卵巢癌组织及外周血淋巴细胞多药耐药基因表达蛋白的定量研究
作者：尹格平 陈诵芬 孙晓明 李秀云 袁玮
单位：250031 济南军区总医院妇产科(尹格平，陈诵芬，李秀云，袁玮)，流式细胞研究室(孙晓明)
关键词：卵巢肿瘤；基因表达；抗药性；多药；流式细胞术；P糖蛋白
中华妇产科杂志980509
【摘要】 目的 探讨卵巢癌组织及化疗期间腹水癌细胞(ACC)与外周血淋巴细胞(PBL)多药耐药基因(MDR1)表达蛋白P170含量及其相关性。方法 应用流式细胞免疫学方法，对48例卵巢癌组织细胞、ACC及PBL的P170含量进行动态定量研究。结果 术前25%卵巢癌组织P170含量阳性；化疗期间PBL及ACC P170含量均逐渐增高。结论 卵巢癌细胞不仅可以原发表达P170，且可随化疗疗程的增加而耐药逐渐增强，PBL的P170含量可间接反映残余或复发卵巢癌细胞对化疗药物耐受的程度。
, 百拇医药
Study on Multidrug Resistant Gene (MDR1) Expression between Neoplastic Cells and Peripheral Blood Lymphocytes in Ovarian Carcinoma Yin Geping, Chen Songfen, Sun Xiaoming, et al. Department of Gyneacology and Obstetrics, Jinan Military General Hospital, Jinan 250031
【Abstract】 Objective To explore the correlation of MDR1 (P-glycoprotein, P170) gene expression P170 contents among neoplastic tissues, peripheral blood lymphocytes (PBL) and ascites cancerous cells (ACC) during chemotherapy. Methods Content of P170 in cancer tissue, ACC and PBL was quantiated dynamicly by using flow cytometric-immunologic method in 48 cases suffered from ovarian carcinoma.Results Cancer tissue showed positive P170 in 25% of patients. During chemotherapy, P170 content in PBL and ACC were statistically increased. A significant correlation of P170 was found between PBL and ACC (0.01170 in PBL could probably be used as an indirect index of multidrug resistance for recurrent carcinoma or residual tumor.
, 百拇医药
【Key words】 Ovarian neoplasms Gene expression Drug resistance, multiple Flow cytometry P-glgeoprotein
近年来，以顺铂为主的联合化疗已使卵巢癌患者的生存时间延长，但其5年生存率无明显改善。主要原因之一，就是随着化疗时间的延长，癌细胞对多种化疗药物产生了耐药性[1～3]。本研究应用流式细胞免疫学技术，对48例卵巢癌组织、手术前及化疗期间外周血淋巴细胞(PBL)、腹水癌细胞(ACC)的多药耐药基因(MDR1)表达蛋白P170进行了动态定量研究，以探讨联合化疗时，卵巢癌细胞与PBL的P170含量的相关性，为临床化疗提供较准确、简便的检测手段。
材料与方法
一、研究对象
, 百拇医药
试验组：48例均为我院1995年1月至1997年2月手术并化疗患者。经临床及病理学证实，其中粘液性囊腺癌22例、浆液性囊腺癌16例、未成熟畸胎瘤10例。均于术前抽取静脉血2 ml、经腹壁穿刺抽腹水50～100 ml，术中切取肿瘤组织。以上患者术后复发20例，再取腹水(细胞学均阳性)及PBL。取样时间分别在手术后4个月(化疗3个疗程)、7个月(化疗5个疗程)和14个月(化疗10个疗程)，以便动态观察。化疗药物以顺铂为主，并联合应用5-氟尿嘧啶、环磷酰胺、丝裂霉素等。联合化疗方案参照《实用妇产科学》一书[4]。对照组包括正常对照，即健康妇女PBL 30例，手术切除的非赘生性卵巢组织26例及阳性免疫反应对照即MDR1高表达的细胞株(K562)。
