重离子照射致人气管上皮细胞突变效应
作者：袁雄 叶常青 路秀琴 张灿哲
单位：袁雄、叶常青 100850 北京放射医学研究所；路秀琴、张灿哲 中国原子能科学研究院核物理研究所
关键词：hprt；突变；重离子；LET；突变截面
中华放射医学与防护杂志/990503 【摘要】 目的 探讨重离子诱发人支气管上皮细胞系的突变效应。方法 用HI-13串列加速器产生的Li、C、F三种离子束以0.5～6.0 Gy设计剂量照射人支气管上皮细胞系突变，观察其突变效应。结果 细胞hprt突变率(MF，无量纲)与重离子剂量(D，Gy)的线性回归方程分别为MF=1.63×10-5D(Li)、MF=8.64×10-5D(C)、MF=1.33×10-5D(F)；与60Co γ射线比较，其相对生物效应依次为1.27、6.78、1.04。此突变率与粒子注量亦呈线性正相关，三种重离子的突变截面(σm，10-4μm2)依次为2.61、41.5、21.3。致突性(σm/σi,10-5)依次为2.08、10.2、2.78。结论 细胞突变率随重离子剂量增大而上升，似有LET依赖性。
, 百拇医药
Mutation of human bronchial epithelial cells induced by heavy ions
YUAN Xiong,YE Changqing,LU Xiuqin,et al.
Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China
【Abstract】 Objective To observe the mutation characteristic of human bronchial epithelial cell line induced by heavy ions. Methods The human bronchial epithelium cell line(BEAS-2B)was irradiated by heavy particle beams of Li,C,and F from an HI-13 tandem accelerator with the designed dose ranging from 0.5Gy～6.0 Gy,and their hprt mutation was analyzed. Results The fitted dose-dependent linear equations for three categories of heavy ions were MF=1.63×10-5D(Li),MF=8.64×10-5D(C)and MF=1.33×10-5D(F) respectively;here the dimension of dose is Gy.The RBEs were 1.27,6.78,and 1.04 for Li,C and F,respectively,compared with γ-ray irradiation.All the frequencies of hprt mutant have also shown positive linearity with fluence. Finally,the cross sections of mutation (σm,10-4μm2) and the mutagenicity(σm/σi,10-5)for Li,C and F,were 2.61,41.5,21.3 and 2.08,10.2,2.78 respectively. Conclusion The frequencies of cell mutation increase with the dose and there seems to be LET-dependence.
, 百拇医药
【Key words】 hprt Mutation Heavy ions LET Cross section mutation
重离子(原子序数大于2的载能负荷粒子)辐射是人类在空间活动中重要的辐射危害因素之一，它对航天员的主要危害是由银河宇宙射线小剂量照射引起的癌症等远后效应以及太阳粒子事件引起的急性辐射损伤效应。细胞被重离子照射后，如果由于各种因素的相互作用逃脱死亡，就有可能因遗传物质的损伤而发生体细胞突变，其后果中最令人关心的是癌变。从这个意义上讲，两者有着密切关系[1]。高LET辐射从总体上说，会比低LET辐射诱导哺乳动物细胞更多的突变。在辐射诱导体细胞突变的研究中，用得最多的筛选性状是对某些化学药物的抗性[2]。本实验利用X染色体连锁的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)位点的变异可以对6-硫代鸟嘌呤(6-TG)表现出抗性的特点，用6-TG筛选经重离子照射后的hprt突变体，并与低LET辐射的效应进行比较。
