葡萄糖激酶基因与妊娠糖尿病的关系
作者：韩红敬 王山米 纪立农 韩学尧
单位：100044 北京医科大学人民医院妇产科(韩红敬，王山米)，内分泌科(纪立农，韩学尧)
关键词：糖尿病；妊娠；葡糖激酶；DNA；卫星
中华妇产科杂志990107 【摘要】 目的 探讨葡萄糖激酶(GCK)基因与妊娠糖尿病(GDM)易感性的关系。方法 采用群体关联研究的方法，应用聚合酶链反应-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对40例GDM患者(GDM组)及43例正常对照(对照组)GCK基因3′和5′端的微卫星DNA多态标记(GCK1、GCK2)，进行基因分型，并比较其等位基因、基因型和单倍型在两组中的频率分布。结果 (1)GCK1的等位基因频率及基因型频率在两组间无差别。(2)GCK2的等位基因2在GDM组显著减少(P=0.015)，等位基因3在GDM组显著增加(P=0.038)。(3)单倍型B/2在GDM组频率明显减少(P=0.003)。(4)在GDM产后患者中，有等位基因3者，比无等位基因3者的空腹血糖和口服葡萄糖耐量试验(OGTT)，2小时血糖明显增高。OGTT 2、3小时胰岛素明显降低(P<0.05)。结论 GCK基因与妊娠糖尿病有显著相关。
, 百拇医药
Association of Glucokinase Gene with Gestational Diabetes Mellitus in Chinese HAN Hongjing，WANG Shanmi， JI Linong， et al. Department of Obstetrics, People’s hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044
【Abstract】 Objective To evaluate the role of glucokinase(GCK) gene in the pathogenesis of gestational diabetes mellitus(GDM) in Chinese. Methods Two microsatellite polymorphisms, GCK1 and GCK2 which located at ～10Kb 3′ and 6Kb 5′,respectively, of the human glucokinase gene on chromosome 7p13, were genotyped in 40 unrelated gestational diabetics and 43 controls . Results Four alleles (A,B,C,D) and seven genotypes were identified at the GCK1 locus. There was no significant difference in allele and genotype frequency between GDM and control groups at the GCK1 locus. For GCK2, four alleles(1,2,3,4) and eight genotypes were detected . When compared with control subjects , the GDM group had a much less frequency of the allele 2 (51.3% vs 69.8%, χ2=5.965 , P=0.015), and a much more frequency of allele 3(31.3% vs 17.4%, χ2=4.321, P=0.038). Nine haplotypes of GCK1 and GCK2 were observed and haplotype B/2 was much less in GDM group(1.9% vs 19.4%, RR=0.078 6, P=0.003). Among the GDM patients, comparing with carriers of other alleles, the carriers of allele 3 of GCK2 locus had significantly elevated fasting and 2 hour's blood glucose levels during OGTT, and their insulin levels at 2nd and 3rd hour during the OGTT test were significantly decreased. Our results suggest that GCK gene was associated with Chinese GDM, and haplotype of GCK1/GCK2 B/2 was a protective factor for GDM.
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【Key words】 Diabetes, gestational Glucokinase DNA, satellite
妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)是常见的妊娠并发症。在妊娠妇女中的发病率约为1%～5%。葡萄糖激酶(glucokinase， GCK)是葡萄糖代谢的关键酶，在肝脏和胰岛β细胞中起葡萄糖感受器和代谢信息产生器的作用。国外研究发现，GCK基因与青少年的成人型糖尿病(MODY)家系高度连锁，并发现基因突变。提示GCK基因缺陷可能是GDM的病因之一。为探讨GCK基因与妊娠糖尿病遗传易感性的关系，本研究对GCK基因的微卫星DNA多态性位点的等位基因在GDM中的分布进行了分析比较。现报道如下。