二、实验方法及试剂
1.特殊试剂：第一抗体为鼠抗人单克隆抗体P170及免疫阴性对照抗体羊抗鼠IgG，第二抗体为羊抗鼠IgG-异硫氰酸荧光素标记(FITC)。上述抗体均由法国国际免疫公司生产。淋巴细胞分离液由中国科学院血液研究所生产。
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2.卵巢癌组织制备：将卵巢癌组织制备成细胞膜完整的单细胞悬液，制备步骤见文献[5]。
3.外周血PBL提取：抽取静脉血2 ml，以2%乙二胺四己酸钠(EDTA)抗凝(1∶9)。加入淋巴细胞分离液2 ml，以1 500 r/min离心5分钟，提取PBL，以磷酸盐缓冲液(PBS) 2ml漂洗，同上速度离心2次。
4.提取ACC：无菌抽腹水50～100 ml，以肝素抗凝，以1 500 r/min离心10分钟，弃去上清液，将沉淀细胞加于淋巴细胞分离液2 ml，摇匀后同上速度离心20分钟，收取分离液表面细胞，以PBS漂洗、离心10分钟，弃上清液后将此细胞悬液加于100%∶60%的双层淋巴细胞分离液表面，以2 000 r/min离心20分钟，吸取60%淋巴细胞分离液上界面的细胞即为ACC。取少量提取液涂片，瑞氏染色后光镜下观察，见ACC细胞主要为异型细胞，间皮细胞、淋巴细胞、红细胞等少于10%，以70%乙醇固定ACC。
, 百拇医药
5.免疫反应：先以PBS将各种样品悬液漂洗1次，以1 500 r/min离心5分钟，以除去固定剂，调整悬液细胞数在109/L左右，再将每份悬液分别装入两试管，其一加入20 μl P170(一抗)、其二加入20 μl羊抗鼠IgG(用以指示免疫反应中非特异结合细胞的数量，以便排除免疫反应误差)，室温下放置20分钟。以2 000 r/min离心5分钟，去除上清液后加1 ml PBS漂洗，同上速度离心2次；再向两试管中各加入20 μl羊抗鼠IgG -FITC(二抗)、室温避光放置30分钟，同上速度离心后去上清液，以除去未结合的荧光抗体，以PBS漂洗离心两次，均弃上清液，最后加入500 μl PBS待检。
6.流式细胞仪检测：应用FACScan型流式细胞仪，收集、检测2万个细胞。检测后在Macintosh 650型计算机上应用Cell Quest Plot软件(美国BD公司产)分析数据。
7.P170含量计算：以细胞膜含P170蛋白细胞的百分率表示P170阳性细胞。计算公式为：
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(注：非特异结合细胞是羊抗鼠荧光抗体与人细胞
结合的细胞，为免疫反应误差)
8.卵巢肿瘤细胞、PBL及ACC P170含量判断：取正常对照细胞P170含量95%可信限，即均值+2个标准差。如检测值大于均值+2个标准差，为P170含量增加，即阳性；如检测值小于等于均值+2个标准差，为P170含量正常，即阴性。
结果
一、对照组MDR1表达蛋白P170含量
PBL P170含量：正常对照组健康妇女PBL P170含量为1.62%±0.36%；非赘生性卵巢组织P170含量为1.81%±0.44%。对照组卵巢组织PBL的P170含量与卵巢组织比较，差异无显著性(P>0.05)。根据上述含量计算，PBL的阳性标准值为2.34%(1.62%+2×0.36%)；卵巢组织P170含量的阳性标准值为2.69%(1.81%+2×0.44%)。K562细胞株P170含量为68.44%。
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二、实验组MDR1表达蛋白P170含量
1.不同组织学类型卵巢癌细胞P170含量：粘液性、浆液性囊腺癌与未成熟畸胎瘤3者P170含量间比较，差异无显著性(P>0.05)，见表1。48例癌组织、手术前PBL、ACC及P170含量分别为：2.06%±0.57%、1.91%±0.32%及2.17%±0.31%，3者比较，差异无显著性(P>0.05)；与正常对照组比较，差异也无显著性(P>0.05)。癌组织中，P170阳性12例，占25.0%(12/48)；PBL P170阳性5例，占10.4%(5/48)，且此5例癌组织P170也阳性。
表1 不同组织类型卵巢癌细胞P170含量(%, x±s) 病理组织学类型
