人无血清输卵管上皮细胞模型与小鼠胚胎共培养的研究
作者：曾卫 封志纯
单位：510028 广州，第一军医大学珠江医院儿科[曾卫(现在解放军第一八一医院)，封志纯]
关键词：输卵管；上皮；胎儿发育；细胞；培养的
中华妇产科杂志/981008
【摘要】 目的 了解2细胞期小鼠胚胎与人输卵管上皮细胞体外无血清共培养中的发育状况。方法 配制无血清培养液，予小鼠超排卵并取2细胞期胚胎，将90个2细胞期小鼠胚胎与人输卵管上皮细胞在无血清培养液中进行体外共培养，另以90个同期胚胎在无辅助细胞的培养液中培养作对照，每日在显微镜下观察小鼠胚胎发育情况。结果 共培养的胚胎有82%发育到桑椹胚，77%形成囊胚，63%胚胎孵化。对照者仅45%发育到桑椹胚，13%到初级囊胚，无孵化胚胎。共培养胚胎发育速度快，碎片率明显低于对照者。结论 人输卵管上皮细胞与小鼠胚胎共培养可以促进胚胎体外发育，并提高胚胎发育质量。
, 百拇医药
Improvement of Mouse Early Embryo Development in Vitro by Co-Culture with Human Oviductal Epithelial Cells in Serum-Free Medium Zeng Wei, Feng Zhichun. Zhujiang Hospital, The First Military Medical College, Guanghzou 510028
【Abstract】 Objective To examine the effect of human oviductal epithelial cells on early mouse embryonic cleavage and growth in vitro. Methods Ninety 2-cell mouse embryos were co-cultured with human oviductal epithelial cells in DMEM /Ham's F12+0.3% bovine serum albumin(BSA)+estradiol (E2) and ninety embryos cultured in DMEM / F12 +0.3%BSA+E2 alone as control. Results Among the embryos co-cultured with oviductal epithelial cells, 82% developed to the morulae stage, 77% cavitated to blastocysts with 63% hatching, as compared with 45% to morulae stage, 13% to blastocysts and none hatching in the controls. Co-cultured embryos cleaved significantly faster than control and showed no or less fragmentation than those in the control. Conclusion These results suggested that human oviductal epithelial cells can support early embryonic development and yield a reasonable number of embryos with good quality up to the blastocyst stage.
, 百拇医药
【Key words】 Fallopian tubes Epithelium Fetal development Cells, cultured
适宜的培养体系是动物胚胎生物技术，是体外受精、胚胎分割、胚胎克隆、胚胎嵌合、外源DNA注射等的基础条件和有效工具。常规体外培养的胚胎发育率低，胚胎质量差。近年来，国外实验室利用哺乳动物上皮细胞及其他细胞作为辅助细胞建立共培养体系，发现有促进胚胎体外发育及生存质量的作用[1～4]。共培养系统对胚胎的作用仍不完全明了，特别是共培养体系在有血清培养液中培养，血清的干扰因素很大。因此，本研究将无血清人输卵管上皮细胞模型与小鼠胚胎共培养，观察其对胚胎体外发育及发育质量的影响。
材料与方法
一、材料
无血清培养基：DMEM/Ham's F12(D-Hank＇s液，美国Gibco产品)，含0.4%牛血清白蛋白(BSA)(德国B.M产品)， 10-6 mmol 雌二醇(E2)，HEPES 10～15mmol(美国Sigma公司产品)，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml，pH为7.2。孕马血清(PMSG)为天津动物实验中心产品，人绒毛膜促性腺激素(hCG，南京大学制药厂产品)，透明质酸酶为美国Sigma公司产品。培养容器为24孔培养板(丹麦Nunc公司产品),100ml培养瓶(国产)。