资料与方法
一、研究对象与方法
妊娠糖尿病组为1990年1月～1996年12月在我院检查并分娩的GDM患者40例(彼此无亲缘关系)，GDM分别按75 g[1]或100 g[2]口服葡萄糖耐量试验(OGTT)标准诊断。其中38例进行了产后(4个月～74个月不等)复查，分别进行75 g OGTT试验并测定胰岛素和糖化血红蛋白；按1980年WHO糖尿病诊断标准分组。
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对照组为1996年9月～12月期间，于我院分娩并经产前检查无GDM倾向的孕妇43例(无糖尿病家族史，既往无糖尿病史及不良孕产史，本次妊娠无巨大胎儿、羊水过多，孕期50 g葡萄糖筛查正常，彼此无亲缘关系)。
二、基因分型方法
1.DNA提取：每例均取10 ml外周静脉血，用高盐沉淀法常规提取基因组DNA。
2.引物设计：GCK1、GCK2是分别位于GCK基因的3′和5′端10Kb、6.0Kb处的复合二核苷酸串联重复序列，基本结构为(TC)n(AC)n。GCK1的引物序列同文献[3]： 9509: 5′-TTGGTCAGTGTAG-GCTGAACTCATG-3′; 9510: 5′-CCCACACCAAAACTG-CCTGTATTAG-3′。GCK2的PCR引物序列同文献[4]： HGK-CA-1: 5′-AACAGATACGCTTCATCCTG-3′； HGK-CA-2: 5′-TGTCTGCAACTTACTCTTAC-3′。
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3.引物末端标记和聚合酶链反应(PCR)：对引物9510(GCK1)进行5′末端标记r-32P，每个标记体系(0.9 μl)含引物9510 7.5 pmol；T4多核苷酸激酶0.7 U及其缓冲液0.09 μl，[r-32P]-ATP 2 UCi(比活度>5 000 Ci/mmol)，三蒸水补至终体积，37℃恒温水浴1小时。PCR反应体系 (15 μl)：模板DNA 50～100 ng，已标记的引物9510体系0.9 μl，未标记引物9509 7.5 pmol，dNTP 200 μmol/L，1.5 mmol/L MgCl2，50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl (pH8.3)，Taq DNA聚合酶0.3 U，三蒸水补至终体积。PCR反应条件：94℃预变性5分钟后进入PCR循环，94℃变性、60℃退火、72℃延伸各1分钟共30个循环，72℃终延伸5分钟。对GCK2，引物HGK-CA-1进行5′末端标记，标记条件及PCR反应条件均同上。
4.基因型读取：以上PCR反应产物经5%变性聚丙烯酰胺凝胶(7 mol/L尿素)电泳，2 000V，2小时；80℃真空抽干1小时；室温下放射自显影12～24小时；读取基因型。
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三、医学统计学方法
采用χ2检验，F检验，双侧t检验，均在SAS统计软件包内进行。
结果
一、GDM组与对照组的临床特征
GDM组妊娠年龄24～39岁，平均(30.7±4.2)岁；对照组妊娠年龄21～34岁，平均(27.5±2.6)岁，GDM组较对照组妊娠年龄明显增加(P<0.01)。GDM组平均体重指数较对照组明显增加(23.38±4.09) kg/m2∶(21.23±3.1) kg/m2(P<0.01)。GDM组有糖尿病家族史的占57.5%(23/40)，提示GDM存在遗传易感性。
二、GCK1、GCK2微卫星多态性
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GCK1共出现4种等位基因，分别命名为A、B、C、D，碱基数依次递增，其中A为最常见的等位基因；并出现7种基因型。GCK2出现4种等位基因，命名为1、2、3、4，其碱基数依次递增，其中2最常见；共出现8种基因型。在GCK1和GCK2之间共产生了9种单倍型。GCK1的杂合度(HET)和多态信息量(PIC)分别为0.55、0.53，GCK2的杂合度和多态信息量分别为0.55、0.49，GCK1和GCK2的联合杂合度为0.80。GCK1和GCK2的各个基因型和单倍型均符合遗传平衡定律。
三、GCK1、GCK2微卫星DNA的等位基因、基因型和单倍型频率
1.GCK1的等位基因、基因型频率分布： GCK1的等位基因频率在GDM组与对照组间分布无显著差别(χ2=2.727，P=0.256)。等位基因B在GDM组频率比对照组有所减少(11.3%∶19.8%)，但无统计学意义(P=0.131)。GCK1的基因型频率A/B、B/B、B/C基因型分别在GDM组有所下降，但无统计学意义(P>0.05) (表1，2)。
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表1 GCK1等位基因在两组中的分布 等位基因
GDM组
对照组
RR值
P值
基因
个数
百分比
(%)
基因
个数
百分比
(%)
, http://www.100md.com
A
53
66.3
48
55.8
1.55
0.169
B
9
11.3
17
19.8
0.51
, http://www.100md.com
0.131
C
18
22.5
20
23.3
0.96
0.908
D
0
0.0
1
1.2
, 百拇医药 1.000
合计
80
100.0
86
100.0
表2 GCK1基因型频率在两组中的分布 基因型
GDM组
对照组
RR值
P值
例数
百分比(%)
, http://www.100md.com
例数
百分比(%)
A/A
17
42.5
13
30.2
1.71
0.245
A/B
6
15.0
14
, 百拇医药
32.6
0.37
0.062
A/C
