自身免疫性卵巢功能衰退小鼠体液免疫和细胞免疫的测定
作者：林建华 严隽鸿 林其德 姜守玲 沈冠凤
单位：200001 上海第二医科大学附属仁济医院妇产科
关键词：卵巢功能早衰；抗体生成；免疫；细胞
中华妇产科杂志981210 【摘要】 目的 探讨自身免疫性卵巢功能衰退者体液免疫和细胞免疫的变化。方法 在建立自身免疫性卵巢功能衰退小鼠动物模型基础上，测定血自身抗卵巢抗体(AOA)和T细胞亚群变化。结果 自身免疫性卵巢功能衰退小鼠辅助性-诱导性T细胞(CD+4)无明显变化，而细胞毒性-抑制性T细胞(CD+8)百分比明显下降(P<0.01)，CD4/CD8比率明显增加(P<0.05)；血清AOA阳性，并导致卵巢组织病理性损伤，性激素产生减少，生育率降低。结论 T细胞亚群比例失调、B细胞功能增强，是导致自身免疫性卵巢功能衰退的免疫病理基础。
, http://www.100md.com
Determination of Cellular and Humoral Immunity in Mice of Autoimmune Ovarian Failure Lin Jianhua, Yan Junhong, Lin Qide, et al. Renji Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200001
【Abstract】 Objective To determine cellular and humoral immunity in mice of autoimmune ovarian failure. Methods A mice model of autoimmune ovarian failure was established. The percentages of help T cell (CD+4) and suppressor T cell (CD+8), the ratio of CD4/CD8 and anti-ovarian antibody (AOA) were determined. Results No significant changes were found in CD+4 fraction, but the percentage of CD+8 was reduced and the ratio of CD4/CD8 increased. AOA was positive which was probably the cause of damage of the ovarian tissues, reduction of sex hormone secretion and impaired fertility. Conclusion Autoimmune ovarian failure is correlated with the abnormal change of CD4/CD8 and the increase of B-lymphocytes function.
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【Key words】 Ovarian failure，premature Antibody formation Immunity, celluar
部分卵巢早衰者有自身免疫反应过强现象，在外周血中可测得抗卵巢抗体(anti-ovarian antibody, AOA)的存在。亦有报道病理检测发现，部分闭经或月经不调患者卵巢有淋巴细胞浸润，临床诊断为自身免疫性卵巢炎。本研究在建立自身免疫性卵巢功能衰退动物模型的基础上，测定其体液免疫和细胞免疫的变化，对该类疾病的发生机理进行初步探讨。
材料与方法
一、自身免疫性卵巢功能衰退小鼠动物模型的建立
1.卵巢抗原的制备及主动免疫：取BALB/c小鼠(鼠龄3～6月，体重30 g左右)的卵巢组织，在Tris-HCl缓冲液中将组织剪碎并研磨成匀浆，低温下超声粉碎5分钟并离心(4 000 r/min，15分钟；10 000 r/min，5分钟)，取上清液(其中蛋白含量为21.70 mg/ml)加入等量不完全福氏佐剂和卡介苗(10 mg/ml)，碾磨成乳化状，在BALB/c小鼠(鼠龄8～10周，体重20 g左右)腹部及足底多点皮下注射，总量为0.2 ml/只(含卵巢组织15 mg/只)，同时在小鼠尾静脉注射百日咳疫苗0.1 ml(10×1010ml)。每3周加强免疫1次，剂量和方法与首次免疫相同[1，2]，此为自身免疫组。取兔卵巢组织(蛋白含量为18.39 mg/ml)同法免疫小鼠，为异种免疫组。生理盐水代替卵巢抗原同法免疫小鼠为对照组。