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二、方法
1. 小鼠2细胞胚胎的获取：选用第一军医大学动物研究室提供的8周龄昆明雌鼠，腹腔注射 PMSG 10IU，48小时后腹腔注射hCG 10IU，当晚与雄鼠以1∶2的比例同笼，次日晨检查阴道栓，有阴道栓者，在注射hCG 30小时左右以颈部脱臼法处死小鼠，取出输卵管和卵巢，用4号针头连接1 ml注射器(含培养液)冲卵，如胚胎带卵丘细胞，可用300IU/ ml透明质酸酶消化除去卵丘细胞，选择形态正常的受精卵用于培养。
2. 人输卵管上皮细胞的获取和培养：标本取自45岁以下要求行绝育手术或单纯子宫肌瘤切除术的病人，标本切除后立刻投入盛有100U/ml 青霉素、100μg/ml 链霉素的D-Hank's液中，低温下30分钟内送实验室进行培养。输卵管上皮细胞的原代和传代培养方法参照文献[1，2]。
3. 共培养的建立：取传代早期的输卵管上皮细胞，传代时以3×105/ml种植在24孔培养板中，每孔1 ml 。培养3天后，细胞长至占培养孔面积的70%～80%，换无血清培养液，第2天可用于共培养。共培养时，将获取的2细胞期胚胎随机放入各培养孔中，每孔约放20个胚胎。对照为无辅助细胞无血清培养液。在37℃、5%CO2的恒温箱中培养。
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4. 结果观察：每日取出培养皿用倒置显微镜观察胚胎发育情况并记录拍照。观察时应尽量减少观察时间，避免强光照射，少开孵箱门，以免影响培养环境。
三、统计学处理
采用χ2检验分析结果。
结果
每日用倒置显微镜观察可见：共培养的胚胎24小时后大部分发育到4细胞期，48小时发育到桑椹期，72小时可形成囊胚，96小时可有囊胚孵出，囊胚孵化率达82%。而对照的胚胎发育速度明显缓慢，培养48小时仅41个2细胞囊胚发育至桑椹胚，96小时才偶有胚胎发育到初级囊胚即停止发育，且胚胎发育碎片出现早，碎片率(38%)比共培养的(12%)高。在相同时间内，2细胞期发育至4细胞期数，两者间差异有极显著性(P<0.001)，从2细胞期至桑椹胚，两者间差异有极显著性(P<0.01)。
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人输卵管上皮细胞共培养与对照的小鼠胚胎发育情况见附表。
讨论
共培养体系是指把胚胎放在输卵管上皮细胞或其他类型的辅助细胞上共同培养，以促进胚胎发育。国外实验研究利用哺乳动物的子宫内膜细胞、颗粒细胞、卵丘细胞、非洲绿猴肾细胞及肝细胞等作为辅助细胞，亦取得不同程度的有利结果。但多用有血清培养液培养，而血清中含有大量的促细胞生长因子和未知内含物，其对胚胎的影响不可估量。本实验室利用无血清培养液进行共培养，去除血清这一复杂因素，有利于进一步研究共培养对胚胎发育的作用机理。本研究共培养中的82% 2细胞发育至桑椹期，77%发育至囊胚期，囊胚孵化率达82% (57/69)。而对照者中仅45%发育到桑椹胚，13%到初级囊胚，无胚胎孵化。并且，共培养胚胎发育速度快，细胞碎片率明显低于对照者。提示，输卵管上皮细胞共培养系统可明显促进早期胚胎体外发育(P<0.01)，并提高胚胎发育质量。
早在30年以前，Biggers等发现2细胞鼠胚在移植到培养液中的鼠输卵管内进行体外培养，可以继续发育并突破细胞体外发育阻滞期。 Rexeiad 和Powell最早报道用输卵管上皮细胞培养早期羊胚，其后在兔胚、鼠胚等与输卵管细胞单层共培养的结果都证明，输卵管上皮细胞对胚胎发育有明显的促进作用，并能帮助动物胚胎突破早期细胞分裂阻滞现象。Tucker等[5]发现，人胚在冷冻保存前与牛输卵管上皮细胞共培养，并不能提高胚胎冷冻生存率，但在解冻后，其植入率比冷冻前在标准培养液培养的要高。McCaffrey 等[6]为了进一步了解在联合培养1～4个细胞期的牛胚时输卵管细胞单层与胚胎培养时相接触的必要，在输卵管细胞单层与胚胎之间加上一层有微孔(0.4μm)的膜，对照为直接接触,结果证实，直接接触并不提高胚胎体外发育率。Rieger 等[7]在最近的研究中比较输卵管细胞联合培
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附表 小鼠2细胞胚胎在共培养中的发育状况 类别
4细胞
桑椹胚
囊胚(初囊)
孵化囊胚
细胞数
百分率(%)
时间(h)
细胞数
百分率(%)
时间(h)
细胞数
, 百拇医药 百分率(%)
时间(h)
细胞数
百分率(%)
时间(h)
共培养
81
87
24
74
82
48
69
, 百拇医药
77
72
57
63
96
对照
66
73
24
41
45
48
12
13