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例数
P170含量
粘液性囊腺癌
22
2.23±0.44
浆液性囊腺癌
16
1.96±0.61
未成熟畸胎瘤
10
1.97±0.59
2.复发患者化疗期间PBL及ACC P170含量：试验组中复发20例，PBL及ACC P170含量的动态变化见表2。20例复发患者中8例(40.0%)手术时癌组织P170阳性，另28例未复发者中4例(14.3%)手术时癌组织P170阳性。复发患者手术时癌组织P170阳性发生率显著高于未复发者(0.012检验)。20例复发患者术前(未化疗)、术后4个月(化疗3个疗程)、7个月(化疗5个疗程)和14个月(化疗10个疗程)时，PBL与ACC P170含量的相关系数，分别为0.547、0.536、0.504、0.517(P值均小于0.05)，均呈正相关关系。化疗期间P170阳性患者的恶心、呕吐症状减轻，脱发减少，骨髓抑制程度减轻。
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表2 20例复发患者化疗不同时间PBL及ACC P170含量变化 类别
PBL P170
ACC P170
含量
( x±s)
阳性
例数
阳性率
(%)
含量
( x±s)
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阳性
例数
阳性率
(%)
手术前
2.03±0.59
4
20.0
2.17±0.53
8
40.0
手术后
4个月
, http://www.100md.com
2.27±0.69
6
30.0
3.64±0.87△
8
40.0
7个月
5.16±1.13△
12
60.0
7.74±2.44△
15
, http://www.100md.com
75.0
14个月
9.30±3.25△
15
75.0
16.14±6.73△△
18
90.0
△ P<0.05、△△ P<0.01(均与同种细胞正常对照比较)讨论
多药抗性的肿瘤细胞的一个明显的生化特征，是MDR1过度表达P170糖蛋白。P170位于细胞膜上，其作用是加快化疗药物从癌细胞的排泄，是肿瘤细胞自身保护的重要机理之一[6]。在PBL，P170也可出现在自然杀伤细胞(NK)、细胞毒抑制T细胞、B淋巴细胞及少数辅助-诱导T细胞等细胞膜上，在药物的长期作用下，这些细胞的MDR1可增加P170的表达[7]。因此，研究化疗情况下PBL MDR1的表达，与肿瘤细胞MDR1表达之间的相关性，有重要的临床价值。
, 百拇医药
本研究通过对48例卵巢癌组织、PBL及ACC的P170含量的动态相关性研究，提示25.0%卵巢癌患者在手术及化疗前癌组织可出现MDR1阳性表达，即P170含量阳性，且术前P170含量阳性患者的复发率显著高于术前P170阴性者；PBL在多次化疗药物的作用下，也可以出现P170阳性；复发患者PBL与ACC的P170含量呈逐渐上升趋势，提示卵巢癌细胞及PBL对化疗药物的耐受性均有提高。PBL的P170含量变化与ACC P170含量的改变呈正相关。通过检测PBL P170含量能够间接反映残余或复发卵巢癌细胞对化疗药物耐受的程度。
本研究应用流式细胞免疫学方法，从分子水平客观地探讨了卵巢癌细胞及PBL MDR1表达蛋白P170的含量，方法简便、快速且创伤小，是临床研究卵巢癌化疗耐药性的一个新途径。
, 百拇医药
参考文献
1 梁正东，卞度宏.卵巢癌细胞对顺铂耐药及其逆转的实验研究.中华妇产科杂志，1996，31：75-78.
2 Aros S, Suwa H, Mandai M, et al. Expression of multidrug resistance gene and localization of P-glycoprotein in human primary ovarian cancer. Cancer Res, 1994, 54:1355-1359.
3 Johnson SW, Ozloa RF, Hamilton TC. Mechanism of drugresistance in ovarian cancer. Cancer, 1993, 71(Suppl):644-647.
4 王淑贞主编.实用妇产科学.北京：人民卫生出版社，1987.713-717.
, 百拇医药
5 尹格平，苏应宽，庄桂霞，等.葡萄胎滋养细胞DNA及RNA含量的定量分析及临床意义.中华妇产科杂志，1994，29：538-541.
