妊高征患者血小板蛋白激酶C活性变化的研究
作者：尚涛 乔宠
单位：110003 沈阳，中国医科大学附属第二临床学院妇产科
关键词：妊娠并发症；心血管；高血压；血小板；蛋白激酶C
中华妇产科杂志980402 【摘要】 目的 探讨血小板蛋白激酶C(PKC)比活变化与妊高征发生和发展的关系。方法 用底物蛋白磷酸化法检测18例妊高征患者(妊高征组)，20例健康孕妇(正常妊娠组)及20例健康育龄妇女(对照组)血小板质膜和胞液的PKC比活。结果 正常妊娠组血小板质膜和胞液的PKC比活显著低于对照组(P<0.01)；妊高征组血小板质膜和胞液的PKC比活高于正常妊娠组(P<0.05)。中、轻度妊高征患者仅血小板质膜PKC比活明显高于正常妊娠组(P<0.01)，胞液的PKC比活与正常妊娠组比较，则差异无显著性(P>0.05)。而重度妊高征患者血小板质膜和胞液的PKC比活均高于正常妊娠组(P<0.01，P<0.05)，且重度妊高征患者血小板胞液PKC比活高于中、轻度妊高征患者(P<0.05)，而质膜PKC比活比较，则差异无显著性(P>0.05)。结论 血小板PKC比活变化与妊高征发生和发展有关。
, 百拇医药
Study on the Activity of Platelets Protein Kinase C in Patients with Pregnancy Induced Hypertension Shang Tao,Qiao Chong. Second Affiliated Hospital , China Medical University, Shenyang, 110003
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the activity of protein kinase C(PKC) in plateletes and patients with pregnancy induced hypertension (PIH). Method Activities of PKC in membrane of platelets, which came from 18 PIH pateints(PIH group), 20 normal pregnant women (normal pregnant group) and 20 healthy women (control group) , were measured by substrate protein phosphoylation method. Results Activities of PKC in the membrane and cytosolic of platelets from normal pregnancie are lower than those from control group significantly (P<0.01). Activities of PKC in the membrane and cytosolic of plaelets from PIH group are higher than those from normal pregnancie (P<0.05). Activity of PKC in membrane of platelets from mild and moderate PIH group is higer than that from normal pregnancie (P<0.01) . However , there is no difference between the activites of PKC in cytosolic of platelets from the two groups (P>0.05). Activities of PKC in membrane and cytosolic of platelets from severe PIH were higher than those from normal pregnancie significantly(P<0.01,P<0.05). We also found that the activity of PKC in cytosolic of platelets from severe PIH group was significantly higher than that from mild and PIH cases, though there was no significantly difference in the activity of PKC in membrane of platelets between the two groups. Conclusion Activity of PKC in platelets relates to the occurrence and development of PIH syndrome.
, 百拇医药
【Key word】 Pregnancy complications, cardiovascular Hypertension Blood platelets Protein kinase C
妊高征是妊娠晚期发生的严重威胁母儿安全的疾病，至今其病因和致病机理仍无定论。动物实验及临床研究表明，血小板蛋白激酶C(PKC)介导平滑肌尤其是血管平滑肌的舒缩调节[1]，而血小板活化机制与平滑肌的调节有相似之处。我们拟通过检测妊高征及正常孕妇和健康育龄妇女血小板PKC比活，探讨血小板PKC比活的变化与妊高征的关系。
资料与方法
一、研究对象
