妊高征患者血清对内皮细胞分泌一氧化氮的影响
作者：张斌 庄依亮 王克强 许元初
单位：200011 上海医科大学妇产科医院[张斌(现在中国福利会国际和平妇幼保健院)，庄依亮]；上海医科大学基础医学院(王克强)；上海市吴淞中心医院放射免疫中心(许元初)
关键词：
中华妇产科杂志981212 妊高征是严重影响孕产妇发病率及病死率的妊娠期特有疾病之一，病因至今未明。近年来的研究表明，妊高征发病与孕产妇内皮细胞功能失调明显相关[1]。有学者提出妊高征患者的产前血清中含有某种或某些细胞毒性因子，可损伤内皮细胞功能[2]。一氧化氮(nitric oxide, NO)是近几年颇受关注的新的细胞信使传递小分子物质，可由内皮细胞分泌，是调节血管的主要因子之一。本研究采用前瞻性随机双盲法，测定体外培养的脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的NO2-含量，探讨妊高征患者产前血清对HUVEC分泌NO的影响以及妊高征患者和正常妊娠妇女HUVEC分泌NO的差异。
, 百拇医药
一、资料与方法
1.病例选择及分组：1996年10月至1997年6月在上海医科大学妇产科医院住院分娩的中、重度妊高征患者12例(妊高征组)和正常妊娠妇女11例(正常妊娠组)。妊高征诊断标准按《妇产科学》(第4版)[3]，无内科合并症及并发症。孕妇平均孕周为39周。两组孕妇的年龄、孕产次及孕龄均无统计学差异。每例孕妇的HUVEC又分为三份(即三个培养皿)。当HUVEC融合为单层时，吸尽培养液，第1份加入含20%妊高征产前血清的M199培养液；第2份加入含20%正常孕妇血清的M199培养液；第3份为对照组，仅加入相等量的M199培养液。所有培养皿均置于37℃，5%的CO2培养箱中温育24小时，取出培养液，-20℃冰箱冻存。
2.方法：(1)血清制备：采集两组孕妇分娩前静脉血3ml，静置半小时后，2 000r/min离心5分钟，取上清液，-20℃冰箱冻存。(2)HUVEC培养及鉴定：参照Jaffe等[4]培养HUVEC的方法并加以改进。分娩后立即无菌收集脐带30cm于冷平衡盐液(D-Hank′s)中，结扎脐带动脉，反复冲洗脐带静脉。以0.01%的胶原酶Ⅱ型(美国Sigma公司产品)和0.25%胰酶(上海化学试验采购供应站)混合酶液内充脐静脉，37℃，消化20分钟，收集消化液，用小牛血清终止消化。3 000r/min离心5分钟，弃上清液，加入M199培养液(美国Gibeco公司产品)，含20%小牛血清(宁波无菌小牛血清加工场产品)和5%胎牛血清(美国Hyclone实验公司产品)，将细胞吹打成悬液，以104/ml密度接种于3个3.5cm玻璃培养皿中，37℃，5%CO2培养箱中培养，隔天更换培养液1次，至细胞生长融合为单层。细胞鉴定采用VIII因子相关抗原免疫组化法。(3)NO测定：采用化学重氮法，即Greiss试剂(北京化学试剂公司产品)和Bio-Rad 450型酶标比色仪测定NO的稳定代谢终产物NO2-。
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3.统计方法：本研究采用组间t检验。
二、结果
1.HUVEC培养结果：各组HUVEC融合时均呈典型的铺路石样改变。VIII因子相关抗原鉴定为阳性。两组的HUVEC大体形态无明显差别。
2.NO2-测定结果：妊高征患者血清及正常妊娠妇女血清可使妊高征组NO分泌量升高，同时也可使正常妊娠组NO分泌量升高，见附表。在妊高征组中，正常妊娠妇女血清使其培养液中NO2-升高的程度大于妊高征患者血清，但差异无显著性(P>0.05)。在正常妊娠组中，妊高征患者血清使其培养液中NO2-升高的程度大于正常妊娠妇女血清，但差异也无显著性(P>0.05)。
三、讨论
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近年来的研究提示，NO与妊高征发病有关，但结果不一致。我们培养妊高征患者HUVEC和正常妊娠妇女HUVEC，研究妊高征患者血清和正常妊娠妇女血清对其分泌NO的影响。结果表明，妊高征妊娠妇女血清不仅可以增加妊高征患者HUVEC的NO产量，同时也能增加正常妊娠妇女HUVEC的NO产量。另外，正常妊娠血清亦能增加妊高征患者和正常妊娠妇女HUVEC的NO产量，与Davidge等[5]报道一致。不支持妊高征发病由NO分泌减少引起的假说。
正常妊娠状态，NO含量升高可以增加胎儿胎盘血液供应，提供胎儿正常生长发育必备的条件；妊高征病理条件下，NO含量增加被认为是一种代偿机制[6]，是妊高征病理发展阶段的相应反应。应当指出的是，我们的研究为体外实验，主要针对HUVEC，而妊高征为复杂的病理状态，体内状态下刺激NO合成的因素很多，还有NO与内皮素、血管紧张素、前列腺素之间的相互影响。妊高征发病可能是多因素复杂作用的终结果，在妊高征不同的病理发展阶段，可能由不同的因子占主导作用。我们的实验仅为NO在妊高征发病机制中作用的初步研究，还有待完善和深入。附表 两组加入不同血清时NO-2测定结果(μmol/L，
