胎盘组织中胰岛素样生长因子-Ⅰ的定位及定量分析
作者：万贵平 冷静 俞淑 王海琦 刘嘉茵 王兆璇
单位：210029 南京医科大学第一附属医院妇产科
关键词：胰岛素样生长因子Ⅰ；胎盘；免疫组织化学；胎儿；生长
中国妇产科杂志981110 【摘要】 目的 探讨胎盘组织中胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)定位，评估IGF-Ⅰ在胎儿生长发育中的作用。方法 用免疫组化法对妊娠胎盘组织中IGF-Ⅰ细胞进行定位，并采用计算机医学图像分析系统，检测小于胎龄儿(SGA)组22例，适于胎龄儿(AGA)组25例及大于胎龄儿(LGA)组25例的IGF-Ⅰ，并进行定量分析。用t检验法进行各组间均数检验。结果 (1)胎盘IGF-Ⅰ主要位于绒毛小叶的合体滋养细胞及细胞滋养细胞。此外，也存在于Hoffbauer细胞及平滑绒毛层，但染色较以上两种细胞明显减弱，胎膜的羊膜细胞及蜕膜细胞偶尔可见阳性，而绒毛小叶蜕膜细胞则未见阳性着色。(2)与AGA组比较，SGA组胎盘IGF-Ⅰ的相对面积及平均吸光度均显著降低(t=4.65, P<0.001、t=2.15, P<0.05)，而LGA组胎盘IGF-Ⅰ的相对面积及平均吸光度均显著升高(t=8.72, P<0.001; t=7.82, P<0.001)。结论 胎盘组织中IGF-Ⅰ主要定位于胎盘小叶的合体滋养细胞、细胞滋养细胞；胎盘组织合成和分泌IGF-Ⅰ的多少，与发生LGA及SGA有关。
, 百拇医药
Localization and Quantitative Analysis of Insulin-Like Growth Factor-I in Placenta of Extreme Fetus Wan Guiping, Leng Jing, Yu Shu, et al. First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029
【Abstract】 Objective To investigate the immunohistochemical localization of insulin-like growth factor-Ⅰ (IGF-Ⅰ) in human placenta and to evaluate the role of IGF-Ⅰ in fetal grwoth and placental growth. Methods In 72 tested samples, The cellular distribution of IGF-Ⅰ in human placenta was determined by using immunohistochemistry. The relative area and mean absorbance were determined by using image analysis technique. Student's t-test was used to compare mean values bewteen groups. Results IGF-Ⅰ immunostaining was found in syncytiotrophoblast, cytotrophoblast and Hoffbauer's cells of chorionic villi and chorion of fetal membranes. The strongest immunoreactivity was observed in the syncytiotrophoblast and cytotrophoblast. The relative area and absorbance in placenta of SGA group were significantly lower than those of AGA group respectively (t=4.65, P<0.001; t=2.15, P<0.05). But the relative arca and absorbance of LGA were significantly higher than those of AGA (t=8.72, P<0.001; t=7.82, P<0.001). Conclusion These results suggested that IGF-Ⅰ in human placenta was principally synthsized and secreted by syncytiotrophoblast, cytotrophoblast, hoffbauer's cells of chorionic villi and chorion of fetal membranes. IGF-Ⅰ is an improtant regulator of fetal and placental growth and development. It has the key role for macrosomia and IUGR forming.