1.妊高征组：共18例。年龄23～34岁，平均27.9±3.7岁，孕周36周+2～41周，平均为38.2±1.7周。并按郑怀美主编的全国统编教材《妇产科学》第3版提出的关于妊高征的诊断及分类标准分为中、轻度及重度妊高征，各9例 。
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2.正常妊娠组：共20例，均为随机选取的与妊高征患者同期分娩的正常健康孕妇，年龄23～34岁，平均为27.5±3.7岁，孕周37周+5～42周。
3.对照组：共20例 ，为健康育龄妇女，年龄23～34岁，平均29.7±3.9岁。
二、 研究方法
1. 血样采集：孕妇于剖宫产当日、献血员于献血日，清晨空腹抽取肘静脉血5 ml，装入50mmol/L EDTA Na2 0.5ml一次性试管中，封闭管口，反转3次，使其混匀，迅速放入冰水浴中，并于4℃下800 rpm离心10分钟(Sorvall RC 5C型高速恒温离心机,美国杜邦公司生产),吸取上清,制成富血小板血浆(PRP)，计数血小板数，调制成1×109/ml，封住管口，置于-20℃保存备处理及测定。
, http://www.100md.com 2. 样本处理：在冰水浴中，将PRP于4℃ 4000rpm离心30分钟，弃上清，于沉淀中加入缓冲液A 1 ml，超声粉碎20秒/次，共5次(cps-1型超声粉碎机，上海超声仪器厂生产)，再于4℃ 18 000 rpm离心2小时，吸取上清，存于4℃备测定。沉淀中加入1% Triton-1001ml，超声粉碎步骤同前，4°C过夜后，4°C 18000rpm离心2小时后吸取上清，保存于4℃备测定。
3. PKC比活测定：药品：Ⅲ-S组蛋白，甘油二酯，磷脂酰丝氨酸，三磷酸腺苷，均购自Sigma公司，(γ-32P)ATP购自福瑞公司。蛋白定量：Lowry法。PKC比活测定：底物蛋白磷酸化法。
三、 统计学处理：数据统计处理均在AST/486计算机SAS软件上进行，t或t′检验。测定结果用均值±标准差(
±s)表示。
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结果
正常妊娠组血小板质膜和胞液PKC比活显著低于对照组(P<0.01)。妊高征组血小板质膜和胞液PKC比活显著高于正常妊娠组(P<0.05)。中、轻度妊高征患者血小板质膜PKC比活显著高于正常妊娠组(P<0.01)，胞液差异无显著性(P<0.05)；但重度妊高征患者血小板质膜和胞液PKC比活性均显著高于正常妊娠组(P<0.01，P<0.05)，且重度妊高征患者血小板胞液PKC比活显著高于中、轻度妊高征患者(P<0.05)，而质膜PKC比活差异无显著性(P<0.05)，见附表。
附表 各组PKC比活(pmol*min-1/mg protein,±s) 组别
例数
PKC比活
, 百拇医药
质膜
胞液
正常妊娠组
20
29.29±23.00
2.59±1.54
对照组
20
133.19±78.15
4.41±1.22
妊高征组
18
58.73±40.04
, 百拇医药
6.0±6.63
中、轻度
9
68.50±54.40
2.91±1.66
重度
9
48.94±15.24
6.18±3.71
讨论
一、妊娠期血小板PKC比活变化
PKC是依赖Ca++/磷脂的丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶，至今人们对PKC进行了大量实验研究，发现它普遍存在于真核细胞中，尤其是哺乳类动物细胞中，参与多种生命活动，如激素分泌、神经递质释放、心肌收缩等[2]，尤其是血管平滑肌收缩。PKC通常以无活性形式存在于胞浆中，被激活后就从胞浆内转位到膜相关位点或细胞骨架结构[3]，而许多胞外信息——多肽类激素、磷脂等均可激活PKC[1]。
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我们发现正常妊娠末期，妇女血小板质膜与胞液PKC比活均显著低于健康育龄妇女，我们认为这种PKC活性下降可能是妊娠末期的一种保护性反应。早已知道，妊娠期妇女外周血管、子宫及肾脏血管均扩张，尤以妊娠末期显著[4]，这种孕末期血管阻力下降也许就是由于PKC活性下降所介导。这与动物实验结果是一致的[5]。推测PKC活性下降也许与胎儿、胎盘有关，也许是为适应自体血液循环变化的需要，以使胎儿获取足够的血液供应。因此母体胎盘与胎儿均合成某种内源性PKC抑制剂来抑制PKC活性，从而介导血管舒张。
二、妊高征时血小板PKC比活变化
妊高征时常常出现血小板功能异常，主要表现为：血小板数目减少，血小板体积增加，血小板特异β-血栓球蛋白水平升高，而这些血小板功能亢进的表现往往又是妊高征的早期特征[6]。另外血小板与平滑肌具有相同膜受体，在胞外信息作用下其细胞内变化与平滑肌极其类似[7]，因此PKC活性变化不仅反映其自身功能变化，同时又反映血管平滑肌舒缩状态。
, 百拇医药
本研究结果显示，妊高征患者血小板质膜及胞液PKC比活明显高于正常妊娠，提示妊高征患者不但血小板PKC基础水平高于正常妊娠，且已被激活，提示妊高征时血小板功能异常的细胞分子学基础可能与PKC活性异常有关，这与高血压时血小板PKC活性变化的研究结论一致[8]。同时也说明妊高征时全身细小血管痉挛的情况可由血小板PKC比活增加反映出来。
三、血小板PKC比活与妊高征发生发展的关系
中、轻度妊高征者与重度妊高征者血小板质膜PKC比活均明显高于正常妊娠组，且重度妊高征者血小板胞液PKC比活高于正常妊娠组(P<0.05)，这表明血小板PKC比活与妊高征发生与发展是有关的，同时也提示血小板质膜PKC比活升高代表妊高征的发生，而胞液PKC比活升高则提示妊高征病情的进展。但是重度妊高征者血小板胞液PKC比活升高的原因尚无法解释，需进一步探讨。