) 组别
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例数
妊高征产前血清
正常孕妇血清
对照血清
妊高征组
12
17.07±11.20*
17.26±8.07**
10.26±5.18
正常妊娠组
11
17.65±6.55**
, http://www.100md.com
14.79±5.93*
11.23±3.23
注：与对照血清比较：*P<0.05，**P<0.01参考文献
1 Roberts JM, Taylor RN, Music TJ, et al. Preeclampsia: an endothelial cell disorder. Am J Obstet Gynecol, 1989, 161:1200-1204.
2 Rodgers GM, Taylor RN, Roberts JM. Preeclampsia is assciated with a serum factor cytotoxic to human endothelial cells. Am J Obstet Gynecol, 1988, 159:908-914.
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3 乐杰主编.妇产科学.第4版.北京：人民卫生出版社，1996.115.
4 Jaffe EA. Culture of humen endothelial cells. Transplantation Proceedings, 1980, 12(Suppl):49-53.
5 Davidge ST, Baker PN, Roberts JM. NOS expression is increased in endothelial cells exposed to plasma from women with preeclampsia. Am J Physiol, 1995, 269:1106-1112.
6 Lyall F, Young A, Greer IA. Nitric oxide concentrations are increased in the fetoplacental circulation in preeclampsia. Am J Obstet Gynecol, 1995, 173:714-718.
(收稿：1997-12-22 修回：1998-08-30), 百拇医药
单位：200011 上海医科大学妇产科医院[张斌(现在中国福利会国际和平妇幼保健院)，庄依亮]；上海医科大学基础医学院(王克强)；上海市吴淞中心医院放射免疫中心(许元初)
关键词：
中华妇产科杂志981212 妊高征是严重影响孕产妇发病率及病死率的妊娠期特有疾病之一，病因至今未明。近年来的研究表明，妊高征发病与孕产妇内皮细胞功能失调明显相关[1]。有学者提出妊高征患者的产前血清中含有某种或某些细胞毒性因子，可损伤内皮细胞功能[2]。一氧化氮(nitric oxide, NO)是近几年颇受关注的新的细胞信使传递小分子物质，可由内皮细胞分泌，是调节血管的主要因子之一。本研究采用前瞻性随机双盲法，测定体外培养的脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的NO2-含量，探讨妊高征患者产前血清对HUVEC分泌NO的影响以及妊高征患者和正常妊娠妇女HUVEC分泌NO的差异。
, 百拇医药
一、资料与方法
1.病例选择及分组：1996年10月至1997年6月在上海医科大学妇产科医院住院分娩的中、重度妊高征患者12例(妊高征组)和正常妊娠妇女11例(正常妊娠组)。妊高征诊断标准按《妇产科学》(第4版)[3]，无内科合并症及并发症。孕妇平均孕周为39周。两组孕妇的年龄、孕产次及孕龄均无统计学差异。每例孕妇的HUVEC又分为三份(即三个培养皿)。当HUVEC融合为单层时，吸尽培养液，第1份加入含20%妊高征产前血清的M199培养液；第2份加入含20%正常孕妇血清的M199培养液；第3份为对照组，仅加入相等量的M199培养液。所有培养皿均置于37℃，5%的CO2培养箱中温育24小时，取出培养液，-20℃冰箱冻存。
2.方法：(1)血清制备：采集两组孕妇分娩前静脉血3ml，静置半小时后，2 000r/min离心5分钟，取上清液，-20℃冰箱冻存。(2)HUVEC培养及鉴定：参照Jaffe等[4]培养HUVEC的方法并加以改进。分娩后立即无菌收集脐带30cm于冷平衡盐液(D-Hank′s)中，结扎脐带动脉，反复冲洗脐带静脉。以0.01%的胶原酶Ⅱ型(美国Sigma公司产品)和0.25%胰酶(上海化学试验采购供应站)混合酶液内充脐静脉，37℃，消化20分钟，收集消化液，用小牛血清终止消化。3 000r/min离心5分钟，弃上清液，加入M199培养液(美国Gibeco公司产品)，含20%小牛血清(宁波无菌小牛血清加工场产品)和5%胎牛血清(美国Hyclone实验公司产品)，将细胞吹打成悬液，以104/ml密度接种于3个3.5cm玻璃培养皿中，37℃，5%CO2培养箱中培养，隔天更换培养液1次，至细胞生长融合为单层。细胞鉴定采用VIII因子相关抗原免疫组化法。(3)NO测定：采用化学重氮法，即Greiss试剂(北京化学试剂公司产品)和Bio-Rad 450型酶标比色仪测定NO的稳定代谢终产物NO2-。