13
32.5
8
18.6
2.11
0.146
B/B
1
2.5
, 百拇医药
3
7.0
0.34
0.617
B/C
1
2.5
3
7.0
0.34
0.617
C/C
2
, 百拇医药
5.0
1
2.3
2.21
0.607
C/D
0
0.0
1
2.3
1.000
合计
40
, 百拇医药 100.0
43
100.0
2.GCK2的等位基因、基因型频率分布：GCK2的等位基因频率在GDM组和对照组间分布有显著性差异(χ2=6.226，P=0.044)。与对照组相比，等位基因2在GDM组频率显著减少(51.3%∶69.8%，χ2=5.969，P=0.015)；等位基因3在GDM组频率显著增加(31.3%∶17.4%，χ2=4.321，P=0.038)。基因型2/2在GDM组频率比对照组显著减少(25%∶46.5%，χ2=4.155，P=0.042，表3，4)。
表3 GCK2等位基因在两组中的分布 等位基因
GDM组
, http://www.100md.com
对照组
RR值
P值
基因
个数
百分比
(%)
基因
个数
百分比
(%)
1
12
15.0
, 百拇医药
10
11.6
1.34
0.522
2
41
51.3
60
69.8
0.46
0.015
3
25
, 百拇医药
31.3
15
17.4
2.15
0.038
4
2
2.5
1
1.2
2.18
0.609
合计
, 百拇医药
80
100.0
86
100.0
表4 GCK2基因型频率在两组中的分布 基因型
GDM组
对照组
RR值
P值
例数
百分比(%)
例数
百分比(%)
, http://www.100md.com
1/1
1
2.5
0
0.0
0.00
0.482
2/1
6
15.0
8
18.6
0.77
, http://www.100md.com
0.061
2/2
10
25.0
20
46.5
0.38
0.042
3/1
3
7.5
2
4.7
, 百拇医药
1.66
0.668
3/2
14
35.0
11
25.6
1.57
0.350
3/3
4
10.0
1
, 百拇医药
2.3
4.67
0.191
4/1
1
2.5
0
0.0
0.00
0.482
4/2
1
2.5
, 百拇医药
1
2.3
1.08
1.000
合计
40
100.0
43
100.0
3.GCK1、GCK2的单倍型频率：单倍型出现频率在GDM组为67.5%(27/40)，对照组为72.1%(31/43)。单倍型B/2在GDM组比对照组频率明显下降(1.9%∶19.4%，χ2=8.886，P=0.003)，单倍型A/3在GDM组比对照组有所增加，但无统计学意义(22.2%∶9.7%，χ2=3.465，P=0.063，表5)。
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四、GCK1、GCK2等位基因与GDM患者临床特点的关系
1.GCK与GDM患者预后的关系：GDM组40例中38例进行了产后复查，按1980年WHO糖尿病诊断标准，16例确诊为糖尿病(42.1%)，12例糖耐量异常(IGT)(31.6%)，10例正常(26.3%)。分别比较GCK1、GCK2的等位基因，在GDM组产后糖尿病患者、IGT患者和糖耐量正常者的分布频率无显著差别(χ2=0.362，P=0.834；χ2=0.914，P=0.633)。
表5 GCK1、GCK2单倍型频率在两组中的分布 单倍型
GDM组
对照组
RR值
P值
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例数
百分比(%)
例数
百分比(%)
A/1
5
9.3
4
6.5
1.48
0.732
A/2
24
, http://www.100md.com
44.4
27
43.5
1.04
0.923
A/3
12
22.2
6
9.7
2.67
0.063
B/1
, 百拇医药
1
1.9
0
0.0
1.17
0.466
B/2
1
1.9
12
19.4
0.08
0.003
, 百拇医药
B/3
2
3.7
1
1.6
2.35
0.597
C/1
1
1.9
0
0.0
1.17
, 百拇医药 0.466
C/2
5
9.3
11
17.7
0.47
0.186
C/3
3
5.6
1
1.6
, http://www.100md.com 3.59
0.515
合计
54
100.0
62
100.0
2.GCK等位基因与糖代谢、胰岛素分泌的关系：有等位基因3(21例)与无等位基因3(19例)者，在年龄、体重指数、HbA1c、OGTT各点血糖值均无统计学差异；但OGTT1、2、3小时胰岛素水平在有等位基因3者中明显降低(P<0.05)。在糖尿病患者、IGT患者和糖耐量正常者分别比较以上参数，发现在糖尿病患者有等位基因3者(9例)，比无等位基因3者(7例)空腹及OGTT 2小时血糖明显增加(9.9±3.7) mmol/L∶(6.3±0.6) mmol/L，P=0.019；(15.9±4.4) mmol/L∶(11.2±2.2) mmol/L，P=0.020；OGTT 2、3小时胰岛素明显降低(45.8±27.4) μg/μl∶(112.5±66.1) μg/μl，P=0.015；(18.7±16.3) μg/μl∶(75.2±46.1) μg/μl，P=0.017。
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讨论
一、GCK基因与GDM的关系
本组资料提示葡萄糖激酶基因(GCK1)与GDM无明显相关；GCK2是GDM的相关因素。其中等位基因2在GDM组频率显著减少，对GDM起保护作用；等位基因3在GDM组显著增加，为GDM的易感基因。GCK1及GCK2的单倍型B/2是GDM的保护性基因，有单倍型B/2比无B/2者，GDM发生率减少了10倍。