6 Nooter K, Herweijer H. Multidrug resistance (mdr) genes in human cancer. Br J Cancer, 1991, 63:661-665.
7 Chaudary PM, Mechetner EB, Roninson IB. Expression and activity of the multidrug resistance P-glycoprotein in human peripheral blood lymphocytes. Blood, 1992, 80:2735-2738.
(收稿：1997-01-02 修回：1997-10-03), 百拇医药
单位：250031 济南军区总医院妇产科(尹格平，陈诵芬，李秀云，袁玮)，流式细胞研究室(孙晓明)
关键词：卵巢肿瘤；基因表达；抗药性；多药；流式细胞术；P糖蛋白
中华妇产科杂志980509
【摘要】 目的 探讨卵巢癌组织及化疗期间腹水癌细胞(ACC)与外周血淋巴细胞(PBL)多药耐药基因(MDR1)表达蛋白P170含量及其相关性。方法 应用流式细胞免疫学方法，对48例卵巢癌组织细胞、ACC及PBL的P170含量进行动态定量研究。结果 术前25%卵巢癌组织P170含量阳性；化疗期间PBL及ACC P170含量均逐渐增高。结论 卵巢癌细胞不仅可以原发表达P170，且可随化疗疗程的增加而耐药逐渐增强，PBL的P170含量可间接反映残余或复发卵巢癌细胞对化疗药物耐受的程度。
, 百拇医药
Study on Multidrug Resistant Gene (MDR1) Expression between Neoplastic Cells and Peripheral Blood Lymphocytes in Ovarian Carcinoma Yin Geping, Chen Songfen, Sun Xiaoming, et al. Department of Gyneacology and Obstetrics, Jinan Military General Hospital, Jinan 250031
【Abstract】 Objective To explore the correlation of MDR1 (P-glycoprotein, P170) gene expression P170 contents among neoplastic tissues, peripheral blood lymphocytes (PBL) and ascites cancerous cells (ACC) during chemotherapy. Methods Content of P170 in cancer tissue, ACC and PBL was quantiated dynamicly by using flow cytometric-immunologic method in 48 cases suffered from ovarian carcinoma.Results Cancer tissue showed positive P170 in 25% of patients. During chemotherapy, P170 content in PBL and ACC were statistically increased. A significant correlation of P170 was found between PBL and ACC (0.01
, 百拇医药
【Key words】 Ovarian neoplasms Gene expression Drug resistance, multiple Flow cytometry P-glgeoprotein
近年来，以顺铂为主的联合化疗已使卵巢癌患者的生存时间延长，但其5年生存率无明显改善。主要原因之一，就是随着化疗时间的延长，癌细胞对多种化疗药物产生了耐药性[1～3]。本研究应用流式细胞免疫学技术，对48例卵巢癌组织、手术前及化疗期间外周血淋巴细胞(PBL)、腹水癌细胞(ACC)的多药耐药基因(MDR1)表达蛋白P170进行了动态定量研究，以探讨联合化疗时，卵巢癌细胞与PBL的P170含量的相关性，为临床化疗提供较准确、简便的检测手段。
材料与方法
一、研究对象
, 百拇医药
试验组：48例均为我院1995年1月至1997年2月手术并化疗患者。经临床及病理学证实，其中粘液性囊腺癌22例、浆液性囊腺癌16例、未成熟畸胎瘤10例。均于术前抽取静脉血2 ml、经腹壁穿刺抽腹水50～100 ml，术中切取肿瘤组织。以上患者术后复发20例，再取腹水(细胞学均阳性)及PBL。取样时间分别在手术后4个月(化疗3个疗程)、7个月(化疗5个疗程)和14个月(化疗10个疗程)，以便动态观察。化疗药物以顺铂为主，并联合应用5-氟尿嘧啶、环磷酰胺、丝裂霉素等。联合化疗方案参照《实用妇产科学》一书[4]。对照组包括正常对照，即健康妇女PBL 30例，手术切除的非赘生性卵巢组织26例及阳性免疫反应对照即MDR1高表达的细胞株(K562)。