参考文献
, 百拇医药
1 Azzi A, boscoboinik D, Hensey C. The protein kinase C family. Eur J Biochem, 1992，208:547-557.
2 Nishizuka Y. Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C. Science, 1992, 258:607-614.
3 Zalewski PD, Forkes IJ, Giannakis C, et al. Synergy between zinc and phorbol ester in translocation of protein kinase C to cytoskeleton. FEBS Lett, 1990, 173:131-134.
, 百拇医药
4 临床产科学编委会.临床产科学，天津；天津科学技术出版社，1994.54.
5 Farley DB, Ford SP. Evidence for declining extracellular calcium uptake and protein kinase C activity in uterine arterial smooth muscle during gestation in gilts. Biol Reprod, 1992，46:315-321.
6 Gibson B, Hunter D, Neame PB, et al. Thrombocytopenia in preeclampsia and eclampsia. Semin Thromb Haemost, 1982，8:234-242.
7 Haller H, Lindschan C, Quass P, et al. Protein phosphorylation and intracellular free calcium in platelets of patients with essential hypertension. Am J hypertens, 1992，5:117-123.
8 高平进，赵光胜， 李迪元， 等.高血压患者及其正常血压女子的血小板蛋白激酶C活性变化. 中华心血管病杂志，1995，23：339-341.
(收稿：1997-05-26 修回：1998-01-18), http://www.100md.com
单位：110003 沈阳，中国医科大学附属第二临床学院妇产科
关键词：妊娠并发症；心血管；高血压；血小板；蛋白激酶C
中华妇产科杂志980402 【摘要】 目的 探讨血小板蛋白激酶C(PKC)比活变化与妊高征发生和发展的关系。方法 用底物蛋白磷酸化法检测18例妊高征患者(妊高征组)，20例健康孕妇(正常妊娠组)及20例健康育龄妇女(对照组)血小板质膜和胞液的PKC比活。结果 正常妊娠组血小板质膜和胞液的PKC比活显著低于对照组(P<0.01)；妊高征组血小板质膜和胞液的PKC比活高于正常妊娠组(P<0.05)。中、轻度妊高征患者仅血小板质膜PKC比活明显高于正常妊娠组(P<0.01)，胞液的PKC比活与正常妊娠组比较，则差异无显著性(P>0.05)。而重度妊高征患者血小板质膜和胞液的PKC比活均高于正常妊娠组(P<0.01，P<0.05)，且重度妊高征患者血小板胞液PKC比活高于中、轻度妊高征患者(P<0.05)，而质膜PKC比活比较，则差异无显著性(P>0.05)。结论 血小板PKC比活变化与妊高征发生和发展有关。
, 百拇医药
Study on the Activity of Platelets Protein Kinase C in Patients with Pregnancy Induced Hypertension Shang Tao,Qiao Chong. Second Affiliated Hospital , China Medical University, Shenyang, 110003
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the activity of protein kinase C(PKC) in plateletes and patients with pregnancy induced hypertension (PIH). Method Activities of PKC in membrane of platelets, which came from 18 PIH pateints(PIH group), 20 normal pregnant women (normal pregnant group) and 20 healthy women (control group) , were measured by substrate protein phosphoylation method. Results Activities of PKC in the membrane and cytosolic of platelets from normal pregnancie are lower than those from control group significantly (P<0.01). Activities of PKC in the membrane and cytosolic of plaelets from PIH group are higher than those from normal pregnancie (P<0.05). Activity of PKC in membrane of platelets from mild and moderate PIH group is higer than that from normal pregnancie (P<0.01) . However , there is no difference between the activites of PKC in cytosolic of platelets from the two groups (P>0.05). Activities of PKC in membrane and cytosolic of platelets from severe PIH were higher than those from normal pregnancie significantly(P<0.01,P<0.05). We also found that the activity of PKC in cytosolic of platelets from severe PIH group was significantly higher than that from mild and PIH cases, though there was no significantly difference in the activity of PKC in membrane of platelets between the two groups. Conclusion Activity of PKC in platelets relates to the occurrence and development of PIH syndrome.