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96
养与经输卵管细胞条件化的培养液对原核牛胚发育的影响。发现联合培养中胚胎发育比在条件化的培养液中发育要快。在4～16细胞期，糖代谢在输卵管细胞联合培养液中不活跃，而在桑椹胚期则加快，这符合胚胎发育的生理情况。而且在联合培养液中葡萄糖浓度较低，乳糖浓度较高。以上结果说明，输卵管上皮细胞不仅分泌胚胎营养物质，也能随着胚胎发育的不同阶段提供适当的微环境，通过代谢途径，清除培养液中对胚胎发育不利的成分。为了确定输卵管对鼠胚发育的哪一阶段有影响，以及测定何种输卵管细胞单层分泌物对胚胎发育产生影响，Minami等[8]进行了大量实验，指出输卵管对鼠胚发育的影响主要在胚胎的2细胞形成后期至4细胞形成前期，这阶段鼠胚对输卵管因子的刺激最敏感，并且这些因子来源于输卵管的壶腹部。他们用葡聚糖凝胶G-25柱来分流输卵管条件后的培养液，提取其中的大分子物质及小分子物质，比较它们对胚胎发育的影响。结果发现，小分子输卵管因子在胚胎2细胞阶段起着主要的作用。另外，共培养系统可能产生一些特异因子，克服体外培养中胚胎透明带硬化过程，使胚胎透明带变薄，囊胚易于孵出着床，提高妊娠率。
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综上所述，输卵管上皮细胞作为辅助细胞有明显促进胚胎发育的作用，下一步的工作应检测联合培养液中的成分，进行深入的研究。参考文献
1 Yeung WSB, Ho PC, Lau EYL, et al. Improved development of human embryos in vitro by a human oviductal cell co-culture system. Hum Reprod, 1992, 7:1144-1150.
2 Goldberg JM, Khalifa EAM, Friedman CI, et al. Improvement of in vitro fertilization and early embryo development in mice by coculture with human fallopian tube epithelium. Am J Obstect Gynecol, 1991, 165:1802-1809.
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3 Pielos MW, Frasor J, Mack S, et al. Evaluation of co-culture and alternative culture systems for promoting in-vitro development of mouse embryos. Hum Reprod, 1995,10:1486-1492.
4 Nina N, Elizabeth A, Douglas A, et al. Novel human endometrial cell line promotes blastocyst development. Fertil Steril, 1994, 61:760-766.
5 Tucker MJ, Kort HI, Toledo AA, et al. Effect of co-culture on subsquent survival and implantation of cryopreserved human embryos. J Assist Reprod Genet, 1995, 12: 689-692.
, 百拇医药
6 McCaffrey C, McEvoy TG, Diskin MG, et al. Successful co-culture of 1-4cell cattle ova to the morula or blastocyst stage. J Reprod Fertil, 1991, 92:119-124.
7 Rieger D, Grisart B, Semple E, et al. Comparison of the effects of oviductal cell co-culture and oviductal cell conditioned medium on the development and metabolic activity of cattle embryos. J Reprod Fertil, 1995，105, 91-98.
8 Minami N, Utsumi K, Iritani A. Effects of low molecular weight oviductal factors on the development of mouse one-cell embryos in vitro. J Reprod Fertil, 1992, 96:735-745.