, 百拇医药
材料和方法
1.细胞：实验用人支气管上皮细胞(BEAS-2B)，购自美国国家组织细胞库(ATCC)，用LHC-8(Biofluids,USA)无血清培养液培养，接种密度约为(1.5～3.0)×103/cm2，每隔2～3天换液，约一星期传代1次。取指数生长期的细胞，用0.25%EDTA-胰蛋白酶联合消化液消化，以1×105/皿密度接种于自制的无菌平皿(φ=30 mm)内，培养24小时后照射。
2.培养皿的制备：在无底玻璃环底边粘上混合胶，平放于2.5 μm厚Mylar膜上，经135℃烤3小时，使膜与玻璃环粘牢，并达到干热灭菌的目的。
3.6-TG：6-TG为Sigma公司产品。用少量5 mol/L浓度的NaOH溶解1 g 6-TG，再用0.9%无菌生理盐水稀释至5 mg/ml的浓度，冰箱保存[3]。临用前，用培养液稀释至所需的工作浓度。
, 百拇医药
4.照射：用中国原子能研究院核物理研究所的HI-13串列加速器所生成的加速带电粒子束(辐射参数详见表1)以法线方向自真空管道透过3 cm×30 cm薄膜窗(厚度0.12 μm)照射培养皿底垂直放置的贴底薄层细胞样本，同时照射5皿。另一孔位用半导体探测器探测相当于细胞层位置受照射的粒子数，用记录的总计数控制每个剂量点所需的照射时间。各组剂量、注量见表2。用60Co γ射线做为低LET参照辐射源，源强为2.6×1015 Bq(北京放射医学研究所)，在距源4米处吸收剂量率为1.04 Gy/min。新收集的BEAS-2B细胞以1×103细胞/瓶接种于25 cm2塑料培养瓶中，分别以0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0Gy剂量进行照射。
表1 三种离子束辐射参数 粒子种类
束流能量
(MeV)
, 百拇医药
细胞受照能量
(MeV)
LET
(keV/μm)
7Li
27.0
22.2
100
12C
68.4
55.2
300
, 百拇医药 19F
75.7
39.7
1 000
表2 各组细胞样品受照射剂量、注量实测值 组序
7Li
12C
19F
剂量
注量
剂量
注量
, http://www.100md.com
剂量
注量
1
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
2
0.36
2.17
0.49
, 百拇医药
1.02
0.89
0.56
3
0.67
4.05
0.93
1.44
1.01
0.63
4
1.91
11.60
, http://www.100md.com
1.78
3.71
2.67
1.67
5
3.31
20.10
3.43
7.51
4.16
2.60
6
6.33
, http://www.100md.com
38.40
4.89
10.10
5.47
3.42
注：剂量单位为Gy，注量单位为106粒子/cm2，每组5皿 5.hprt突变细胞的克隆和筛选：BEAS-2B细胞受照后，以0.25%EDTA-胰蛋白酶联合消化液将其消化接种入皿中培养10～14天，使突变细胞有充分时间表达。在此期间，将细胞传代1次，使细胞密度仍为105/皿。表达结束后，再按105/皿的密度接种于含7.5 μg/ml 6-TG的选择性培养基中，连续培养12～15天。与此同时，测定细胞群体在非选择性培养基内的克隆形成率(SF)。选择结束后，Giemsa染色，把含30个细胞以上的集落称作一个克隆，分别计算各组的失活截面(σi)、突变频率(MF)、突变截面(σm)、致突性(σm/σi)和以60Co γ射线为参考辐射的相对生物效应(RBE)。用线性方程和线性平方方程分别拟合hprt突变率与重离子剂量(或注量)或γ射线剂量的关系。
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结果
1.受照细胞hprt突变频率：正常细胞和TGr突变细胞在14天左右均能生长出大小不等的细胞克隆，照射后的细胞随照射剂量增大细胞克隆数减少，TGr突变细胞增多(见表3)。
表3 不同组受照后的细胞克隆
形成率(SF)和hprt突变频率(MF) 组序
7Li
12C
19F
γ
SF
, 百拇医药
MF
SF
MF
SF
MF
SF
MF
1
1.00
0.00
1.00
0.00
1.00
, 百拇医药 0.00
1.00
0.00
2
0.37
0.86
0.46
3.60
0.67
0.60
0.93
0.62
3
, 百拇医药
0.28
1.68
0.37
7.04
0.43
1.38
0.72
1.18
4
0.17
3.60
0.30
13.80
, 百拇医药
0.32
2.24
0.67
2.80
5
0.06
6.64
0.10
26.80
0.12
4.68
0.29
6.60