最早在1992年Froguel等[5]发现GCK基因与大部分的法国MODY家族高度连锁。进一步研究发现已有30多种与非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)相关的GCK突变[6]。1993年Zouali等[7]报道法国GDM患者携带GCK基因突变。同年Stoffel等[8]报道，在美国(西班牙人，白种人)5%的有糖尿病家族史的GDM孕妇，携带GCK基因突变(但在美国黑种人未发现突变)。1994年Chiu等[9]报道，GCK基因与美国黑种人的GDM无显著相关，并通过PCR-SSCP技术筛查12个外显子未能发现明确的有意义的突变。提示GCK基因与GDM的关系存在种族差异。1995年Xiang等[10]报道GCK2基因与中国人的Ⅱ型糖尿病相关，我们的结论与其相一致，并且我们发现GCK1和GCK2联合检测更有意义。对台湾人的研究发现GCK1与NIDDM有关，GCK2则为无关因素[11]。因而尚待更深入的研究。
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二、GCK基因突变与胰岛素分泌的关系
GCK基因突变的临床特点是：胰岛素分泌不足，包括相对低的空腹胰岛素浓度，以及对持续性高血糖反应的下降[12]。我们的研究表明：在GDM产后DM患者，有等位基因3与无等位基因3的相比较，空腹血糖及OGTT 2小时血糖均增高；同时OGTT 2、3小时胰岛素水平降低，与以上的结论相一致。从而进一步说明GCK的不同等位基因对胰岛素分泌调节能力的不同。
另外，本组资料表明GCK1、GCK2的等位基因在产后DM患者、IGT患者、糖耐量正常者间分布无显著差别。由于我们对这些GDM患者产后未能定期进行复查，而且目前的糖耐量正常者，IGT患者距产后时间较短，以及本组资料病例较少，因而还不能得出GCK1、GCK2与GDM患者预后无明显关系的结论。
总之，GCK基因在中国的GDM发病中起一定的作用，但尚不能得出这种易感基因是否起主要作用的结论。
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参考文献
[1] Fernando A. High risk pregnancy and delivery. 1st ed. Louis: Mosby, 1984. 121-126.
[2] National Diabetes Data Group. Classification and diagnosis of diabetes mellitus and other categories of glucose intolerance . Diabetes , 1979 , 18 : 1039-1057.
[3] Matsutani A, Janssen R, Donnis-Keller H, et al. A polymorphic (CA) repeat element maps the human glucokinase gene (GCK) to chromosome 7p. Genomics, 1992,12 : 319-325.
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[4] Nishi S, Stoffel M, Xiang K, et al. Human pancreatic beta-cell glucokinase gene : cDNA sequence and localizaton of the polymorphic gene to chromosome 7, band p13. Diabetologia, 1992, 35 : 743-747.
[5] Froguel P,Vaxillaire M, Sun F, et al. Close linkage of glucokinase locus on chromosome 7p to early-onset non-insulin-dependent diabetes mellitus. Nature,1992, 356:162-164.
[6] 项坤三，钱荣立. NIDDM分子遗传学研究进展. 中国糖尿病杂志, 1996, 4 : 41-43.
, http://www.100md.com
[7] Zouali H, Vaxillaire M, Lesage S, et al. Linkage analysis and molecular scanning of glucokinase gene in NIDDM families. Diabetes, 1993, 42 : 1238-1245.
[8] Stoffel M, Bell KL, Blackburn CL, et al. Indentification of glucokinase mutation in subjects with gestational diabetes mellitus. Diabetes, 1993, 42 : 937-940.
[9] Chiu KC, Go RCP,Aoki M, et al. Glucokinase gene in gestational diabetes mellitus : population association study and molecular scanning. Diabetologia, 1994, 37 : 104-110.
, http://www.100md.com
[10] Xiang KS, Wu SH, Wang YQ. The population association of glucokinase gene with type 2 (non-insulin-dependent) diabetes mellitus in Chinese. Chinese Med J, 1995, 108 : 5-9.