二、实验方法及试剂
1.特殊试剂：第一抗体为鼠抗人单克隆抗体P170及免疫阴性对照抗体羊抗鼠IgG，第二抗体为羊抗鼠IgG-异硫氰酸荧光素标记(FITC)。上述抗体均由法国国际免疫公司生产。淋巴细胞分离液由中国科学院血液研究所生产。
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2.卵巢癌组织制备：将卵巢癌组织制备成细胞膜完整的单细胞悬液，制备步骤见文献[5]。
3.外周血PBL提取：抽取静脉血2 ml，以2%乙二胺四己酸钠(EDTA)抗凝(1∶9)。加入淋巴细胞分离液2 ml，以1 500 r/min离心5分钟，提取PBL，以磷酸盐缓冲液(PBS) 2ml漂洗，同上速度离心2次。
4.提取ACC：无菌抽腹水50～100 ml，以肝素抗凝，以1 500 r/min离心10分钟，弃去上清液，将沉淀细胞加于淋巴细胞分离液2 ml，摇匀后同上速度离心20分钟，收取分离液表面细胞，以PBS漂洗、离心10分钟，弃上清液后将此细胞悬液加于100%∶60%的双层淋巴细胞分离液表面，以2 000 r/min离心20分钟，吸取60%淋巴细胞分离液上界面的细胞即为ACC。取少量提取液涂片，瑞氏染色后光镜下观察，见ACC细胞主要为异型细胞，间皮细胞、淋巴细胞、红细胞等少于10%，以70%乙醇固定ACC。
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5.免疫反应：先以PBS将各种样品悬液漂洗1次，以1 500 r/min离心5分钟，以除去固定剂，调整悬液细胞数在109/L左右，再将每份悬液分别装入两试管，其一加入20 μl P170(一抗)、其二加入20 μl羊抗鼠IgG(用以指示免疫反应中非特异结合细胞的数量，以便排除免疫反应误差)，室温下放置20分钟。以2 000 r/min离心5分钟，去除上清液后加1 ml PBS漂洗，同上速度离心2次；再向两试管中各加入20 μl羊抗鼠IgG -FITC(二抗)、室温避光放置30分钟，同上速度离心后去上清液，以除去未结合的荧光抗体，以PBS漂洗离心两次，均弃上清液，最后加入500 μl PBS待检。
6.流式细胞仪检测：应用FACScan型流式细胞仪，收集、检测2万个细胞。检测后在Macintosh 650型计算机上应用Cell Quest Plot软件(美国BD公司产)分析数据。
7.P170含量计算：以细胞膜含P170蛋白细胞的百分率表示P170阳性细胞。计算公式为：
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(注：非特异结合细胞是羊抗鼠荧光抗体与人细胞
结合的细胞，为免疫反应误差)
8.卵巢肿瘤细胞、PBL及ACC P170含量判断：取正常对照细胞P170含量95%可信限，即均值+2个标准差。如检测值大于均值+2个标准差，为P170含量增加，即阳性；如检测值小于等于均值+2个标准差，为P170含量正常，即阴性。
结果
一、对照组MDR1表达蛋白P170含量
PBL P170含量：正常对照组健康妇女PBL P170含量为1.62%±0.36%；非赘生性卵巢组织P170含量为1.81%±0.44%。对照组卵巢组织PBL的P170含量与卵巢组织比较，差异无显著性(P>0.05)。根据上述含量计算，PBL的阳性标准值为2.34%(1.62%+2×0.36%)；卵巢组织P170含量的阳性标准值为2.69%(1.81%+2×0.44%)。K562细胞株P170含量为68.44%。
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二、实验组MDR1表达蛋白P170含量
1.不同组织学类型卵巢癌细胞P170含量：粘液性、浆液性囊腺癌与未成熟畸胎瘤3者P170含量间比较，差异无显著性(P>0.05)，见表1。48例癌组织、手术前PBL、ACC及P170含量分别为：2.06%±0.57%、1.91%±0.32%及2.17%±0.31%，3者比较，差异无显著性(P>0.05)；与正常对照组比较，差异也无显著性(P>0.05)。癌组织中，P170阳性12例，占25.0%(12/48)；PBL P170阳性5例，占10.4%(5/48)，且此5例癌组织P170也阳性。
表1 不同组织类型卵巢癌细胞P170含量(%, x±s) 病理组织学类型
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例数
P170含量
粘液性囊腺癌
22
2.23±0.44
浆液性囊腺癌
16
1.96±0.61
未成熟畸胎瘤
10
1.97±0.59