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2.卵巢功能的测定及病理观察：主动免疫第30天后，连续观察阴道上皮细胞的周期性变化，直至周期性改变消失。小鼠按二雌一雄比例交配，两周后于免疫的第60、80和120天分别处死小鼠，冲洗子宫，了解受孕情况。卵巢行光镜、电镜检测。
二、自身AOA和T细胞亚群的测定
于首次免疫的第30、40、50、60、70、80和90天，小鼠眼眶静脉放血0.5 ml(不处死小鼠)，血清低温保存。按酶免疫组化ABC法(美国Vector公司产品)测定血AOA水平。血清1∶40稀释，Ⅱ-抗1∶50稀释。在免疫的第60、80和120天处死小鼠之前眼眶放血(肝素抗凝)，即刻应用流式细胞仪(美国Coulter公司产品，EPICS-751型)测定CD+4、CD+8和CD4/CD8。大鼠抗小鼠CD+4(抗L3T4)、CD+8(抗Lyt2)单抗和荧光标记的兔抗大鼠抗体(Ⅱ-抗)均购于北京医科大学免疫教研室。
, 百拇医药
三、统计学方法
采用t检验。
结果
一、生殖器官病理改变和受孕率变化
免疫后的小鼠阴道涂片中细胞无周期性改变，上皮细胞体积变小，角化细胞和羊齿状结晶减少，直至消失，代之以白细胞为主。与正常卵巢相比较，光镜下免疫后生长卵泡和成熟卵泡数明显减少，卵母细胞及透明带形态异常，周边颗粒细胞排列紊乱，闭锁卵泡增多，病理损伤随免疫时间延长而加重。而电镜下早期发育的卵泡单层颗粒细胞排列尚整齐，细胞形态正常，但生长卵泡的透明带外缘不光滑，部分断裂，外缘与颗粒细胞间的裂隙增宽，周边部分颗粒细胞非放射状排列，细胞器变性，核固缩。自身免疫组较异体免疫组更为明显，对照组无明显改变。交配两周，自身免疫组无小鼠受孕，异种免疫组受孕率为23%，而对照组为80%。
二、AOA水平
, 百拇医药
免疫第30天始AOA即阳性，抗原抗体反应所示的棕色变化可见于颗粒细胞、间质细胞、卵泡内膜细胞和黄体细胞等多部位(附图)。
三、CD+4、CD+8和CD4/CD8水平
与对照组比较，自身免疫组CD+4百分比无明显变化，CD+8的百分比明显下降(P<0.01)，CD4/CD8比率明显增加(P<0.05)。异种免疫组T细胞亚群均无明显改变(附表)。
附表 各组外周血T细胞亚群的测定(%，
) 组别
, 百拇医药
只
CD4+
CD8+
CD4/CD8
自身免疫组
20
61.3±9.4
20.9±2.6*
3.0±0.4**
异种免疫组
, 百拇医药 13
79.6±2.7
46.5±2.6
1.7±0.2
对照组
30
64.0±4.7
40.7±7.4
1.6±0.2
*与对照组和异种免疫组比较，P<0.01 **与对照组比较，P<0.01；与异种免疫组比较，P<0.05讨论
据文献报道，卵巢早衰的发生率为1%，而与免疫因素有关的占其中20%[3]。卵巢早衰患者血清AOA的阳性检测率在47%左右[4]。部分卵巢早衰和多囊卵巢患者卵巢组织病理检查发现，除了卵泡发育障碍外，可有淋巴细胞浸润[5]，这说明卵巢功能衰退可能与机体自身免疫功能异常有关。
, 百拇医药
本实验结果表明，自身抗原的异常刺激可导致自身反应性T细胞亚群变化，同种卵巢抗原反复免疫可使小鼠体内CD8百分比下降，而使CD4/CD8比例明显上升，导致B细胞功能异常活跃。Rabinowe等[6]曾测定自身免疫性卵巢炎患者外周血自身反应性T淋巴细胞百分比，发现有T细胞亚单位间比例改变。本实验发现，血AOA明显升高，AOA能与卵巢组织多部位发生抗原抗体反应，也证实了这一点，而过度的抗原抗体反应损伤了卵巢组织，从而影响其功能。
小鼠阴道上皮细胞周期性变化和受孕率高低可反应卵巢生殖内分泌功能。本研究发现，卵巢抗原免疫能降低性激素水平和生育率，随着主动免疫时间的延长，小鼠阴道上皮细胞周期性改变逐渐消失，甚至小鼠受孕率可降为零，卵巢也产生明显的组织病理变化，这间接说明卵巢功能因免疫而受损。
实验性自身免疫性卵巢功能衰退的病理变化与人类自身免疫性卵巢炎的临床改变和病理变化相似，而其疾病的发生与细胞免疫和体液免疫异常有关。因此，临床上对于卵巢功能降低的患者要注意其自身免疫功能的测定，以便寻找病因，对症治疗。
, 百拇医药
附图 小鼠卵巢颗粒细胞、间质细胞、卵泡内膜细胞和黄体细胞等多部位卵巢抗原抗体阳性。 免疫组化 ABC ×400
参考文献
1 Zhu X, Masamichi H, Ueda M, et al. Interspecies-specific ovarian autoantigens involved in neonatal thymectomy-induced murine autoimmune oophoritis. AJRI, 1993, 29:211-218.