[11] Wu HP, Tai TY, Chuang LM, et al. CA-repeated microsatellite polymorphism of the glucokinase gene and its association with non-insulin-dependent diabetes mellitus in Taiwanese. Diabetes Res Clin Pract,1995, 30 : 21-26.
[12] Fajans SS, Bell GT, Bowden DW, et al. Maturity-onset diabetes of the young. Life Sci, 1994, 55: 413-422.
(收稿：1997-11-24 修回：1998-09-24), 百拇医药
单位：100044 北京医科大学人民医院妇产科(韩红敬，王山米)，内分泌科(纪立农，韩学尧)
关键词：糖尿病；妊娠；葡糖激酶；DNA；卫星
中华妇产科杂志990107 【摘要】 目的 探讨葡萄糖激酶(GCK)基因与妊娠糖尿病(GDM)易感性的关系。方法 采用群体关联研究的方法，应用聚合酶链反应-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对40例GDM患者(GDM组)及43例正常对照(对照组)GCK基因3′和5′端的微卫星DNA多态标记(GCK1、GCK2)，进行基因分型，并比较其等位基因、基因型和单倍型在两组中的频率分布。结果 (1)GCK1的等位基因频率及基因型频率在两组间无差别。(2)GCK2的等位基因2在GDM组显著减少(P=0.015)，等位基因3在GDM组显著增加(P=0.038)。(3)单倍型B/2在GDM组频率明显减少(P=0.003)。(4)在GDM产后患者中，有等位基因3者，比无等位基因3者的空腹血糖和口服葡萄糖耐量试验(OGTT)，2小时血糖明显增高。OGTT 2、3小时胰岛素明显降低(P<0.05)。结论 GCK基因与妊娠糖尿病有显著相关。
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【Abstract】 Objective To evaluate the role of glucokinase(GCK) gene in the pathogenesis of gestational diabetes mellitus(GDM) in Chinese. Methods Two microsatellite polymorphisms, GCK1 and GCK2 which located at ～10Kb 3′ and 6Kb 5′,respectively, of the human glucokinase gene on chromosome 7p13, were genotyped in 40 unrelated gestational diabetics and 43 controls . Results Four alleles (A,B,C,D) and seven genotypes were identified at the GCK1 locus. There was no significant difference in allele and genotype frequency between GDM and control groups at the GCK1 locus. For GCK2, four alleles(1,2,3,4) and eight genotypes were detected . When compared with control subjects , the GDM group had a much less frequency of the allele 2 (51.3% vs 69.8%, χ2=5.965 , P=0.015), and a much more frequency of allele 3(31.3% vs 17.4%, χ2=4.321, P=0.038). Nine haplotypes of GCK1 and GCK2 were observed and haplotype B/2 was much less in GDM group(1.9% vs 19.4%, RR=0.078 6, P=0.003). Among the GDM patients, comparing with carriers of other alleles, the carriers of allele 3 of GCK2 locus had significantly elevated fasting and 2 hour's blood glucose levels during OGTT, and their insulin levels at 2nd and 3rd hour during the OGTT test were significantly decreased. Our results suggest that GCK gene was associated with Chinese GDM, and haplotype of GCK1/GCK2 B/2 was a protective factor for GDM.
