大剂量γ射线照射后小鼠脾脏淋巴细胞凋亡的病理形态学观察
作者：高临路 崔玉芳 杨红 夏国伟 彭瑞云 高亚兵 王德文
单位：100850 北京，军事医学科学院放射医学研究所
关键词：脾脏淋巴细胞；辐射；病理形态学；凋亡
中华放射医学与防护杂志000508 【摘要】 目的 探讨大剂量60Co γ射线照射后脾脏淋巴细胞的病理形态学改变。方法 小鼠经6、9、12、15及20 Gy γ射线照射，于照后8个不同时间点活杀取材进行光镜及电镜观察。结果照射后脾淋巴细胞凋亡的发生高峰与照射剂量和照后时间有关，淋巴细胞数量显著减少。结论 照射后脾脏淋巴细胞凋亡的病理形态变化有明显的分期，而在不同剂量组中细胞的死亡方式是有区别的。
Pathomorphology of spleen lymphocyte apoptosis in large dose 60Co γ-irradiated mice.
, 百拇医药
GAO Linlu,CUI Yufang,YANG Hong,et al.
(Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850,China)
【Abstract】 Objective The aim of this study was to investigate the pathomorphological changes of spleen lymphocyte apoptosis after 60Co γ-irradiation. Methods The mice were irradiated with 6,9,12,15 and 20 Gy of 60Co γ-rays. At different times after irradiation,the mice were sacrificed and the pathological changes of spleen lymphocyte were observed by light and transmission electron microscopies. Results Spleen lymphocyte decreased evidently and the peak of apoptosis in spleen lymphocyte was dependent on radiation dose and the time after irradiation. Conclusion After γ-irradiation with large doses,pathological changes of spleen lymphocyte apoptosis in mice can be divided into obviously different stages. The main causes of death of spleen lymphocytes are different in different dose groups.
, 百拇医药
【Key words】 Radiation； Spleen lymphocyte； Pathomorphology； Apoptosis
脾脏对辐射高度敏感，在小鼠中又兼具造血及免疫两种功能。已有研究证实，外源性γ射线照射可诱发细胞凋亡并出现免疫功能的抑制[1，2]。以往的研究均集中于中、小剂量照射后脾脏的改变[3，4]。而大剂量照射后脾脏的病理形态学改变特别是细胞凋亡特征于国内文献中未见报道。本实验拟观察大剂量60Co γ射线照射后脾脏组织和淋巴细胞凋亡的形态学改变。
材料和方法
1.分组与照射：选用本院实验动物中心提供的二级动物C57小鼠280只。体重(20±1)g，随机分为6组，经6、9、12、15和20 Gy 60Co γ射线一次性全身照射。动物距源4 m。
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2.取材与观察：照后3 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d和28 d活杀小鼠取脾脏，常规制作石蜡切片观察。另取部分脾脏组织制作半薄切片，经光镜观察定位后制作超薄切片透射电镜下观察。