2 余贺主编.临床免疫技术.上海：上海科技出版社，1982. 437-438.
3 Layman LC. Follicle-stimulating hormone beta gene structure in POF. Fertil Steril, 1993, 60:852-855.
, 百拇医药
4 Luborsky JL, Visintin I, Boyers ST, et al. Ovarian antibodies detected by immobilized antigen immunoassay in patients with premature ovarian failure. J Clin Endocrinol Metab, 1990, 70:69-75.
5 Bannatyne P, Russell P, Shearman RP. Autoimmune oophoritis: a clinicopathologic assessment of 12 cases. Int J Gynecol Pathol, 1990, 9:191-207.
6 Rabinowe SL, Berger MJ, Welch WR, et al. Lymphocyte dysfunction in autoimmune oophoritis. Am J Med, 1986, 81:347-350.
(收稿：1998-01-05 修回：1998-09-03)
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单位：200001 上海第二医科大学附属仁济医院妇产科
关键词：卵巢功能早衰；抗体生成；免疫；细胞
中华妇产科杂志981210 【摘要】 目的 探讨自身免疫性卵巢功能衰退者体液免疫和细胞免疫的变化。方法 在建立自身免疫性卵巢功能衰退小鼠动物模型基础上，测定血自身抗卵巢抗体(AOA)和T细胞亚群变化。结果 自身免疫性卵巢功能衰退小鼠辅助性-诱导性T细胞(CD+4)无明显变化，而细胞毒性-抑制性T细胞(CD+8)百分比明显下降(P<0.01)，CD4/CD8比率明显增加(P<0.05)；血清AOA阳性，并导致卵巢组织病理性损伤，性激素产生减少，生育率降低。结论 T细胞亚群比例失调、B细胞功能增强，是导致自身免疫性卵巢功能衰退的免疫病理基础。
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Determination of Cellular and Humoral Immunity in Mice of Autoimmune Ovarian Failure Lin Jianhua, Yan Junhong, Lin Qide, et al. Renji Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200001
【Abstract】 Objective To determine cellular and humoral immunity in mice of autoimmune ovarian failure. Methods A mice model of autoimmune ovarian failure was established. The percentages of help T cell (CD+4) and suppressor T cell (CD+8), the ratio of CD4/CD8 and anti-ovarian antibody (AOA) were determined. Results No significant changes were found in CD+4 fraction, but the percentage of CD+8 was reduced and the ratio of CD4/CD8 increased. AOA was positive which was probably the cause of damage of the ovarian tissues, reduction of sex hormone secretion and impaired fertility. Conclusion Autoimmune ovarian failure is correlated with the abnormal change of CD4/CD8 and the increase of B-lymphocytes function.