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【Key words】 Diabetes, gestational Glucokinase DNA, satellite
妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)是常见的妊娠并发症。在妊娠妇女中的发病率约为1%～5%。葡萄糖激酶(glucokinase， GCK)是葡萄糖代谢的关键酶，在肝脏和胰岛β细胞中起葡萄糖感受器和代谢信息产生器的作用。国外研究发现，GCK基因与青少年的成人型糖尿病(MODY)家系高度连锁，并发现基因突变。提示GCK基因缺陷可能是GDM的病因之一。为探讨GCK基因与妊娠糖尿病遗传易感性的关系，本研究对GCK基因的微卫星DNA多态性位点的等位基因在GDM中的分布进行了分析比较。现报道如下。
资料与方法
一、研究对象与方法
妊娠糖尿病组为1990年1月～1996年12月在我院检查并分娩的GDM患者40例(彼此无亲缘关系)，GDM分别按75 g[1]或100 g[2]口服葡萄糖耐量试验(OGTT)标准诊断。其中38例进行了产后(4个月～74个月不等)复查，分别进行75 g OGTT试验并测定胰岛素和糖化血红蛋白；按1980年WHO糖尿病诊断标准分组。
, http://www.100md.com
对照组为1996年9月～12月期间，于我院分娩并经产前检查无GDM倾向的孕妇43例(无糖尿病家族史，既往无糖尿病史及不良孕产史，本次妊娠无巨大胎儿、羊水过多，孕期50 g葡萄糖筛查正常，彼此无亲缘关系)。
二、基因分型方法
1.DNA提取：每例均取10 ml外周静脉血，用高盐沉淀法常规提取基因组DNA。
2.引物设计：GCK1、GCK2是分别位于GCK基因的3′和5′端10Kb、6.0Kb处的复合二核苷酸串联重复序列，基本结构为(TC)n(AC)n。GCK1的引物序列同文献[3]： 9509: 5′-TTGGTCAGTGTAG-GCTGAACTCATG-3′; 9510: 5′-CCCACACCAAAACTG-CCTGTATTAG-3′。GCK2的PCR引物序列同文献[4]： HGK-CA-1: 5′-AACAGATACGCTTCATCCTG-3′； HGK-CA-2: 5′-TGTCTGCAACTTACTCTTAC-3′。
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3.引物末端标记和聚合酶链反应(PCR)：对引物9510(GCK1)进行5′末端标记r-32P，每个标记体系(0.9 μl)含引物9510 7.5 pmol；T4多核苷酸激酶0.7 U及其缓冲液0.09 μl，[r-32P]-ATP 2 UCi(比活度>5 000 Ci/mmol)，三蒸水补至终体积，37℃恒温水浴1小时。PCR反应体系 (15 μl)：模板DNA 50～100 ng，已标记的引物9510体系0.9 μl，未标记引物9509 7.5 pmol，dNTP 200 μmol/L，1.5 mmol/L MgCl2，50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl (pH8.3)，Taq DNA聚合酶0.3 U，三蒸水补至终体积。PCR反应条件：94℃预变性5分钟后进入PCR循环，94℃变性、60℃退火、72℃延伸各1分钟共30个循环，72℃终延伸5分钟。对GCK2，引物HGK-CA-1进行5′末端标记，标记条件及PCR反应条件均同上。
4.基因型读取：以上PCR反应产物经5%变性聚丙烯酰胺凝胶(7 mol/L尿素)电泳，2 000V，2小时；80℃真空抽干1小时；室温下放射自显影12～24小时；读取基因型。
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三、医学统计学方法
采用χ2检验，F检验，双侧t检验，均在SAS统计软件包内进行。
结果
一、GDM组与对照组的临床特征
GDM组妊娠年龄24～39岁，平均(30.7±4.2)岁；对照组妊娠年龄21～34岁，平均(27.5±2.6)岁，GDM组较对照组妊娠年龄明显增加(P<0.01)。GDM组平均体重指数较对照组明显增加(23.38±4.09) kg/m2∶(21.23±3.1) kg/m2(P<0.01)。GDM组有糖尿病家族史的占57.5%(23/40)，提示GDM存在遗传易感性。
二、GCK1、GCK2微卫星多态性
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GCK1共出现4种等位基因，分别命名为A、B、C、D，碱基数依次递增，其中A为最常见的等位基因；并出现7种基因型。GCK2出现4种等位基因，命名为1、2、3、4，其碱基数依次递增，其中2最常见；共出现8种基因型。在GCK1和GCK2之间共产生了9种单倍型。GCK1的杂合度(HET)和多态信息量(PIC)分别为0.55、0.53，GCK2的杂合度和多态信息量分别为0.55、0.49，GCK1和GCK2的联合杂合度为0.80。GCK1和GCK2的各个基因型和单倍型均符合遗传平衡定律。
三、GCK1、GCK2微卫星DNA的等位基因、基因型和单倍型频率
1.GCK1的等位基因、基因型频率分布： GCK1的等位基因频率在GDM组与对照组间分布无显著差别(χ2=2.727，P=0.256)。等位基因B在GDM组频率比对照组有所减少(11.3%∶19.8%)，但无统计学意义(P=0.131)。GCK1的基因型频率A/B、B/B、B/C基因型分别在GDM组有所下降，但无统计学意义(P>0.05) (表1，2)。
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表1 GCK1等位基因在两组中的分布 等位基因
GDM组
对照组
RR值
P值
基因
个数
百分比
(%)
基因
个数
百分比
(%)
, http://www.100md.com
A
53
66.3