, 百拇医药
【Key words】 Insulin-like growth factor Ⅰ Placenta Immunohistochemistry Fetus Growth
胎儿生长所需要的营养，依赖于胎盘的供给，胎盘生长发育的状况直接影响胎儿的生长发育。Liu等[1]发现胎盘重量与胎儿体重呈高度正相关。Victor等[2]研究提出，胎盘组织中有胰岛素样生长因子-Ⅰ (IGF-Ⅰ) mRNA表达。本研究通过免疫组化对胎盘组织中IGF-Ⅰ定位，并通过图像分析对其定量。探讨其与胎儿生长发育的关系。
资料和方法
一、研究对象
选择1997年5月至1997年11月，在南京医科大学第一和第二附属医院妇产科分娩的72例足月妊娠妇女，年龄21～35岁，无明显的妊娠合并症及并发症，孕龄37～42周。根据Brenner[3]的标准分为小于胎龄儿(SGA)组22例，适于胎龄儿(AGA)组25例，大于胎龄儿(LGA)组25例。在分娩或剖宫产时，于近母体面取胎盘组织约0.5 cm×1.0 cm、胎膜少许，中性福马林固定至分析时。
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二、试剂
山羊抗人IGF-Ⅰ抗体由美国Sigma公司提供；兔抗山羊桥抗体(7.1 g/L)及山羊过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)(约1.2 g/L)由丹麦Dako公司提供；二氨基联苯胺(10X)稀释液由上海华美生物工程公司提供。
三、方法
1.免疫组化(PAP分析法)：固定后标本经一系列浓度的乙醇、二甲苯脱水、石蜡包埋、切片(8～10 μm)、贴片。脱蜡、脱水、磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)漂洗15分钟，H2O2阻断内源性过氧化物酶30分钟，PBS漂洗15分钟、滴加1∶10正常兔血清孵育10分钟、滴加山羊抗人IGF-Ⅰ多抗(稀释度1∶200，4℃过夜)，PBS漂洗15分钟、滴加兔抗山羊Ⅱ抗体(1∶200)孵育30分钟，PBS漂洗15分钟、滴加山羊PAP复合物(1∶100)孵育60分钟，PBS漂洗15分钟、滴加DAB显色10分钟后终止显色。苏木素对比核染色，树胶封片。阴性对照为省略一抗或Ⅱ抗，以PBS代替。阳性细胞必须符合下列要求：(1)镜下组织细胞结构清晰；(2)阳性颗粒定位好；(3)染色明显高于背景。阳性结果判断标准：标本组织细胞浆或基质中有棕黄色染色。
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2.胎盘组织IGF-Ⅰ的定量分析：采用同济医科大学清平影像工程公司生产的MPIAS-500多媒体彩色病理图像分析系统。由显微摄象机将切片图像输入计算机，每张切片随机测定10个区域的阳性细胞绝对面积、相对面积、平均吸光度。相对面积代表阳性细胞占全部细胞的百分数，平均吸光度，代表染色强度，反映IGF-Ⅰ的相对含量，以任意单位(arbitary unit, AU)表示[4]。
结果
一、胎盘组织中IGF-Ⅰ细胞的定位
胎盘IGF-Ⅰ主要位于绒毛小叶的合体滋养细胞及细胞滋养细胞。此外，Hoffbauer′s细胞及平滑绒毛层亦存在IGF-Ⅰ，但染色较以上两种细胞明显减弱，胎膜的羊膜细胞及蜕膜细胞偶尔可见阳性着色，而绒毛小叶蜕膜细胞则未见阳性着色。
二、3组胎盘的IGF-Ⅰ定量
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SGA组、AGA组、LGA组胎盘组织中IGF-Ⅰ的相对面积分别为16.13±2.96、20.94±2.40、30.26±3.37；平均吸光度分别为67.50±8.70、76.40±5.05、89.05±6.14。与AGA组比较，SGA组胎盘IGF-Ⅰ的相对面积及平均吸光度均显著降低(t=4.65, P<0.001; t=2.15, P<0.05)而LGA组胎盘IGF-Ⅰ的相对面积及平均吸光度均显著升高(t=8.72, P<0.001、t=7.82, P<0.001)。
讨论
一、胎盘IGF-Ⅰ的来源
Victor等[2]发现绒毛小叶的合体滋养细胞、细胞滋养细胞及胎膜的平滑绒毛层细胞内均有IGF-Ⅰ mRNA表达，说明IGF-Ⅰ可能主要由以上几种细胞合成并分泌。本研究结果显示，胎盘IGF-Ⅰ主要位于以上几种细胞内，从而进一步证实了这一观点。由于Hoffbauer's细胞可能具有吞噬功能，所以，Hoffbauer's细胞的IGF-Ⅰ可能来源于自己合成或吞噬外源性的IGF-Ⅰ所致。鉴于Victor等[2]发现，此细胞亦有IGF-Ⅰ mRNA表达，说明来源于自己合成，但吞噬外源的可能性不能完全排除。胎盘蜕膜细胞中未见IGF-Ⅰ阳性着色，说明此细胞没有合成IGF-Ⅰ的功能。
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二、胎盘组织IGF-Ⅰ与胎儿生长发育
胎盘组织IGF-Ⅰ的定量分析，采用医学图像计算机分析系统进行，这是免疫组化分析中一项较为先进的技术，结果可靠。结果表明，与AGA组比较，SGA组胎盘组织IGF-Ⅰ的相对面积、平均吸光度均显著降低，而LGA组胎盘组织IGF-Ⅰ的相对面积、平均吸光度均显著升高，说明胎盘合成和分泌IGF-Ⅰ量的多少与胎儿生长发育的结果直接相关，对LGA、SGA的发生可能有重要作用。Kind等[5]通过观察部分胎盘所致胎羊宫内发育迟缓模型时发现，胎羊脐血清IGF-Ⅰ的水平较正常组下降，同时胎羊组织中(肌肉、肺和肾)IGF-Ⅰ mRNA表达丰度(abundance)均较正常组显著下降。说明胎盘发育及功能的好坏不仅仅影响到脐血清IGF-Ⅰ的水平，而且影响胎儿组织合成IGF-Ⅰ。Harding等[6]研究发现，外源性IGF-Ⅰ能使胎儿血有机氮及血糖水平下降，尿氮降低，胎盘的糖原摄取增加，胎儿处于正氮平衡状态，起到了促进生长的作用。所以，胎盘能否分泌充足的IGF-Ⅰ，直接影响到胎儿的生长发育。
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参考文献
1 Liu YJ, Tsushima T, Minei S, et al. Insulin-like growth factors (IGFs) and IGF-binding proteins (IGFBP-1,-2,-3) in diabetic pregancy: relationship to macrosomia. Endocrine J, 1996, 43:221-231.