2.复发患者化疗期间PBL及ACC P170含量：试验组中复发20例，PBL及ACC P170含量的动态变化见表2。20例复发患者中8例(40.0%)手术时癌组织P170阳性，另28例未复发者中4例(14.3%)手术时癌组织P170阳性。复发患者手术时癌组织P170阳性发生率显著高于未复发者(0.01
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表2 20例复发患者化疗不同时间PBL及ACC P170含量变化 类别
PBL P170
ACC P170
含量
( x±s)
阳性
例数
阳性率
(%)
含量
( x±s)
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阳性
例数
阳性率
(%)
手术前
2.03±0.59
4
20.0
2.17±0.53
8
40.0
手术后
4个月
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2.27±0.69
6
30.0
3.64±0.87△
8
40.0
7个月
5.16±1.13△
12
60.0
7.74±2.44△
15
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75.0
14个月
9.30±3.25△
15
75.0
16.14±6.73△△
18
90.0
△ P<0.05、△△ P<0.01(均与同种细胞正常对照比较)讨论
多药抗性的肿瘤细胞的一个明显的生化特征，是MDR1过度表达P170糖蛋白。P170位于细胞膜上，其作用是加快化疗药物从癌细胞的排泄，是肿瘤细胞自身保护的重要机理之一[6]。在PBL，P170也可出现在自然杀伤细胞(NK)、细胞毒抑制T细胞、B淋巴细胞及少数辅助-诱导T细胞等细胞膜上，在药物的长期作用下，这些细胞的MDR1可增加P170的表达[7]。因此，研究化疗情况下PBL MDR1的表达，与肿瘤细胞MDR1表达之间的相关性，有重要的临床价值。
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本研究通过对48例卵巢癌组织、PBL及ACC的P170含量的动态相关性研究，提示25.0%卵巢癌患者在手术及化疗前癌组织可出现MDR1阳性表达，即P170含量阳性，且术前P170含量阳性患者的复发率显著高于术前P170阴性者；PBL在多次化疗药物的作用下，也可以出现P170阳性；复发患者PBL与ACC的P170含量呈逐渐上升趋势，提示卵巢癌细胞及PBL对化疗药物的耐受性均有提高。PBL的P170含量变化与ACC P170含量的改变呈正相关。通过检测PBL P170含量能够间接反映残余或复发卵巢癌细胞对化疗药物耐受的程度。
本研究应用流式细胞免疫学方法，从分子水平客观地探讨了卵巢癌细胞及PBL MDR1表达蛋白P170的含量，方法简便、快速且创伤小，是临床研究卵巢癌化疗耐药性的一个新途径。
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参考文献
1 梁正东，卞度宏.卵巢癌细胞对顺铂耐药及其逆转的实验研究.中华妇产科杂志，1996，31：75-78.
2 Aros S, Suwa H, Mandai M, et al. Expression of multidrug resistance gene and localization of P-glycoprotein in human primary ovarian cancer. Cancer Res, 1994, 54:1355-1359.
3 Johnson SW, Ozloa RF, Hamilton TC. Mechanism of drugresistance in ovarian cancer. Cancer, 1993, 71(Suppl):644-647.
4 王淑贞主编.实用妇产科学.北京：人民卫生出版社，1987.713-717.
, 百拇医药
5 尹格平，苏应宽，庄桂霞，等.葡萄胎滋养细胞DNA及RNA含量的定量分析及临床意义.中华妇产科杂志，1994，29：538-541.
6 Nooter K, Herweijer H. Multidrug resistance (mdr) genes in human cancer. Br J Cancer, 1991, 63:661-665.
7 Chaudary PM, Mechetner EB, Roninson IB. Expression and activity of the multidrug resistance P-glycoprotein in human peripheral blood lymphocytes. Blood, 1992, 80:2735-2738.
(收稿：1997-01-02 修回：1997-10-03), 百拇医药