结 果
1.宏观所见：对照组小鼠脾脏体积平均为1.2 cm×0.4 cm×0.3 cm，照后6 h，体积缩小至0.7 cm×0.3 cm×0.2 cm，照后3 d为0.5 cm×0.2 cm×0.2 cm。脾包膜完整，切面红褐色，有少量液体溢出。
2.光镜观察
(1)对照组：白髓及边缘区内见到个别散在的凋亡细胞，余未见异常。
(2)照射组：①照射后3 h各组动物脾组织结构尚完整，白髓及边缘区内出现较多呈散在或灶状分布的凋亡细胞，凋亡淋巴细胞的形态以胞核浓集或浓集于四周较多见。淋巴细胞数量减少，随剂量增加其减少愈加明显，造血细胞核轻度畸形。②照射后6 h淋巴细胞凋亡达高峰，呈弥漫状或大片状分布。凋亡细胞形态各异。脾脏组织中各期凋亡细胞形态均可见到(图1)。边缘区内粒细胞相对增多，红细胞弥漫渗出到全脾脏实质中。上述现象随照射剂量增加而加重。尤其在15 Gy及20 Gy剂量组中，淋巴细胞减少更加明显。因实质成分减少间质成分相对增多，边缘区偶见造血细胞，血窦及血管充血、瘀血。③12～24 h脾脏淋巴细胞及凋亡的淋巴细胞数量更加减少，呈小灶状或点状分布，形态以胞核浓集于中心及出现较多的凋亡小体为主。大剂量组造血细胞几近消失，粒细胞相对增多。15 Gy、20 Gy组，白髓区中央动脉周围仅有少量残留的淋巴细胞，间质中广泛弥漫出血。④3～7 d脾组织中无明显凋亡的淋巴细胞。残存淋巴细胞散布于红髓中，粒细胞消失，血管、血窦扩张，照射后7 d，无法观察到正常的脾结构。9 Gy组有片状组织坏死，并有细菌性败血症，间质弥漫出血。⑤14～28 d脾脏组织结构开始恢复。分布于白髓及边缘区再生活跃的淋巴细胞体积较大，较幼稚，数量显著增多并与时间递增呈正比。沿脾脏被膜及红髓髓索处出现各类新生造血细胞灶，髓外造血较丰富。边缘区可见“巨核细胞”。
, 百拇医药
图1 照射后6 h，脾组织中可见许多
凋亡的淋巴细胞 HE×1000
3.电镜观察结果
(1)对照组：可见到较多大、小淋巴细胞。大淋巴细胞核常染色质较多，细胞器丰富。小淋巴细胞核圆形并呈浓密的团块状，除游离核糖体较多外，其余细胞器均较少。
(2)照射组：①照射后6 h可见大量凋亡的淋巴细胞，细胞体积变小，表面微绒毛消失，细胞核核膜完整，核仁崩解，染色质密集。少量胞核染色质呈戒指状、半月形(图2)，多量为核浓集。部分细胞的核碎片和胞浆成分形成凋亡小体。凋亡细胞周围多个巨噬细胞吞噬已凋亡的淋巴细胞。在6～12 Gy组中，随着剂量增加，凋亡的淋巴细胞数量增加，巨噬细胞吞噬现象也明显增多。②12～24 h有典型凋亡形态的淋巴细胞减少，吞噬细胞数量显著增多，每个吞噬细胞中均可见到3～10个凋亡的淋巴细胞或细胞碎片，部分线粒体，高尔基体及内质网成空泡状。但细胞器膜仍完整。少数细胞核已消失，但可见到细胞器残留。在大剂量组中坏死细胞增多。上述现象随照射剂量增加而加重。③照射后3 d，凋亡的淋巴细胞已难见到。
, 百拇医药
图2 照射后电镜下可见典型的半月形
核的凋亡淋巴细胞 TEM×17000
讨 论
在急性放射病中，造血及免疫系统的损伤最重。本实验试图阐明经大剂量60Co γ射线照射后脾脏淋巴细胞死亡的特点及规律。由上可知，小鼠脾脏经不同剂量60Co γ射线照射后，脾脏淋巴细胞改变具有明显分期：①淋巴细胞凋亡发生和清除期(照后3～24 h)，此期中淋巴细胞开始出现凋亡，照后6 h细胞凋亡达高峰。淋巴细胞数量急剧减少。吞噬细胞吞噬现象明显，吞噬现象12 h达高峰。因吞噬细胞及血流作用，凋亡的淋巴细胞被迅速清除。②淋巴细胞枯竭期(24 h～7 d)脾脏正常结构消失，仅于白髓及边缘区见到少量残存的淋巴细胞，淋巴细胞基本枯竭。大剂量组更为明显。③淋巴细胞再生期(7～14 d)，小鼠若能度过第2期(<12 Gy)，淋巴细胞则开始再生。再生的淋巴细胞位于白髓及边缘区内。增生的淋巴细胞数量随时间延长明显增多，但形态仍较幼稚。④淋巴细胞早期恢复期(>28 d)此期内淋巴细胞显著增加，脾组织结构趋于恢复，但淋巴细胞数量低于照射前。