(收稿：1998-01-05 修回：1998-07-01), http://www.100md.com
单位：510028 广州，第一军医大学珠江医院儿科[曾卫(现在解放军第一八一医院)，封志纯]
关键词：输卵管；上皮；胎儿发育；细胞；培养的
中华妇产科杂志/981008
【摘要】 目的 了解2细胞期小鼠胚胎与人输卵管上皮细胞体外无血清共培养中的发育状况。方法 配制无血清培养液，予小鼠超排卵并取2细胞期胚胎，将90个2细胞期小鼠胚胎与人输卵管上皮细胞在无血清培养液中进行体外共培养，另以90个同期胚胎在无辅助细胞的培养液中培养作对照，每日在显微镜下观察小鼠胚胎发育情况。结果 共培养的胚胎有82%发育到桑椹胚，77%形成囊胚，63%胚胎孵化。对照者仅45%发育到桑椹胚，13%到初级囊胚，无孵化胚胎。共培养胚胎发育速度快，碎片率明显低于对照者。结论 人输卵管上皮细胞与小鼠胚胎共培养可以促进胚胎体外发育，并提高胚胎发育质量。
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Improvement of Mouse Early Embryo Development in Vitro by Co-Culture with Human Oviductal Epithelial Cells in Serum-Free Medium Zeng Wei, Feng Zhichun. Zhujiang Hospital, The First Military Medical College, Guanghzou 510028
【Abstract】 Objective To examine the effect of human oviductal epithelial cells on early mouse embryonic cleavage and growth in vitro. Methods Ninety 2-cell mouse embryos were co-cultured with human oviductal epithelial cells in DMEM /Ham's F12+0.3% bovine serum albumin(BSA)+estradiol (E2) and ninety embryos cultured in DMEM / F12 +0.3%BSA+E2 alone as control. Results Among the embryos co-cultured with oviductal epithelial cells, 82% developed to the morulae stage, 77% cavitated to blastocysts with 63% hatching, as compared with 45% to morulae stage, 13% to blastocysts and none hatching in the controls. Co-cultured embryos cleaved significantly faster than control and showed no or less fragmentation than those in the control. Conclusion These results suggested that human oviductal epithelial cells can support early embryonic development and yield a reasonable number of embryos with good quality up to the blastocyst stage.
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【Key words】 Fallopian tubes Epithelium Fetal development Cells, cultured
适宜的培养体系是动物胚胎生物技术，是体外受精、胚胎分割、胚胎克隆、胚胎嵌合、外源DNA注射等的基础条件和有效工具。常规体外培养的胚胎发育率低，胚胎质量差。近年来，国外实验室利用哺乳动物上皮细胞及其他细胞作为辅助细胞建立共培养体系，发现有促进胚胎体外发育及生存质量的作用[1～4]。共培养系统对胚胎的作用仍不完全明了，特别是共培养体系在有血清培养液中培养，血清的干扰因素很大。因此，本研究将无血清人输卵管上皮细胞模型与小鼠胚胎共培养，观察其对胚胎体外发育及发育质量的影响。
材料与方法
一、材料
无血清培养基：DMEM/Ham's F12(D-Hank＇s液，美国Gibco产品)，含0.4%牛血清白蛋白(BSA)(德国B.M产品)， 10-6 mmol 雌二醇(E2)，HEPES 10～15mmol(美国Sigma公司产品)，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml，pH为7.2。孕马血清(PMSG)为天津动物实验中心产品，人绒毛膜促性腺激素(hCG，南京大学制药厂产品)，透明质酸酶为美国Sigma公司产品。培养容器为24孔培养板(丹麦Nunc公司产品),100ml培养瓶(国产)。