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3.统计方法：本研究采用组间t检验。
二、结果
1.HUVEC培养结果：各组HUVEC融合时均呈典型的铺路石样改变。VIII因子相关抗原鉴定为阳性。两组的HUVEC大体形态无明显差别。
2.NO2-测定结果：妊高征患者血清及正常妊娠妇女血清可使妊高征组NO分泌量升高，同时也可使正常妊娠组NO分泌量升高，见附表。在妊高征组中，正常妊娠妇女血清使其培养液中NO2-升高的程度大于妊高征患者血清，但差异无显著性(P>0.05)。在正常妊娠组中，妊高征患者血清使其培养液中NO2-升高的程度大于正常妊娠妇女血清，但差异也无显著性(P>0.05)。
三、讨论
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近年来的研究提示，NO与妊高征发病有关，但结果不一致。我们培养妊高征患者HUVEC和正常妊娠妇女HUVEC，研究妊高征患者血清和正常妊娠妇女血清对其分泌NO的影响。结果表明，妊高征妊娠妇女血清不仅可以增加妊高征患者HUVEC的NO产量，同时也能增加正常妊娠妇女HUVEC的NO产量。另外，正常妊娠血清亦能增加妊高征患者和正常妊娠妇女HUVEC的NO产量，与Davidge等[5]报道一致。不支持妊高征发病由NO分泌减少引起的假说。
正常妊娠状态，NO含量升高可以增加胎儿胎盘血液供应，提供胎儿正常生长发育必备的条件；妊高征病理条件下，NO含量增加被认为是一种代偿机制[6]，是妊高征病理发展阶段的相应反应。应当指出的是，我们的研究为体外实验，主要针对HUVEC，而妊高征为复杂的病理状态，体内状态下刺激NO合成的因素很多，还有NO与内皮素、血管紧张素、前列腺素之间的相互影响。妊高征发病可能是多因素复杂作用的终结果，在妊高征不同的病理发展阶段，可能由不同的因子占主导作用。我们的实验仅为NO在妊高征发病机制中作用的初步研究，还有待完善和深入。附表 两组加入不同血清时NO-2测定结果(μmol/L，
) 组别, http://www.100md.com
例数
妊高征产前血清
正常孕妇血清
对照血清
妊高征组
12
17.07±11.20*
17.26±8.07**
10.26±5.18
正常妊娠组
11
17.65±6.55**
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14.79±5.93*
11.23±3.23
注：与对照血清比较：*P<0.05，**P<0.01参考文献
1 Roberts JM, Taylor RN, Music TJ, et al. Preeclampsia: an endothelial cell disorder. Am J Obstet Gynecol, 1989, 161:1200-1204.
2 Rodgers GM, Taylor RN, Roberts JM. Preeclampsia is assciated with a serum factor cytotoxic to human endothelial cells. Am J Obstet Gynecol, 1988, 159:908-914.
, http://www.100md.com
3 乐杰主编.妇产科学.第4版.北京：人民卫生出版社，1996.115.
4 Jaffe EA. Culture of humen endothelial cells. Transplantation Proceedings, 1980, 12(Suppl):49-53.
5 Davidge ST, Baker PN, Roberts JM. NOS expression is increased in endothelial cells exposed to plasma from women with preeclampsia. Am J Physiol, 1995, 269:1106-1112.
6 Lyall F, Young A, Greer IA. Nitric oxide concentrations are increased in the fetoplacental circulation in preeclampsia. Am J Obstet Gynecol, 1995, 173:714-718.
(收稿：1997-12-22 修回：1998-08-30), 百拇医药