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已有研究证实，经中、小剂量60Co γ射线照射后小鼠脾细胞含量显著减少[5]。本实验显示，当照射剂量介于6～12 Gy之间时，细胞凋亡随照射剂量增加而增加。但当剂量大于15 Gy时，凋亡细胞的数量不但未见增加，部分区域甚至减少，淋巴细胞凋亡的数量与照射剂量之间无明显剂量效应关系。上述结果经电镜观察证实，<12 Gy照射后，脾脏淋巴细胞急剧减少主要由凋亡引起，坏死细胞较少。由此可推测，经6～12 Gy 60Co γ射线照射后脾脏淋巴细胞的死亡方式主要以凋亡为主。>15 Gy照射后，坏死细胞数量增加，凋亡细胞比例减少，因而凋亡和坏死均为大剂量照射后淋巴细胞的死亡方式。
参考文献
1，童新，孙志贤.辐射所致程序性细胞死亡的机制.国外医学分子生物学分册，1995，17：131-133.
2，刘宏伟，刘树铮.单次X线全身照射后小鼠免疫学参数的剂量效应关系.中华放射医学与防护杂志，1990，10：85-89.
3，崔玉芳，高亚兵，杨红，等.小鼠胸腺淋巴细胞辐射损伤特点和机理研究.中国体视学与图像分析，1998，3：208-213.
4，崔玉芳，杨红，高亚兵，等.小鼠脾淋巴细胞辐射死亡与凋亡之间的关系.辐射研究与辐射工艺学报，1999，17(2)：1-6.
5，李予蓉，韩苇，任冬青.不同剂量60Co γ射线照射对小鼠脾细胞DNA含量的影响.中华放射医学与防护杂志，1994，4：387-390.
(收稿日期:1999-12-15), http://www.100md.com
单位：100850 北京，军事医学科学院放射医学研究所
关键词：脾脏淋巴细胞；辐射；病理形态学；凋亡
中华放射医学与防护杂志000508 【摘要】 目的 探讨大剂量60Co γ射线照射后脾脏淋巴细胞的病理形态学改变。方法 小鼠经6、9、12、15及20 Gy γ射线照射，于照后8个不同时间点活杀取材进行光镜及电镜观察。结果照射后脾淋巴细胞凋亡的发生高峰与照射剂量和照后时间有关，淋巴细胞数量显著减少。结论 照射后脾脏淋巴细胞凋亡的病理形态变化有明显的分期，而在不同剂量组中细胞的死亡方式是有区别的。
Pathomorphology of spleen lymphocyte apoptosis in large dose 60Co γ-irradiated mice.
, 百拇医药
GAO Linlu,CUI Yufang,YANG Hong,et al.
(Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850,China)
【Abstract】 Objective The aim of this study was to investigate the pathomorphological changes of spleen lymphocyte apoptosis after 60Co γ-irradiation. Methods The mice were irradiated with 6,9,12,15 and 20 Gy of 60Co γ-rays. At different times after irradiation,the mice were sacrificed and the pathological changes of spleen lymphocyte were observed by light and transmission electron microscopies. Results Spleen lymphocyte decreased evidently and the peak of apoptosis in spleen lymphocyte was dependent on radiation dose and the time after irradiation. Conclusion After γ-irradiation with large doses,pathological changes of spleen lymphocyte apoptosis in mice can be divided into obviously different stages. The main causes of death of spleen lymphocytes are different in different dose groups.