2 Victor KMH, Bassett N, Walton J, et al. The expression of insulin-like growth factor (IGF) and IGF-binding protein (IGFBP) genes in the human placenta and membranes: evidence for IGF-IGFBP interactions at the feto-maternal interface. J Clin Enodcrinol Metab, 1996, 81:2680-2693.
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3 Brenner WE. A standard of fetal growth for the united states of America. Am J Obstet Gynecol, 1976, 126:555-564.
4 冯振卿，李晶阁，印红，等.二己基亚硝胺诱发的大鼠肝癌癌前病变活性定量研究.中国组织化学与细胞化学杂志，1995，4：196-200.
5 Kind RL, Owens JA, Robinson JS. Effect of restriction of placental growth on expression of IGFs in fetal sheep: relation to fetal growth, circulating IGFs and binding proteins. J Endocrine, 1995, 146:23-34.
6 Harding JE, Liu L, Evans PC, et al. Insulin-like growth factor-I alters feto-placental protein and carbohydrate metabolism in fetal sheep. Endocrinology, 1994, 134:1509-1514.
(收稿：1998-03-15 修回：1998-07-12), 百拇医药
单位：210029 南京医科大学第一附属医院妇产科
关键词：胰岛素样生长因子Ⅰ；胎盘；免疫组织化学；胎儿；生长
中国妇产科杂志981110 【摘要】 目的 探讨胎盘组织中胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)定位，评估IGF-Ⅰ在胎儿生长发育中的作用。方法 用免疫组化法对妊娠胎盘组织中IGF-Ⅰ细胞进行定位，并采用计算机医学图像分析系统，检测小于胎龄儿(SGA)组22例，适于胎龄儿(AGA)组25例及大于胎龄儿(LGA)组25例的IGF-Ⅰ，并进行定量分析。用t检验法进行各组间均数检验。结果 (1)胎盘IGF-Ⅰ主要位于绒毛小叶的合体滋养细胞及细胞滋养细胞。此外，也存在于Hoffbauer细胞及平滑绒毛层，但染色较以上两种细胞明显减弱，胎膜的羊膜细胞及蜕膜细胞偶尔可见阳性，而绒毛小叶蜕膜细胞则未见阳性着色。(2)与AGA组比较，SGA组胎盘IGF-Ⅰ的相对面积及平均吸光度均显著降低(t=4.65, P<0.001、t=2.15, P<0.05)，而LGA组胎盘IGF-Ⅰ的相对面积及平均吸光度均显著升高(t=8.72, P<0.001; t=7.82, P<0.001)。结论 胎盘组织中IGF-Ⅰ主要定位于胎盘小叶的合体滋养细胞、细胞滋养细胞；胎盘组织合成和分泌IGF-Ⅰ的多少，与发生LGA及SGA有关。
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Localization and Quantitative Analysis of Insulin-Like Growth Factor-I in Placenta of Extreme Fetus Wan Guiping, Leng Jing, Yu Shu, et al. First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029
【Abstract】 Objective To investigate the immunohistochemical localization of insulin-like growth factor-Ⅰ (IGF-Ⅰ) in human placenta and to evaluate the role of IGF-Ⅰ in fetal grwoth and placental growth. Methods In 72 tested samples, The cellular distribution of IGF-Ⅰ in human placenta was determined by using immunohistochemistry. The relative area and mean absorbance were determined by using image analysis technique. Student's t-test was used to compare mean values bewteen groups. Results IGF-Ⅰ immunostaining was found in syncytiotrophoblast, cytotrophoblast and Hoffbauer's cells of chorionic villi and chorion of fetal membranes. The strongest immunoreactivity was observed in the syncytiotrophoblast and cytotrophoblast. The relative area and absorbance in placenta of SGA group were significantly lower than those of AGA group respectively (t=4.65, P<0.001; t=2.15, P<0.05). But the relative arca and absorbance of LGA were significantly higher than those of AGA (t=8.72, P<0.001; t=7.82, P<0.001). Conclusion These results suggested that IGF-Ⅰ in human placenta was principally synthsized and secreted by syncytiotrophoblast, cytotrophoblast, hoffbauer's cells of chorionic villi and chorion of fetal membranes. IGF-Ⅰ is an improtant regulator of fetal and placental growth and development. It has the key role for macrosomia and IUGR forming.