, 百拇医药
6
0.01
10.30
0.01
43.00
0.08
7.62
0.17
10.20
注：γ照射组剂量按组序依次为0、0.5、1.0、2.0、4.0和6.0Gy，SF是相对值，以对照组为1.00；表内MF均需乘以10-5，无量纲。表内各数值为5皿平行样的平均值 2.突变细胞频率的量效关系、σm和RBE：经重离子照射的细胞hprt突变频率与粒子注量、剂量成线性正相关(见图1、图2和表4)。而γ射线所致的突变率(MF)与剂量(D，Gy)呈线性平方正相关，其方程是MF=1.28×10-5D+0.056×10-5D2(相关系数r=0.9366)。突变截面、致突性及相对生物效应列于表5。
, 百拇医药
图1 Li、C、F粒子照射后细胞突变频率与粒子注量关系
图2 Li、C、F粒子照射后细胞突变频率与吸收剂量关系
表4 BEAS-2B细胞hprt突变频率(MF)与重离子剂量(D，Gy)
或注量(φ，cm-2)回归方程系数及相关系数 重离子
a(×10-5)
k(×10-12)
r
Li
, 百拇医药
1.63
2.61
0.9928
C
8.64
41.50
0.9971
F
1.33
21.30
0.9761
注：剂量方程MF=aD；注量相关方程MF=kD，相关系数r表5 经重离子照射的BEAS-2B
, 百拇医药
细胞TGr突变的相关参数 重离子
突变截面(σm)
(×10-4μm2)
致突性(σm/σi)
(×10-5)
RBE
Li
2.61
2.08
1.27
, 百拇医药
C
41.50
10.20
6.75
F
21.30
2.78
1.04
讨论
本实验用LET为100～1 000 keV/μm的Li、C、F等三种重离子和γ射线照射BEAS-2B细胞后，证实诱发的hprt基因突变与辐射剂量有一定的相关关系，受照剂量越大的细胞，克隆效率越低，但突变频率越高。细胞hprt基因突变频率与三种重离子的剂量和注量呈线性正相关关系，γ射线引起的细胞突变频率呈正二次函数关系，提示低LET辐射的突变机制可能与高LET的不同。至少在低剂量时，低LET辐射的突变效率明显低于高LET的致突效率，这可能与低LET辐射的局部沉积能量较小、损伤较轻易于被修复有关。
, 百拇医药
辐射诱导的细胞突变与粒子种类、LET等辐射参数有密切关系，本实验Li、C、F等离子辐射导致的hprt突变效应的RBE值分别为1.27、6.75、1.04，因实验的数据有限，尚不能确定最大RBE值时的LET值，但从其趋势来看，出现最大RBE值的LET区间范围应该落在100～200 keV/μm之间[4，5]。Tsuboi[6]等用LET在150～920 keV/μm之间的Fe、Ar、La等离子照射人皮肤成纤维细胞后得出在150 keV/μm时的最大RBE值为5.74。其他文献也有类似结果的报道。但关于人支气管上皮细胞的此类结果尚未见报道。
为比较每单位注量诱发的突变概率，本实验计算Li、C、F三种重离子的突变截面积分别为2.61×10-4、41.5×10-4、21.3×10-4 μm2，致突性分别为2.08×10-5、10.2×10-5、2.78×10-5，显示在较低LET时，随LET增加，致突性增加，在LET较高时，致突性下降。文献报道，对Z≤10的重离子，随着能量增加，突变截面减少，对Z≥26的重离子，随能量增加，突变截面增大，这与重离子的径迹结构是相一致的，因为对高Z的离子，随着能量的增加，其投影区电离密度增加，导致产生较多的突变[7-9]。
, 百拇医药
本课题受国家自然科学基金资助(项目号：39670236)
参考文献
1 Kranert T,Schneider E,Kiefer J.Mutation induction in V79 Chinese hamster cells by very heavy ions.Int J Radiat Biol,1990,58:975-987.
2 Kronenberg A,Gauny S,Criddle K,et al.Heavy ion mutagenesis:linear energy transfer effects and genetic linkage.Radiat Environ Biophys,1995,34:73-79.
3 林帆，宋晓鸥，董奇男，等.化学诱变物的检测.见：李寿祺主编.卫生毒理学基本原理和方法.重庆：四川科学技术出版社，1987.429-432.
, http://www.100md.com
4 Stoll U,Schmidt A,Schneider,et al.Killing and mutation of Chinese hamster V79 cells exposed to accelerated oxygen and neon ions.Radiat Res,1995,142:288-294.