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二、方法
1. 小鼠2细胞胚胎的获取：选用第一军医大学动物研究室提供的8周龄昆明雌鼠，腹腔注射 PMSG 10IU，48小时后腹腔注射hCG 10IU，当晚与雄鼠以1∶2的比例同笼，次日晨检查阴道栓，有阴道栓者，在注射hCG 30小时左右以颈部脱臼法处死小鼠，取出输卵管和卵巢，用4号针头连接1 ml注射器(含培养液)冲卵，如胚胎带卵丘细胞，可用300IU/ ml透明质酸酶消化除去卵丘细胞，选择形态正常的受精卵用于培养。
2. 人输卵管上皮细胞的获取和培养：标本取自45岁以下要求行绝育手术或单纯子宫肌瘤切除术的病人，标本切除后立刻投入盛有100U/ml 青霉素、100μg/ml 链霉素的D-Hank's液中，低温下30分钟内送实验室进行培养。输卵管上皮细胞的原代和传代培养方法参照文献[1，2]。
3. 共培养的建立：取传代早期的输卵管上皮细胞，传代时以3×105/ml种植在24孔培养板中，每孔1 ml 。培养3天后，细胞长至占培养孔面积的70%～80%，换无血清培养液，第2天可用于共培养。共培养时，将获取的2细胞期胚胎随机放入各培养孔中，每孔约放20个胚胎。对照为无辅助细胞无血清培养液。在37℃、5%CO2的恒温箱中培养。
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4. 结果观察：每日取出培养皿用倒置显微镜观察胚胎发育情况并记录拍照。观察时应尽量减少观察时间，避免强光照射，少开孵箱门，以免影响培养环境。
三、统计学处理
采用χ2检验分析结果。
结果
每日用倒置显微镜观察可见：共培养的胚胎24小时后大部分发育到4细胞期，48小时发育到桑椹期，72小时可形成囊胚，96小时可有囊胚孵出，囊胚孵化率达82%。而对照的胚胎发育速度明显缓慢，培养48小时仅41个2细胞囊胚发育至桑椹胚，96小时才偶有胚胎发育到初级囊胚即停止发育，且胚胎发育碎片出现早，碎片率(38%)比共培养的(12%)高。在相同时间内，2细胞期发育至4细胞期数，两者间差异有极显著性(P<0.001)，从2细胞期至桑椹胚，两者间差异有极显著性(P<0.01)。
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人输卵管上皮细胞共培养与对照的小鼠胚胎发育情况见附表。
讨论
共培养体系是指把胚胎放在输卵管上皮细胞或其他类型的辅助细胞上共同培养，以促进胚胎发育。国外实验研究利用哺乳动物的子宫内膜细胞、颗粒细胞、卵丘细胞、非洲绿猴肾细胞及肝细胞等作为辅助细胞，亦取得不同程度的有利结果。但多用有血清培养液培养，而血清中含有大量的促细胞生长因子和未知内含物，其对胚胎的影响不可估量。本实验室利用无血清培养液进行共培养，去除血清这一复杂因素，有利于进一步研究共培养对胚胎发育的作用机理。本研究共培养中的82% 2细胞发育至桑椹期，77%发育至囊胚期，囊胚孵化率达82% (57/69)。而对照者中仅45%发育到桑椹胚，13%到初级囊胚，无胚胎孵化。并且，共培养胚胎发育速度快，细胞碎片率明显低于对照者。提示，输卵管上皮细胞共培养系统可明显促进早期胚胎体外发育(P<0.01)，并提高胚胎发育质量。
早在30年以前，Biggers等发现2细胞鼠胚在移植到培养液中的鼠输卵管内进行体外培养，可以继续发育并突破细胞体外发育阻滞期。 Rexeiad 和Powell最早报道用输卵管上皮细胞培养早期羊胚，其后在兔胚、鼠胚等与输卵管细胞单层共培养的结果都证明，输卵管上皮细胞对胚胎发育有明显的促进作用，并能帮助动物胚胎突破早期细胞分裂阻滞现象。Tucker等[5]发现，人胚在冷冻保存前与牛输卵管上皮细胞共培养，并不能提高胚胎冷冻生存率，但在解冻后，其植入率比冷冻前在标准培养液培养的要高。McCaffrey 等[6]为了进一步了解在联合培养1～4个细胞期的牛胚时输卵管细胞单层与胚胎培养时相接触的必要，在输卵管细胞单层与胚胎之间加上一层有微孔(0.4μm)的膜，对照为直接接触,结果证实，直接接触并不提高胚胎体外发育率。Rieger 等[7]在最近的研究中比较输卵管细胞联合培
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附表 小鼠2细胞胚胎在共培养中的发育状况 类别
4细胞
桑椹胚
囊胚(初囊)
孵化囊胚
细胞数
百分率(%)
时间(h)
细胞数
百分率(%)
时间(h)
细胞数
, 百拇医药 百分率(%)
时间(h)
细胞数
百分率(%)
时间(h)
共培养
81
87
24
74
82
48
69
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77
72
57
63
96
对照
66
73
24
41
45
48