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【Key word】 Pregnancy complications, cardiovascular Hypertension Blood platelets Protein kinase C
妊高征是妊娠晚期发生的严重威胁母儿安全的疾病，至今其病因和致病机理仍无定论。动物实验及临床研究表明，血小板蛋白激酶C(PKC)介导平滑肌尤其是血管平滑肌的舒缩调节[1]，而血小板活化机制与平滑肌的调节有相似之处。我们拟通过检测妊高征及正常孕妇和健康育龄妇女血小板PKC比活，探讨血小板PKC比活的变化与妊高征的关系。
资料与方法
一、研究对象
1.妊高征组：共18例。年龄23～34岁，平均27.9±3.7岁，孕周36周+2～41周，平均为38.2±1.7周。并按郑怀美主编的全国统编教材《妇产科学》第3版提出的关于妊高征的诊断及分类标准分为中、轻度及重度妊高征，各9例 。
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2.正常妊娠组：共20例，均为随机选取的与妊高征患者同期分娩的正常健康孕妇，年龄23～34岁，平均为27.5±3.7岁，孕周37周+5～42周。
3.对照组：共20例 ，为健康育龄妇女，年龄23～34岁，平均29.7±3.9岁。
二、 研究方法
1. 血样采集：孕妇于剖宫产当日、献血员于献血日，清晨空腹抽取肘静脉血5 ml，装入50mmol/L EDTA Na2 0.5ml一次性试管中，封闭管口，反转3次，使其混匀，迅速放入冰水浴中，并于4℃下800 rpm离心10分钟(Sorvall RC 5C型高速恒温离心机,美国杜邦公司生产),吸取上清,制成富血小板血浆(PRP)，计数血小板数，调制成1×109/ml，封住管口，置于-20℃保存备处理及测定。
, http://www.100md.com 2. 样本处理：在冰水浴中，将PRP于4℃ 4000rpm离心30分钟，弃上清，于沉淀中加入缓冲液A 1 ml，超声粉碎20秒/次，共5次(cps-1型超声粉碎机，上海超声仪器厂生产)，再于4℃ 18 000 rpm离心2小时，吸取上清，存于4℃备测定。沉淀中加入1% Triton-1001ml，超声粉碎步骤同前，4°C过夜后，4°C 18000rpm离心2小时后吸取上清，保存于4℃备测定。
3. PKC比活测定：药品：Ⅲ-S组蛋白，甘油二酯，磷脂酰丝氨酸，三磷酸腺苷，均购自Sigma公司，(γ-32P)ATP购自福瑞公司。蛋白定量：Lowry法。PKC比活测定：底物蛋白磷酸化法。
三、 统计学处理：数据统计处理均在AST/486计算机SAS软件上进行，t或t′检验。测定结果用均值±标准差(
±s)表示。, http://www.100md.com
结果
正常妊娠组血小板质膜和胞液PKC比活显著低于对照组(P<0.01)。妊高征组血小板质膜和胞液PKC比活显著高于正常妊娠组(P<0.05)。中、轻度妊高征患者血小板质膜PKC比活显著高于正常妊娠组(P<0.01)，胞液差异无显著性(P<0.05)；但重度妊高征患者血小板质膜和胞液PKC比活性均显著高于正常妊娠组(P<0.01，P<0.05)，且重度妊高征患者血小板胞液PKC比活显著高于中、轻度妊高征患者(P<0.05)，而质膜PKC比活差异无显著性(P<0.05)，见附表。
附表 各组PKC比活(pmol*min-1/mg protein,
±s) 组别例数
PKC比活
, 百拇医药
质膜
胞液
正常妊娠组
20
29.29±23.00
2.59±1.54
对照组
20
133.19±78.15
4.41±1.22
妊高征组
18
58.73±40.04
, 百拇医药
6.0±6.63
中、轻度
9
68.50±54.40
2.91±1.66
重度
9
48.94±15.24
6.18±3.71
讨论
一、妊娠期血小板PKC比活变化
PKC是依赖Ca++/磷脂的丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶，至今人们对PKC进行了大量实验研究，发现它普遍存在于真核细胞中，尤其是哺乳类动物细胞中，参与多种生命活动，如激素分泌、神经递质释放、心肌收缩等[2]，尤其是血管平滑肌收缩。PKC通常以无活性形式存在于胞浆中，被激活后就从胞浆内转位到膜相关位点或细胞骨架结构[3]，而许多胞外信息——多肽类激素、磷脂等均可激活PKC[1]。