5 Stoll U,Barth B,Scheerer N,et al.hprt mutation in V79 Chinese hamster cells induced by accelerated Ni,Au and Pb ions.Int J Radiat Biol,1996,70:15-22.
6 Tsuboi K,Yang TC,Chen DJ.Charged-particle mutagenesis.Radiat Res,1992,129:171-176.
, http://www.100md.com 7 Weber KJ,Flentje M.Lethality of heavy ion-induced DNA double-strand break in mammalian cells.Int J Radiat Biol,1993,64:169-178.
8 Kozubek S,Horneck G,Krasavin EA,et al.Interpretation of mutation induction by accelerated heavy ions in bacteria.Radiat Res,1995,141:199-203.
9 Good DT.Molecular and cell models of biological effects of heavy ion radiation.Radiat Environ Biophys,1995,34:67-72.
(收稿:1998-10-08 修回1999-04-11), 百拇医药
单位：袁雄、叶常青 100850 北京放射医学研究所；路秀琴、张灿哲 中国原子能科学研究院核物理研究所
关键词：hprt；突变；重离子；LET；突变截面
中华放射医学与防护杂志/990503 【摘要】 目的 探讨重离子诱发人支气管上皮细胞系的突变效应。方法 用HI-13串列加速器产生的Li、C、F三种离子束以0.5～6.0 Gy设计剂量照射人支气管上皮细胞系突变，观察其突变效应。结果 细胞hprt突变率(MF，无量纲)与重离子剂量(D，Gy)的线性回归方程分别为MF=1.63×10-5D(Li)、MF=8.64×10-5D(C)、MF=1.33×10-5D(F)；与60Co γ射线比较，其相对生物效应依次为1.27、6.78、1.04。此突变率与粒子注量亦呈线性正相关，三种重离子的突变截面(σm，10-4μm2)依次为2.61、41.5、21.3。致突性(σm/σi,10-5)依次为2.08、10.2、2.78。结论 细胞突变率随重离子剂量增大而上升，似有LET依赖性。
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Mutation of human bronchial epithelial cells induced by heavy ions
YUAN Xiong,YE Changqing,LU Xiuqin,et al.
Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China
【Abstract】 Objective To observe the mutation characteristic of human bronchial epithelial cell line induced by heavy ions. Methods The human bronchial epithelium cell line(BEAS-2B)was irradiated by heavy particle beams of Li,C,and F from an HI-13 tandem accelerator with the designed dose ranging from 0.5Gy～6.0 Gy,and their hprt mutation was analyzed. Results The fitted dose-dependent linear equations for three categories of heavy ions were MF=1.63×10-5D(Li),MF=8.64×10-5D(C)and MF=1.33×10-5D(F) respectively;here the dimension of dose is Gy.The RBEs were 1.27,6.78,and 1.04 for Li,C and F,respectively,compared with γ-ray irradiation.All the frequencies of hprt mutant have also shown positive linearity with fluence. Finally,the cross sections of mutation (σm,10-4μm2) and the mutagenicity(σm/σi,10-5)for Li,C and F,were 2.61,41.5,21.3 and 2.08,10.2,2.78 respectively. Conclusion The frequencies of cell mutation increase with the dose and there seems to be LET-dependence.