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养与经输卵管细胞条件化的培养液对原核牛胚发育的影响。发现联合培养中胚胎发育比在条件化的培养液中发育要快。在4～16细胞期，糖代谢在输卵管细胞联合培养液中不活跃，而在桑椹胚期则加快，这符合胚胎发育的生理情况。而且在联合培养液中葡萄糖浓度较低，乳糖浓度较高。以上结果说明，输卵管上皮细胞不仅分泌胚胎营养物质，也能随着胚胎发育的不同阶段提供适当的微环境，通过代谢途径，清除培养液中对胚胎发育不利的成分。为了确定输卵管对鼠胚发育的哪一阶段有影响，以及测定何种输卵管细胞单层分泌物对胚胎发育产生影响，Minami等[8]进行了大量实验，指出输卵管对鼠胚发育的影响主要在胚胎的2细胞形成后期至4细胞形成前期，这阶段鼠胚对输卵管因子的刺激最敏感，并且这些因子来源于输卵管的壶腹部。他们用葡聚糖凝胶G-25柱来分流输卵管条件后的培养液，提取其中的大分子物质及小分子物质，比较它们对胚胎发育的影响。结果发现，小分子输卵管因子在胚胎2细胞阶段起着主要的作用。另外，共培养系统可能产生一些特异因子，克服体外培养中胚胎透明带硬化过程，使胚胎透明带变薄，囊胚易于孵出着床，提高妊娠率。
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综上所述，输卵管上皮细胞作为辅助细胞有明显促进胚胎发育的作用，下一步的工作应检测联合培养液中的成分，进行深入的研究。参考文献
1 Yeung WSB, Ho PC, Lau EYL, et al. Improved development of human embryos in vitro by a human oviductal cell co-culture system. Hum Reprod, 1992, 7:1144-1150.
2 Goldberg JM, Khalifa EAM, Friedman CI, et al. Improvement of in vitro fertilization and early embryo development in mice by coculture with human fallopian tube epithelium. Am J Obstect Gynecol, 1991, 165:1802-1809.
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3 Pielos MW, Frasor J, Mack S, et al. Evaluation of co-culture and alternative culture systems for promoting in-vitro development of mouse embryos. Hum Reprod, 1995,10:1486-1492.
4 Nina N, Elizabeth A, Douglas A, et al. Novel human endometrial cell line promotes blastocyst development. Fertil Steril, 1994, 61:760-766.
5 Tucker MJ, Kort HI, Toledo AA, et al. Effect of co-culture on subsquent survival and implantation of cryopreserved human embryos. J Assist Reprod Genet, 1995, 12: 689-692.
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6 McCaffrey C, McEvoy TG, Diskin MG, et al. Successful co-culture of 1-4cell cattle ova to the morula or blastocyst stage. J Reprod Fertil, 1991, 92:119-124.
7 Rieger D, Grisart B, Semple E, et al. Comparison of the effects of oviductal cell co-culture and oviductal cell conditioned medium on the development and metabolic activity of cattle embryos. J Reprod Fertil, 1995，105, 91-98.
8 Minami N, Utsumi K, Iritani A. Effects of low molecular weight oviductal factors on the development of mouse one-cell embryos in vitro. J Reprod Fertil, 1992, 96:735-745.
(收稿：1998-01-05 修回：1998-07-01), http://www.100md.com