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【Key words】 Radiation； Spleen lymphocyte； Pathomorphology； Apoptosis
脾脏对辐射高度敏感，在小鼠中又兼具造血及免疫两种功能。已有研究证实，外源性γ射线照射可诱发细胞凋亡并出现免疫功能的抑制[1，2]。以往的研究均集中于中、小剂量照射后脾脏的改变[3，4]。而大剂量照射后脾脏的病理形态学改变特别是细胞凋亡特征于国内文献中未见报道。本实验拟观察大剂量60Co γ射线照射后脾脏组织和淋巴细胞凋亡的形态学改变。
材料和方法
1.分组与照射：选用本院实验动物中心提供的二级动物C57小鼠280只。体重(20±1)g，随机分为6组，经6、9、12、15和20 Gy 60Co γ射线一次性全身照射。动物距源4 m。
, http://www.100md.com
2.取材与观察：照后3 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d和28 d活杀小鼠取脾脏，常规制作石蜡切片观察。另取部分脾脏组织制作半薄切片，经光镜观察定位后制作超薄切片透射电镜下观察。
结 果
1.宏观所见：对照组小鼠脾脏体积平均为1.2 cm×0.4 cm×0.3 cm，照后6 h，体积缩小至0.7 cm×0.3 cm×0.2 cm，照后3 d为0.5 cm×0.2 cm×0.2 cm。脾包膜完整，切面红褐色，有少量液体溢出。
2.光镜观察
(1)对照组：白髓及边缘区内见到个别散在的凋亡细胞，余未见异常。
(2)照射组：①照射后3 h各组动物脾组织结构尚完整，白髓及边缘区内出现较多呈散在或灶状分布的凋亡细胞，凋亡淋巴细胞的形态以胞核浓集或浓集于四周较多见。淋巴细胞数量减少，随剂量增加其减少愈加明显，造血细胞核轻度畸形。②照射后6 h淋巴细胞凋亡达高峰，呈弥漫状或大片状分布。凋亡细胞形态各异。脾脏组织中各期凋亡细胞形态均可见到(图1)。边缘区内粒细胞相对增多，红细胞弥漫渗出到全脾脏实质中。上述现象随照射剂量增加而加重。尤其在15 Gy及20 Gy剂量组中，淋巴细胞减少更加明显。因实质成分减少间质成分相对增多，边缘区偶见造血细胞，血窦及血管充血、瘀血。③12～24 h脾脏淋巴细胞及凋亡的淋巴细胞数量更加减少，呈小灶状或点状分布，形态以胞核浓集于中心及出现较多的凋亡小体为主。大剂量组造血细胞几近消失，粒细胞相对增多。15 Gy、20 Gy组，白髓区中央动脉周围仅有少量残留的淋巴细胞，间质中广泛弥漫出血。④3～7 d脾组织中无明显凋亡的淋巴细胞。残存淋巴细胞散布于红髓中，粒细胞消失，血管、血窦扩张，照射后7 d，无法观察到正常的脾结构。9 Gy组有片状组织坏死，并有细菌性败血症，间质弥漫出血。⑤14～28 d脾脏组织结构开始恢复。分布于白髓及边缘区再生活跃的淋巴细胞体积较大，较幼稚，数量显著增多并与时间递增呈正比。沿脾脏被膜及红髓髓索处出现各类新生造血细胞灶，髓外造血较丰富。边缘区可见“巨核细胞”。
, 百拇医药
图1 照射后6 h，脾组织中可见许多
凋亡的淋巴细胞 HE×1000
3.电镜观察结果
(1)对照组：可见到较多大、小淋巴细胞。大淋巴细胞核常染色质较多，细胞器丰富。小淋巴细胞核圆形并呈浓密的团块状，除游离核糖体较多外，其余细胞器均较少。