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【Key words】 hprt Mutation Heavy ions LET Cross section mutation
重离子(原子序数大于2的载能负荷粒子)辐射是人类在空间活动中重要的辐射危害因素之一，它对航天员的主要危害是由银河宇宙射线小剂量照射引起的癌症等远后效应以及太阳粒子事件引起的急性辐射损伤效应。细胞被重离子照射后，如果由于各种因素的相互作用逃脱死亡，就有可能因遗传物质的损伤而发生体细胞突变，其后果中最令人关心的是癌变。从这个意义上讲，两者有着密切关系[1]。高LET辐射从总体上说，会比低LET辐射诱导哺乳动物细胞更多的突变。在辐射诱导体细胞突变的研究中，用得最多的筛选性状是对某些化学药物的抗性[2]。本实验利用X染色体连锁的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)位点的变异可以对6-硫代鸟嘌呤(6-TG)表现出抗性的特点，用6-TG筛选经重离子照射后的hprt突变体，并与低LET辐射的效应进行比较。
, 百拇医药
材料和方法
1.细胞：实验用人支气管上皮细胞(BEAS-2B)，购自美国国家组织细胞库(ATCC)，用LHC-8(Biofluids,USA)无血清培养液培养，接种密度约为(1.5～3.0)×103/cm2，每隔2～3天换液，约一星期传代1次。取指数生长期的细胞，用0.25%EDTA-胰蛋白酶联合消化液消化，以1×105/皿密度接种于自制的无菌平皿(φ=30 mm)内，培养24小时后照射。
2.培养皿的制备：在无底玻璃环底边粘上混合胶，平放于2.5 μm厚Mylar膜上，经135℃烤3小时，使膜与玻璃环粘牢，并达到干热灭菌的目的。
3.6-TG：6-TG为Sigma公司产品。用少量5 mol/L浓度的NaOH溶解1 g 6-TG，再用0.9%无菌生理盐水稀释至5 mg/ml的浓度，冰箱保存[3]。临用前，用培养液稀释至所需的工作浓度。
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4.照射：用中国原子能研究院核物理研究所的HI-13串列加速器所生成的加速带电粒子束(辐射参数详见表1)以法线方向自真空管道透过3 cm×30 cm薄膜窗(厚度0.12 μm)照射培养皿底垂直放置的贴底薄层细胞样本，同时照射5皿。另一孔位用半导体探测器探测相当于细胞层位置受照射的粒子数，用记录的总计数控制每个剂量点所需的照射时间。各组剂量、注量见表2。用60Co γ射线做为低LET参照辐射源，源强为2.6×1015 Bq(北京放射医学研究所)，在距源4米处吸收剂量率为1.04 Gy/min。新收集的BEAS-2B细胞以1×103细胞/瓶接种于25 cm2塑料培养瓶中，分别以0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0Gy剂量进行照射。
表1 三种离子束辐射参数 粒子种类
束流能量
(MeV)
, 百拇医药
细胞受照能量
(MeV)
LET
(keV/μm)
7Li
27.0
22.2
100
12C
68.4
55.2
300
, 百拇医药 19F
75.7
39.7
1 000
表2 各组细胞样品受照射剂量、注量实测值 组序
7Li
12C
19F
剂量
注量
剂量
注量
, http://www.100md.com
剂量
注量
1
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
2
0.36
2.17
0.49
, 百拇医药
1.02
0.89
0.56
3
0.67
4.05
0.93
1.44
1.01
0.63
4
1.91
11.60
, http://www.100md.com
1.78
3.71
2.67
1.67
5
3.31
20.10
3.43
7.51
4.16
2.60
6
6.33
, http://www.100md.com
38.40
4.89
10.10
5.47
3.42
注：剂量单位为Gy，注量单位为106粒子/cm2，每组5皿 5.hprt突变细胞的克隆和筛选：BEAS-2B细胞受照后，以0.25%EDTA-胰蛋白酶联合消化液将其消化接种入皿中培养10～14天，使突变细胞有充分时间表达。在此期间，将细胞传代1次，使细胞密度仍为105/皿。表达结束后，再按105/皿的密度接种于含7.5 μg/ml 6-TG的选择性培养基中，连续培养12～15天。与此同时，测定细胞群体在非选择性培养基内的克隆形成率(SF)。选择结束后，Giemsa染色，把含30个细胞以上的集落称作一个克隆，分别计算各组的失活截面(σi)、突变频率(MF)、突变截面(σm)、致突性(σm/σi)和以60Co γ射线为参考辐射的相对生物效应(RBE)。用线性方程和线性平方方程分别拟合hprt突变率与重离子剂量(或注量)或γ射线剂量的关系。
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结果
