝捷，曹世龙，曹晓波，等.人鼻咽癌细胞CNE潜在性倍增时间(Tpot)与其放射后再增殖.中华放射肿瘤学杂志，1996，5：81-84.
, 百拇医药
3 Hlatky L,Hahnfeldt P,Olesiak M.Measurement of potential doubling time for human tumour xenografts using the cytokinesis-block method.Cancer Res,1996,156:1660-1663.
4 Bourhis J.Wilson G,Eschwege F.et al.Potential doubling time and clinical outcome in head and neck squamous cell carcinoma treated with 70Gy in 7 weeks.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1996,35:471-476.
5 Hanstermans K,Begg AC,Ramaekers M,et al.Can measurement of potential doubling time(Tpot)be compared between laboratories? A quality control study.Cytometry,1995,19:154-163.
, 百拇医药
6 Olive PL,Durand RE.Apoptosis:an indicator of radiosensitivity in vitro?Int J Radiat Biol,1997.71:695-707.
7 Levine EL,Renehan A,Gossiel R,et al.Apoptosis,intrinsic radiosensitivity and prediction of radiotherapy response in cervical carcinoma.Radiother Oncol,1995,37:1-9.
8 Wheele JA,Stephens LC,Tornos C,et al.Apoptosis as a predictor of tumour response to radiation in stage IB cervical carcinoma.Int J Radiat Biol Phys,1995,32:1487-1493.
, 百拇医药
9 Ozsahin M,Ozsahin H,Shi Y,et al.Rapid assay of intrinsic radiosensitivity based on apoptosis in human CD4 and CD8 T-lymphocytes.Int J Radiat Biol Phys,1997,38:429-440.
10 Bush C,McMillan TJ.Micronucleus formation in human tumour cells:lack of correlation with radiosesitivity.Br J Cancer,1993,67:102-106.
11 Abend M,Rhein A,Gilbertz KP,et al.Correlation of micronucleus and apoptosis assay with reproductive cell death.Int J Radiat Biol,1995,67:315-326.
, http://www.100md.com
12 刘新帆，殷蔚伯，谷铣之.肿瘤放射敏感性预测PCC+FISH方法.中华放射肿瘤学杂志,1997，6：122-124.
13 Ruiz de Almodovar,Nú
ez JM,McMillan MI.Initial radiation-induced DNA damage in human tumour cell lines:a correlation with intrinsic cellular radiosensitivity.Br J Cancer,1994,69:457-462.14 Wei K,Wandl E,K
rcher KH.X-ray induced DNA double-strand breakage and rejoining in a radiosensitive human renal carcinoma cell line estimated by CHEF electrophoresis.Strahlenther Onkol,1993,169:740-744., http://www.100md.com
15 Zhou PK,Hendry JH,Margison GP.Comparative measurements of radiation-induced DNA double-strand breaks by graded voltage and pulsed-field gel electrophoresis.Int J Radiat Biol,1997,71:95-100.
16 P
ller F,Bauch T,Sauerwein W,et al.Comet assay study of DNA damage and repair of tumour cells following boron neutron capture irradiation with fast d(14)+Be neutrons.Int J Radiat Biol,1996,70:593-602., 百拇医药
17 M
ller WU,Bauch J, Streffer C, et al.Comet assay studies of radiation-induced DNA damage and repair in various tumour cell lines.Int J Radiat Biol,1994,65:315-319.18 王军，陈艳，李艳春，等，中性单细胞凝胶电泳测定DNA双链断裂.中华放射肿瘤学杂志，1996，5：39-42.
19 Blank KR,Rudoltz MS,Kao G D,et al.The moleculation of apoptosis and implications for radiation oncology.Int J Radiat Biol,1997,71:455-466.
(收稿:1998-05-12 修回1998-12-03), http://www.100md.com