48
55.8
1.55
0.169
B
9
11.3
17
19.8
0.51
, http://www.100md.com
0.131
C
18
22.5
20
23.3
0.96
0.908
D
0
0.0
1
1.2
, 百拇医药 1.000
合计
80
100.0
86
100.0
表2 GCK1基因型频率在两组中的分布 基因型
GDM组
对照组
RR值
P值
例数
百分比(%)
, http://www.100md.com
例数
百分比(%)
A/A
17
42.5
13
30.2
1.71
0.245
A/B
6
15.0
14
, 百拇医药
32.6
0.37
0.062
A/C
13
32.5
8
18.6
2.11
0.146
B/B
1
2.5
, 百拇医药
3
7.0
0.34
0.617
B/C
1
2.5
3
7.0
0.34
0.617
C/C
2
, 百拇医药
5.0
1
2.3
2.21
0.607
C/D
0
0.0
1
2.3
1.000
合计
40
, 百拇医药 100.0
43
100.0
2.GCK2的等位基因、基因型频率分布：GCK2的等位基因频率在GDM组和对照组间分布有显著性差异(χ2=6.226，P=0.044)。与对照组相比，等位基因2在GDM组频率显著减少(51.3%∶69.8%，χ2=5.969，P=0.015)；等位基因3在GDM组频率显著增加(31.3%∶17.4%，χ2=4.321，P=0.038)。基因型2/2在GDM组频率比对照组显著减少(25%∶46.5%，χ2=4.155，P=0.042，表3，4)。
表3 GCK2等位基因在两组中的分布 等位基因
GDM组
, http://www.100md.com
对照组
RR值
P值
基因
个数
百分比
(%)
基因
个数
百分比
(%)
1
12
15.0
, 百拇医药
10
11.6
1.34
0.522
2
41
51.3
60
69.8
0.46
0.015
3
25
, 百拇医药
31.3
15
17.4
2.15
0.038
4
2
2.5
1
1.2
2.18
0.609
合计
, 百拇医药
80
100.0
86
100.0
表4 GCK2基因型频率在两组中的分布 基因型
GDM组
对照组
RR值
P值
例数
百分比(%)
例数
百分比(%)
, http://www.100md.com
1/1
1
2.5
0
0.0
0.00
0.482
2/1
6
15.0
8
18.6
0.77
, http://www.100md.com
0.061
2/2
10
25.0
20
46.5
0.38
0.042
3/1
3
7.5
2
4.7
, 百拇医药
1.66
0.668
3/2
14
35.0
11
25.6
1.57
0.350
3/3
4
10.0
1
, 百拇医药
2.3
4.67
0.191
4/1
1
2.5
0
0.0
0.00
0.482
4/2
1
2.5
, 百拇医药
1
2.3
1.08
1.000
合计
40
100.0
43
100.0
3.GCK1、GCK2的单倍型频率：单倍型出现频率在GDM组为67.5%(27/40)，对照组为72.1%(31/43)。单倍型B/2在GDM组比对照组频率明显下降(1.9%∶19.4%，χ2=8.886，P=0.003)，单倍型A/3在GDM组比对照组有所增加，但无统计学意义(22.2%∶9.7%，χ2=3.465，P=0.063，表5)。
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四、GCK1、GCK2等位基因与GDM患者临床特点的关系
1.GCK与GDM患者预后的关系：GDM组40例中38例进行了产后复查，按1980年WHO糖尿病诊断标准，16例确诊为糖尿病(42.1%)，12例糖耐量异常(IGT)(31.6%)，10例正常(26.3%)。分别比较GCK1、GCK2的等位基因，在GDM组产后糖尿病患者、IGT患者和糖耐量正常者的分布频率无显著差别(χ2=0.362，P=0.834；χ2=0.914，P=0.633)。
表5 GCK1、GCK2单倍型频率在两组中的分布 单倍型
GDM组
对照组
RR值
P值
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例数
百分比(%)
例数
百分比(%)
A/1
5
9.3
4
6.5
1.48
0.732
A/2
24
, http://www.100md.com
44.4
27
43.5
1.04
0.923
A/3
12
22.2
6
9.7
2.67
0.063
B/1
, 百拇医药
1
1.9
0
0.0
1.17
0.466
B/2
1
1.9
12
19.4
0.08
0.003
, 百拇医药
B/3
2
3.7
1
1.6
2.35
0.597
C/1
1
1.9
0
0.0
1.17
, 百拇医药 0.466
C/2
5
9.3
11
17.7
0.47
0.186
C/3
3
5.6
1
1.6
, http://www.100md.com 3.59
0.515
合计
54
100.0
62
100.0
2.GCK等位基因与糖代谢、胰岛素分泌的关系：有等位基因3(21例)与无等位基因3(19例)者，在年龄、体重指数、HbA1c、OGTT各点血糖值均无统计学差异；但OGTT1、2、3小时胰岛素水平在有等位基因3者中明显降低(P<0.05)。在糖尿病患者、IGT患者和糖耐量正常者分别比较以上参数，发现在糖尿病患者有等位基因3者(9例)，比无等位基因3者(7例)空腹及OGTT 2小时血糖明显增加(9.9±3.7) mmol/L∶(6.3±0.6) mmol/L，P=0.019；(15.9±4.4) mmol/L∶(11.2±2.2) mmol/L，P=0.020；OGTT 2、3小时胰岛素明显降低(45.8±27.4) μg/μl∶(112.5±66.1) μg/μl，P=0.015；(18.7±16.3) μg/μl∶(75.2±46.1) μg/μl，P=0.017。