1.受照细胞hprt突变频率：正常细胞和TGr突变细胞在14天左右均能生长出大小不等的细胞克隆，照射后的细胞随照射剂量增大细胞克隆数减少，TGr突变细胞增多(见表3)。
表3 不同组受照后的细胞克隆
形成率(SF)和hprt突变频率(MF) 组序
7Li
12C
19F
γ
SF
, 百拇医药
MF
SF
MF
SF
MF
SF
MF
1
1.00
0.00
1.00
0.00
1.00
, 百拇医药 0.00
1.00
0.00
2
0.37
0.86
0.46
3.60
0.67
0.60
0.93
0.62
3
, 百拇医药
0.28
1.68
0.37
7.04
0.43
1.38
0.72
1.18
4
0.17
3.60
0.30
13.80
, 百拇医药
0.32
2.24
0.67
2.80
5
0.06
6.64
0.10
26.80
0.12
4.68
0.29
6.60
, 百拇医药
6
0.01
10.30
0.01
43.00
0.08
7.62
0.17
10.20
注：γ照射组剂量按组序依次为0、0.5、1.0、2.0、4.0和6.0Gy，SF是相对值，以对照组为1.00；表内MF均需乘以10-5，无量纲。表内各数值为5皿平行样的平均值 2.突变细胞频率的量效关系、σm和RBE：经重离子照射的细胞hprt突变频率与粒子注量、剂量成线性正相关(见图1、图2和表4)。而γ射线所致的突变率(MF)与剂量(D，Gy)呈线性平方正相关，其方程是MF=1.28×10-5D+0.056×10-5D2(相关系数r=0.9366)。突变截面、致突性及相对生物效应列于表5。
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图1 Li、C、F粒子照射后细胞突变频率与粒子注量关系
图2 Li、C、F粒子照射后细胞突变频率与吸收剂量关系
表4 BEAS-2B细胞hprt突变频率(MF)与重离子剂量(D，Gy)
或注量(φ，cm-2)回归方程系数及相关系数 重离子
a(×10-5)
k(×10-12)
r
Li
, 百拇医药
1.63
2.61
0.9928
C
8.64
41.50
0.9971
F
1.33
21.30
0.9761
注：剂量方程MF=aD；注量相关方程MF=kD，相关系数r表5 经重离子照射的BEAS-2B
, 百拇医药
细胞TGr突变的相关参数 重离子
突变截面(σm)
(×10-4μm2)
致突性(σm/σi)
(×10-5)
RBE
Li
2.61
2.08
1.27
, 百拇医药
C
41.50
10.20
6.75
F
21.30
2.78
1.04
讨论
本实验用LET为100～1 000 keV/μm的Li、C、F等三种重离子和γ射线照射BEAS-2B细胞后，证实诱发的hprt基因突变与辐射剂量有一定的相关关系，受照剂量越大的细胞，克隆效率越低，但突变频率越高。细胞hprt基因突变频率与三种重离子的剂量和注量呈线性正相关关系，γ射线引起的细胞突变频率呈正二次函数关系，提示低LET辐射的突变机制可能与高LET的不同。至少在低剂量时，低LET辐射的突变效率明显低于高LET的致突效率，这可能与低LET辐射的局部沉积能量较小、损伤较轻易于被修复有关。
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辐射诱导的细胞突变与粒子种类、LET等辐射参数有密切关系，本实验Li、C、F等离子辐射导致的hprt突变效应的RBE值分别为1.27、6.75、1.04，因实验的数据有限，尚不能确定最大RBE值时的LET值，但从其趋势来看，出现最大RBE值的LET区间范围应该落在100～200 keV/μm之间[4，5]。Tsuboi[6]等用LET在150～920 keV/μm之间的Fe、Ar、La等离子照射人皮肤成纤维细胞后得出在150 keV/μm时的最大RBE值为5.74。其他文献也有类似结果的报道。但关于人支气管上皮细胞的此类结果尚未见报道。
为比较每单位注量诱发的突变概率，本实验计算Li、C、F三种重离子的突变截面积分别为2.61×10-4、41.5×10-4、21.3×10-4 μm2，致突性分别为2.08×10-5、10.2×10-5、2.78×10-5，显示在较低LET时，随LET增加，致突性增加，在LET较高时，致突性下降。文献报道，对Z≤10的重离子，随着能量增加，突变截面减少，对Z≥26的重离子，随能量增加，突变截面增大，这与重离子的径迹结构是相一致的，因为对高Z的离子，随着能量的增加，其投影区电离密度增加，导致产生较多的突变[7-9]。
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本课题受国家自然科学基金资助(项目号：39670236)
参考文献
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(收稿:1998-10-08 修回1999-04-11), 百拇医药