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【Key words】 Ovarian failure，premature Antibody formation Immunity, celluar
部分卵巢早衰者有自身免疫反应过强现象，在外周血中可测得抗卵巢抗体(anti-ovarian antibody, AOA)的存在。亦有报道病理检测发现，部分闭经或月经不调患者卵巢有淋巴细胞浸润，临床诊断为自身免疫性卵巢炎。本研究在建立自身免疫性卵巢功能衰退动物模型的基础上，测定其体液免疫和细胞免疫的变化，对该类疾病的发生机理进行初步探讨。
材料与方法
一、自身免疫性卵巢功能衰退小鼠动物模型的建立
1.卵巢抗原的制备及主动免疫：取BALB/c小鼠(鼠龄3～6月，体重30 g左右)的卵巢组织，在Tris-HCl缓冲液中将组织剪碎并研磨成匀浆，低温下超声粉碎5分钟并离心(4 000 r/min，15分钟；10 000 r/min，5分钟)，取上清液(其中蛋白含量为21.70 mg/ml)加入等量不完全福氏佐剂和卡介苗(10 mg/ml)，碾磨成乳化状，在BALB/c小鼠(鼠龄8～10周，体重20 g左右)腹部及足底多点皮下注射，总量为0.2 ml/只(含卵巢组织15 mg/只)，同时在小鼠尾静脉注射百日咳疫苗0.1 ml(10×1010ml)。每3周加强免疫1次，剂量和方法与首次免疫相同[1，2]，此为自身免疫组。取兔卵巢组织(蛋白含量为18.39 mg/ml)同法免疫小鼠，为异种免疫组。生理盐水代替卵巢抗原同法免疫小鼠为对照组。
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2.卵巢功能的测定及病理观察：主动免疫第30天后，连续观察阴道上皮细胞的周期性变化，直至周期性改变消失。小鼠按二雌一雄比例交配，两周后于免疫的第60、80和120天分别处死小鼠，冲洗子宫，了解受孕情况。卵巢行光镜、电镜检测。
二、自身AOA和T细胞亚群的测定
于首次免疫的第30、40、50、60、70、80和90天，小鼠眼眶静脉放血0.5 ml(不处死小鼠)，血清低温保存。按酶免疫组化ABC法(美国Vector公司产品)测定血AOA水平。血清1∶40稀释，Ⅱ-抗1∶50稀释。在免疫的第60、80和120天处死小鼠之前眼眶放血(肝素抗凝)，即刻应用流式细胞仪(美国Coulter公司产品，EPICS-751型)测定CD+4、CD+8和CD4/CD8。大鼠抗小鼠CD+4(抗L3T4)、CD+8(抗Lyt2)单抗和荧光标记的兔抗大鼠抗体(Ⅱ-抗)均购于北京医科大学免疫教研室。
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三、统计学方法
采用t检验。
结果
一、生殖器官病理改变和受孕率变化
免疫后的小鼠阴道涂片中细胞无周期性改变，上皮细胞体积变小，角化细胞和羊齿状结晶减少，直至消失，代之以白细胞为主。与正常卵巢相比较，光镜下免疫后生长卵泡和成熟卵泡数明显减少，卵母细胞及透明带形态异常，周边颗粒细胞排列紊乱，闭锁卵泡增多，病理损伤随免疫时间延长而加重。而电镜下早期发育的卵泡单层颗粒细胞排列尚整齐，细胞形态正常，但生长卵泡的透明带外缘不光滑，部分断裂，外缘与颗粒细胞间的裂隙增宽，周边部分颗粒细胞非放射状排列，细胞器变性，核固缩。自身免疫组较异体免疫组更为明显，对照组无明显改变。交配两周，自身免疫组无小鼠受孕，异种免疫组受孕率为23%，而对照组为80%。
二、AOA水平
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免疫第30天始AOA即阳性，抗原抗体反应所示的棕色变化可见于颗粒细胞、间质细胞、卵泡内膜细胞和黄体细胞等多部位(附图)。
三、CD+4、CD+8和CD4/CD8水平
与对照组比较，自身免疫组CD+4百分比无明显变化，CD+8的百分比明显下降(P<0.01)，CD4/CD8比率明显增加(P<0.05)。异种免疫组T细胞亚群均无明显改变(附表)。
附表 各组外周血T细胞亚群的测定(%，
) 组别, 百拇医药
只
CD4+
CD8+