(2)照射组：①照射后6 h可见大量凋亡的淋巴细胞，细胞体积变小，表面微绒毛消失，细胞核核膜完整，核仁崩解，染色质密集。少量胞核染色质呈戒指状、半月形(图2)，多量为核浓集。部分细胞的核碎片和胞浆成分形成凋亡小体。凋亡细胞周围多个巨噬细胞吞噬已凋亡的淋巴细胞。在6～12 Gy组中，随着剂量增加，凋亡的淋巴细胞数量增加，巨噬细胞吞噬现象也明显增多。②12～24 h有典型凋亡形态的淋巴细胞减少，吞噬细胞数量显著增多，每个吞噬细胞中均可见到3～10个凋亡的淋巴细胞或细胞碎片，部分线粒体，高尔基体及内质网成空泡状。但细胞器膜仍完整。少数细胞核已消失，但可见到细胞器残留。在大剂量组中坏死细胞增多。上述现象随照射剂量增加而加重。③照射后3 d，凋亡的淋巴细胞已难见到。
, 百拇医药
图2 照射后电镜下可见典型的半月形
核的凋亡淋巴细胞 TEM×17000
讨 论
在急性放射病中，造血及免疫系统的损伤最重。本实验试图阐明经大剂量60Co γ射线照射后脾脏淋巴细胞死亡的特点及规律。由上可知，小鼠脾脏经不同剂量60Co γ射线照射后，脾脏淋巴细胞改变具有明显分期：①淋巴细胞凋亡发生和清除期(照后3～24 h)，此期中淋巴细胞开始出现凋亡，照后6 h细胞凋亡达高峰。淋巴细胞数量急剧减少。吞噬细胞吞噬现象明显，吞噬现象12 h达高峰。因吞噬细胞及血流作用，凋亡的淋巴细胞被迅速清除。②淋巴细胞枯竭期(24 h～7 d)脾脏正常结构消失，仅于白髓及边缘区见到少量残存的淋巴细胞，淋巴细胞基本枯竭。大剂量组更为明显。③淋巴细胞再生期(7～14 d)，小鼠若能度过第2期(<12 Gy)，淋巴细胞则开始再生。再生的淋巴细胞位于白髓及边缘区内。增生的淋巴细胞数量随时间延长明显增多，但形态仍较幼稚。④淋巴细胞早期恢复期(>28 d)此期内淋巴细胞显著增加，脾组织结构趋于恢复，但淋巴细胞数量低于照射前。
, http://www.100md.com
已有研究证实，经中、小剂量60Co γ射线照射后小鼠脾细胞含量显著减少[5]。本实验显示，当照射剂量介于6～12 Gy之间时，细胞凋亡随照射剂量增加而增加。但当剂量大于15 Gy时，凋亡细胞的数量不但未见增加，部分区域甚至减少，淋巴细胞凋亡的数量与照射剂量之间无明显剂量效应关系。上述结果经电镜观察证实，<12 Gy照射后，脾脏淋巴细胞急剧减少主要由凋亡引起，坏死细胞较少。由此可推测，经6～12 Gy 60Co γ射线照射后脾脏淋巴细胞的死亡方式主要以凋亡为主。>15 Gy照射后，坏死细胞数量增加，凋亡细胞比例减少，因而凋亡和坏死均为大剂量照射后淋巴细胞的死亡方式。
参考文献
1，童新，孙志贤.辐射所致程序性细胞死亡的机制.国外医学分子生物学分册，1995，17：131-133.
2，刘宏伟，刘树铮.单次X线全身照射后小鼠免疫学参数的剂量效应关系.中华放射医学与防护杂志，1990，10：85-89.
3，崔玉芳，高亚兵，杨红，等.小鼠胸腺淋巴细胞辐射损伤特点和机理研究.中国体视学与图像分析，1998，3：208-213.
4，崔玉芳，杨红，高亚兵，等.小鼠脾淋巴细胞辐射死亡与凋亡之间的关系.辐射研究与辐射工艺学报，1999，17(2)：1-6.
5，李予蓉，韩苇，任冬青.不同剂量60Co γ射线照射对小鼠脾细胞DNA含量的影响.中华放射医学与防护杂志，1994，4：387-390.
(收稿日期:1999-12-15), http://www.100md.com