, http://www.100md.com
我们发现正常妊娠末期，妇女血小板质膜与胞液PKC比活均显著低于健康育龄妇女，我们认为这种PKC活性下降可能是妊娠末期的一种保护性反应。早已知道，妊娠期妇女外周血管、子宫及肾脏血管均扩张，尤以妊娠末期显著[4]，这种孕末期血管阻力下降也许就是由于PKC活性下降所介导。这与动物实验结果是一致的[5]。推测PKC活性下降也许与胎儿、胎盘有关，也许是为适应自体血液循环变化的需要，以使胎儿获取足够的血液供应。因此母体胎盘与胎儿均合成某种内源性PKC抑制剂来抑制PKC活性，从而介导血管舒张。
二、妊高征时血小板PKC比活变化
妊高征时常常出现血小板功能异常，主要表现为：血小板数目减少，血小板体积增加，血小板特异β-血栓球蛋白水平升高，而这些血小板功能亢进的表现往往又是妊高征的早期特征[6]。另外血小板与平滑肌具有相同膜受体，在胞外信息作用下其细胞内变化与平滑肌极其类似[7]，因此PKC活性变化不仅反映其自身功能变化，同时又反映血管平滑肌舒缩状态。
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本研究结果显示，妊高征患者血小板质膜及胞液PKC比活明显高于正常妊娠，提示妊高征患者不但血小板PKC基础水平高于正常妊娠，且已被激活，提示妊高征时血小板功能异常的细胞分子学基础可能与PKC活性异常有关，这与高血压时血小板PKC活性变化的研究结论一致[8]。同时也说明妊高征时全身细小血管痉挛的情况可由血小板PKC比活增加反映出来。
三、血小板PKC比活与妊高征发生发展的关系
中、轻度妊高征者与重度妊高征者血小板质膜PKC比活均明显高于正常妊娠组，且重度妊高征者血小板胞液PKC比活高于正常妊娠组(P<0.05)，这表明血小板PKC比活与妊高征发生与发展是有关的，同时也提示血小板质膜PKC比活升高代表妊高征的发生，而胞液PKC比活升高则提示妊高征病情的进展。但是重度妊高征者血小板胞液PKC比活升高的原因尚无法解释，需进一步探讨。
参考文献
, 百拇医药
1 Azzi A, boscoboinik D, Hensey C. The protein kinase C family. Eur J Biochem, 1992，208:547-557.
2 Nishizuka Y. Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C. Science, 1992, 258:607-614.
3 Zalewski PD, Forkes IJ, Giannakis C, et al. Synergy between zinc and phorbol ester in translocation of protein kinase C to cytoskeleton. FEBS Lett, 1990, 173:131-134.
, 百拇医药
4 临床产科学编委会.临床产科学，天津；天津科学技术出版社，1994.54.
5 Farley DB, Ford SP. Evidence for declining extracellular calcium uptake and protein kinase C activity in uterine arterial smooth muscle during gestation in gilts. Biol Reprod, 1992，46:315-321.
6 Gibson B, Hunter D, Neame PB, et al. Thrombocytopenia in preeclampsia and eclampsia. Semin Thromb Haemost, 1982，8:234-242.
7 Haller H, Lindschan C, Quass P, et al. Protein phosphorylation and intracellular free calcium in platelets of patients with essential hypertension. Am J hypertens, 1992，5:117-123.
8 高平进，赵光胜， 李迪元， 等.高血压患者及其正常血压女子的血小板蛋白激酶C活性变化. 中华心血管病杂志，1995，23：339-341.
(收稿：1997-05-26 修回：1998-01-18), http://www.100md.com