CD4/CD8
自身免疫组
20
61.3±9.4
20.9±2.6*
3.0±0.4**
异种免疫组
, 百拇医药 13
79.6±2.7
46.5±2.6
1.7±0.2
对照组
30
64.0±4.7
40.7±7.4
1.6±0.2
*与对照组和异种免疫组比较，P<0.01 **与对照组比较，P<0.01；与异种免疫组比较，P<0.05讨论
据文献报道，卵巢早衰的发生率为1%，而与免疫因素有关的占其中20%[3]。卵巢早衰患者血清AOA的阳性检测率在47%左右[4]。部分卵巢早衰和多囊卵巢患者卵巢组织病理检查发现，除了卵泡发育障碍外，可有淋巴细胞浸润[5]，这说明卵巢功能衰退可能与机体自身免疫功能异常有关。
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本实验结果表明，自身抗原的异常刺激可导致自身反应性T细胞亚群变化，同种卵巢抗原反复免疫可使小鼠体内CD8百分比下降，而使CD4/CD8比例明显上升，导致B细胞功能异常活跃。Rabinowe等[6]曾测定自身免疫性卵巢炎患者外周血自身反应性T淋巴细胞百分比，发现有T细胞亚单位间比例改变。本实验发现，血AOA明显升高，AOA能与卵巢组织多部位发生抗原抗体反应，也证实了这一点，而过度的抗原抗体反应损伤了卵巢组织，从而影响其功能。
小鼠阴道上皮细胞周期性变化和受孕率高低可反应卵巢生殖内分泌功能。本研究发现，卵巢抗原免疫能降低性激素水平和生育率，随着主动免疫时间的延长，小鼠阴道上皮细胞周期性改变逐渐消失，甚至小鼠受孕率可降为零，卵巢也产生明显的组织病理变化，这间接说明卵巢功能因免疫而受损。
实验性自身免疫性卵巢功能衰退的病理变化与人类自身免疫性卵巢炎的临床改变和病理变化相似，而其疾病的发生与细胞免疫和体液免疫异常有关。因此，临床上对于卵巢功能降低的患者要注意其自身免疫功能的测定，以便寻找病因，对症治疗。
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附图 小鼠卵巢颗粒细胞、间质细胞、卵泡内膜细胞和黄体细胞等多部位卵巢抗原抗体阳性。 免疫组化 ABC ×400
参考文献
1 Zhu X, Masamichi H, Ueda M, et al. Interspecies-specific ovarian autoantigens involved in neonatal thymectomy-induced murine autoimmune oophoritis. AJRI, 1993, 29:211-218.
2 余贺主编.临床免疫技术.上海：上海科技出版社，1982. 437-438.
3 Layman LC. Follicle-stimulating hormone beta gene structure in POF. Fertil Steril, 1993, 60:852-855.
, 百拇医药
4 Luborsky JL, Visintin I, Boyers ST, et al. Ovarian antibodies detected by immobilized antigen immunoassay in patients with premature ovarian failure. J Clin Endocrinol Metab, 1990, 70:69-75.
5 Bannatyne P, Russell P, Shearman RP. Autoimmune oophoritis: a clinicopathologic assessment of 12 cases. Int J Gynecol Pathol, 1990, 9:191-207.
6 Rabinowe SL, Berger MJ, Welch WR, et al. Lymphocyte dysfunction in autoimmune oophoritis. Am J Med, 1986, 81:347-350.
(收稿：1998-01-05 修回：1998-09-03)
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