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讨论
一、GCK基因与GDM的关系
本组资料提示葡萄糖激酶基因(GCK1)与GDM无明显相关；GCK2是GDM的相关因素。其中等位基因2在GDM组频率显著减少，对GDM起保护作用；等位基因3在GDM组显著增加，为GDM的易感基因。GCK1及GCK2的单倍型B/2是GDM的保护性基因，有单倍型B/2比无B/2者，GDM发生率减少了10倍。
最早在1992年Froguel等[5]发现GCK基因与大部分的法国MODY家族高度连锁。进一步研究发现已有30多种与非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)相关的GCK突变[6]。1993年Zouali等[7]报道法国GDM患者携带GCK基因突变。同年Stoffel等[8]报道，在美国(西班牙人，白种人)5%的有糖尿病家族史的GDM孕妇，携带GCK基因突变(但在美国黑种人未发现突变)。1994年Chiu等[9]报道，GCK基因与美国黑种人的GDM无显著相关，并通过PCR-SSCP技术筛查12个外显子未能发现明确的有意义的突变。提示GCK基因与GDM的关系存在种族差异。1995年Xiang等[10]报道GCK2基因与中国人的Ⅱ型糖尿病相关，我们的结论与其相一致，并且我们发现GCK1和GCK2联合检测更有意义。对台湾人的研究发现GCK1与NIDDM有关，GCK2则为无关因素[11]。因而尚待更深入的研究。
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二、GCK基因突变与胰岛素分泌的关系
GCK基因突变的临床特点是：胰岛素分泌不足，包括相对低的空腹胰岛素浓度，以及对持续性高血糖反应的下降[12]。我们的研究表明：在GDM产后DM患者，有等位基因3与无等位基因3的相比较，空腹血糖及OGTT 2小时血糖均增高；同时OGTT 2、3小时胰岛素水平降低，与以上的结论相一致。从而进一步说明GCK的不同等位基因对胰岛素分泌调节能力的不同。
另外，本组资料表明GCK1、GCK2的等位基因在产后DM患者、IGT患者、糖耐量正常者间分布无显著差别。由于我们对这些GDM患者产后未能定期进行复查，而且目前的糖耐量正常者，IGT患者距产后时间较短，以及本组资料病例较少，因而还不能得出GCK1、GCK2与GDM患者预后无明显关系的结论。
总之，GCK基因在中国的GDM发病中起一定的作用，但尚不能得出这种易感基因是否起主要作用的结论。
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参考文献
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[5] Froguel P,Vaxillaire M, Sun F, et al. Close linkage of glucokinase locus on chromosome 7p to early-onset non-insulin-dependent diabetes mellitus. Nature,1992, 356:162-164.
[6] 项坤三，钱荣立. NIDDM分子遗传学研究进展. 中国糖尿病杂志, 1996, 4 : 41-43.
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[7] Zouali H, Vaxillaire M, Lesage S, et al. Linkage analysis and molecular scanning of glucokinase gene in NIDDM families. Diabetes, 1993, 42 : 1238-1245.
[8] Stoffel M, Bell KL, Blackburn CL, et al. Indentification of glucokinase mutation in subjects with gestational diabetes mellitus. Diabetes, 1993, 42 : 937-940.
[9] Chiu KC, Go RCP,Aoki M, et al. Glucokinase gene in gestational diabetes mellitus : population association study and molecular scanning. Diabetologia, 1994, 37 : 104-110.
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[10] Xiang KS, Wu SH, Wang YQ. The population association of glucokinase gene with type 2 (non-insulin-dependent) diabetes mellitus in Chinese. Chinese Med J, 1995, 108 : 5-9.
[11] Wu HP, Tai TY, Chuang LM, et al. CA-repeated microsatellite polymorphism of the glucokinase gene and its association with non-insulin-dependent diabetes mellitus in Taiwanese. Diabetes Res Clin Pract,1995, 30 : 21-26.
[12] Fajans SS, Bell GT, Bowden DW, et al. Maturity-onset diabetes of the young. Life Sci, 1994, 55: 413-422.
(收稿：1997-11-24 修回：1998-09-24), 百拇医药