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【Key words】 Insulin-like growth factor Ⅰ Placenta Immunohistochemistry Fetus Growth
胎儿生长所需要的营养，依赖于胎盘的供给，胎盘生长发育的状况直接影响胎儿的生长发育。Liu等[1]发现胎盘重量与胎儿体重呈高度正相关。Victor等[2]研究提出，胎盘组织中有胰岛素样生长因子-Ⅰ (IGF-Ⅰ) mRNA表达。本研究通过免疫组化对胎盘组织中IGF-Ⅰ定位，并通过图像分析对其定量。探讨其与胎儿生长发育的关系。
资料和方法
一、研究对象
选择1997年5月至1997年11月，在南京医科大学第一和第二附属医院妇产科分娩的72例足月妊娠妇女，年龄21～35岁，无明显的妊娠合并症及并发症，孕龄37～42周。根据Brenner[3]的标准分为小于胎龄儿(SGA)组22例，适于胎龄儿(AGA)组25例，大于胎龄儿(LGA)组25例。在分娩或剖宫产时，于近母体面取胎盘组织约0.5 cm×1.0 cm、胎膜少许，中性福马林固定至分析时。
, 百拇医药
二、试剂
山羊抗人IGF-Ⅰ抗体由美国Sigma公司提供；兔抗山羊桥抗体(7.1 g/L)及山羊过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)(约1.2 g/L)由丹麦Dako公司提供；二氨基联苯胺(10X)稀释液由上海华美生物工程公司提供。
三、方法
1.免疫组化(PAP分析法)：固定后标本经一系列浓度的乙醇、二甲苯脱水、石蜡包埋、切片(8～10 μm)、贴片。脱蜡、脱水、磷酸缓冲液(PBS，pH 7.4)漂洗15分钟，H2O2阻断内源性过氧化物酶30分钟，PBS漂洗15分钟、滴加1∶10正常兔血清孵育10分钟、滴加山羊抗人IGF-Ⅰ多抗(稀释度1∶200，4℃过夜)，PBS漂洗15分钟、滴加兔抗山羊Ⅱ抗体(1∶200)孵育30分钟，PBS漂洗15分钟、滴加山羊PAP复合物(1∶100)孵育60分钟，PBS漂洗15分钟、滴加DAB显色10分钟后终止显色。苏木素对比核染色，树胶封片。阴性对照为省略一抗或Ⅱ抗，以PBS代替。阳性细胞必须符合下列要求：(1)镜下组织细胞结构清晰；(2)阳性颗粒定位好；(3)染色明显高于背景。阳性结果判断标准：标本组织细胞浆或基质中有棕黄色染色。
, http://www.100md.com
2.胎盘组织IGF-Ⅰ的定量分析：采用同济医科大学清平影像工程公司生产的MPIAS-500多媒体彩色病理图像分析系统。由显微摄象机将切片图像输入计算机，每张切片随机测定10个区域的阳性细胞绝对面积、相对面积、平均吸光度。相对面积代表阳性细胞占全部细胞的百分数，平均吸光度，代表染色强度，反映IGF-Ⅰ的相对含量，以任意单位(arbitary unit, AU)表示[4]。
结果
一、胎盘组织中IGF-Ⅰ细胞的定位
胎盘IGF-Ⅰ主要位于绒毛小叶的合体滋养细胞及细胞滋养细胞。此外，Hoffbauer′s细胞及平滑绒毛层亦存在IGF-Ⅰ，但染色较以上两种细胞明显减弱，胎膜的羊膜细胞及蜕膜细胞偶尔可见阳性着色，而绒毛小叶蜕膜细胞则未见阳性着色。
二、3组胎盘的IGF-Ⅰ定量
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SGA组、AGA组、LGA组胎盘组织中IGF-Ⅰ的相对面积分别为16.13±2.96、20.94±2.40、30.26±3.37；平均吸光度分别为67.50±8.70、76.40±5.05、89.05±6.14。与AGA组比较，SGA组胎盘IGF-Ⅰ的相对面积及平均吸光度均显著降低(t=4.65, P<0.001; t=2.15, P<0.05)而LGA组胎盘IGF-Ⅰ的相对面积及平均吸光度均显著升高(t=8.72, P<0.001、t=7.82, P<0.001)。
讨论
一、胎盘IGF-Ⅰ的来源
Victor等[2]发现绒毛小叶的合体滋养细胞、细胞滋养细胞及胎膜的平滑绒毛层细胞内均有IGF-Ⅰ mRNA表达，说明IGF-Ⅰ可能主要由以上几种细胞合成并分泌。本研究结果显示，胎盘IGF-Ⅰ主要位于以上几种细胞内，从而进一步证实了这一观点。由于Hoffbauer's细胞可能具有吞噬功能，所以，Hoffbauer's细胞的IGF-Ⅰ可能来源于自己合成或吞噬外源性的IGF-Ⅰ所致。鉴于Victor等[2]发现，此细胞亦有IGF-Ⅰ mRNA表达，说明来源于自己合成，但吞噬外源的可能性不能完全排除。胎盘蜕膜细胞中未见IGF-Ⅰ阳性着色，说明此细胞没有合成IGF-Ⅰ的功能。
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二、胎盘组织IGF-Ⅰ与胎儿生长发育
胎盘组织IGF-Ⅰ的定量分析，采用医学图像计算机分析系统进行，这是免疫组化分析中一项较为先进的技术，结果可靠。结果表明，与AGA组比较，SGA组胎盘组织IGF-Ⅰ的相对面积、平均吸光度均显著降低，而LGA组胎盘组织IGF-Ⅰ的相对面积、平均吸光度均显著升高，说明胎盘合成和分泌IGF-Ⅰ量的多少与胎儿生长发育的结果直接相关，对LGA、SGA的发生可能有重要作用。Kind等[5]通过观察部分胎盘所致胎羊宫内发育迟缓模型时发现，胎羊脐血清IGF-Ⅰ的水平较正常组下降，同时胎羊组织中(肌肉、肺和肾)IGF-Ⅰ mRNA表达丰度(abundance)均较正常组显著下降。说明胎盘发育及功能的好坏不仅仅影响到脐血清IGF-Ⅰ的水平，而且影响胎儿组织合成IGF-Ⅰ。Harding等[6]研究发现，外源性IGF-Ⅰ能使胎儿血有机氮及血糖水平下降，尿氮降低，胎盘的糖原摄取增加，胎儿处于正氮平衡状态，起到了促进生长的作用。所以，胎盘能否分泌充足的IGF-Ⅰ，直接影响到胎儿的生长发育。
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参考文献
1 Liu YJ, Tsushima T, Minei S, et al. Insulin-like growth factors (IGFs) and IGF-binding proteins (IGFBP-1,-2,-3) in diabetic pregancy: relationship to macrosomia. Endocrine J, 1996, 43:221-231.
2 Victor KMH, Bassett N, Walton J, et al. The expression of insulin-like growth factor (IGF) and IGF-binding protein (IGFBP) genes in the human placenta and membranes: evidence for IGF-IGFBP interactions at the feto-maternal interface. J Clin Enodcrinol Metab, 1996, 81:2680-2693.
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3 Brenner WE. A standard of fetal growth for the united states of America. Am J Obstet Gynecol, 1976, 126:555-564.
4 冯振卿，李晶阁，印红，等.二己基亚硝胺诱发的大鼠肝癌癌前病变活性定量研究.中国组织化学与细胞化学杂志，1995，4：196-200.
5 Kind RL, Owens JA, Robinson JS. Effect of restriction of placental growth on expression of IGFs in fetal sheep: relation to fetal growth, circulating IGFs and binding proteins. J Endocrine, 1995, 146:23-34.
6 Harding JE, Liu L, Evans PC, et al. Insulin-like growth factor-I alters feto-placental protein and carbohydrate metabolism in fetal sheep. Endocrinology, 1994, 134:1509-1514.
(收稿：1998-03-15 修回：1998-07-12), 百拇医药