脂质体-C-erbB2反义脱氧寡核苷酸对人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤生长及化疗药物敏感性的影响
作者：沈梅 丰有吉 周先荣 姚明
单位：200011上海医科大学妇产科医院(沈梅，丰有吉，周先荣);上海市肿瘤研究所(姚明)
关键词：原癌基因；寡核苷酸类；反义；卵巢肿瘤；疾病模型；动物
中华妇产科杂志990213 【摘要】 目的 探讨脂质体-C-erbB2反义脱氧寡核苷酸(C-erbB2 S-ODNs)对人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤生长及顺铂(DDP)敏感性的影响。方法 对20只裸鼠建立人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤模型，分为对照组(腹腔注射无菌水)、观察组(腹腔注射脂质体-C-erbB2 S-ODNs)、化疗组(腹腔注射无菌水及DDP)、观察+化疗组(腹腔注射脂质体-C-erbB2 S-ODNs及DDP)。治疗期间观测裸鼠体重变化，治疗结束后取瘤体称重进行电镜观察。结果 观察组抑瘤率为37%，电镜下可见细胞异染色质增多，线粒体退化。观察+化疗组抑瘤率可达50%。观察组裸鼠体重无明显改变。结论 C-erbB2反义基因治疗在卵巢癌基因治疗中有一定作用，与化疗联合应用可以取得更好的治疗效果。
, http://www.100md.com
Effect of Liposome-C-erbB2 Antisense Oligodeoxynucleotides on the Growth and the Chemotherapeutic Drug Sensitivity of Human Ovarian Cancer Transplanted in the Omentum of Nude Mice SHEN Mei，FENG Youji，ZHOU Xianrong，et al. Gynecology and Obstetrics Hospital，Shanghai Medical University，Shanghai 200011
【Abstract】 Objective To investigate the effects of liposome-C-erbB2 antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotides(S-ODNs)on the growth and the chemotherapeutic drug sensitivity of human ovarian cancer transplanted in the omentum of nude mice. Methods Human ovarian cancer transplanted in the omentum of nude mice model was established, then divided into four groups： control group, experimental group, chemotherapeutic group, and experimental +chemotherapeutic group. Different treatments were given respectively. The weight of nude mice was observed and the morphology of tumor cells was observed by electromicroscope. Results The growth inhibitory rate in the experimental group was 37%. There were more heterochromatins in the treated tumor cells. The growth inhibitory rate in the experimental+ chemotherapeutic group was increased to 50%. There was no obvious alteration in the weight of experimental group. Conclusion The data in this study suggest that antisense therapy is an useful method of gene therapy in ovarian cancer；Moreover, it could enhance the effectiveness of antitumor drug.
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【Key words】 Proto-oncogenes Oligonucleotides, antisense Ovarian neoplasms Disease models, animal
近年来，国内外学者对卵巢癌的反义基因治疗进行了探索，在体外细胞水平取得了一定的效果[1，2]。本研究采用体内治疗，观察脂质体-C-ErbB2反义脱氧寡核苷酸(C-erbB2 S-ODNs)对卵巢癌裸鼠网膜移植瘤生长及顺铂(DDP)敏感性的影响。
资料与方法
一、资料
SKOV3细胞由美国ATCC提供。C-erbB2 S-ODNs由中国科学院上海细胞生物学研究所合成，序列为5′-CAGCTCCATGGTGCT-3′，并用硫代磷酸修饰(S-ODNs)。脂质体由中国科学院上海生物化学研究所提供。DDP为山东齐鲁制药厂产品。BALC/C遗传背景的裸鼠由上海市肿瘤研究所动物室提供。透射电镜为JEM-1200EX型。
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二、方法
1.裸鼠饲养：本研究所选用的裸鼠均为4～6周龄雌鼠，体重(19.4±1.4) g，由上海市肿瘤研究所动物室饲养。
2.人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤模型的建立：(1)SKOV3细胞卵巢癌裸鼠皮下瘤形成：先将SKOV3细胞接种于裸鼠背部皮下，6周后取出瘤体，切成约2 mm×2 mm×2 mm大小瘤块，再从中选出大小接近的20块，浸于生理盐水中备用。(2)肿瘤网膜移植：受体裸鼠共20只，依次用1.25%戊巴比妥钠(45 mg/kg体重，腹腔注射)麻醉后打开腹腔，找到脾区网膜，将瘤块半包埋缝植其上，之后缝合腹腔[3]。
3.脂质体-C-erbB2 S-ODNs体内转染：肿瘤网膜移植术后第5天，将20只裸鼠称重后按随机数字分为4组，每组5只，分别给予以下处理：对照组与化疗组：腹腔注射无菌水0.6 ml；观察组与观察+化疗组：腹腔注射脂质体-C-erbB2 S-ODNs 0.6 ml(内含脂质体400 μg,C-erbB2 S-ODNs 40 μg)，每周注射1次，共3次。
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4.DDP治疗：上述处理结束后第2天，分别给予化疗组和观察+化疗组裸鼠腹腔注射DDP 0.25 mg，继续饲养6天后取瘤体称重，并进行电镜观察。
5.肿瘤超微结构的观察：将所取肿瘤标本于2.5%戊二醛中固定2小时，0.1M磷酸缓冲液冲洗后再用1%氧化锇后固定2小时。梯度乙醇脱水后用618还氧树脂没透包埋，LKBⅠ型超薄切片机切片。将切片用铀和铅双重染色后置于电镜下观察、摄片。
结 果
一、脂质体-C-erbB2S-ODNs及DDP对人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤生长的作用
观察组与对照组比较，肿瘤体积缩小，抑瘤率为37%。化疗组抑瘤率为23%。观察+化疗组抑瘤率达50%。见表1。
表1 3组裸鼠脂质体-C-erbB2 S-ODNs及DDP
, 百拇医药
对人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤生长的作用 组别
裸鼠
只数
癌瘤重量
(mg,
±s)
抑瘤率
(%)
对照组
5
118±54
观察组
5
, 百拇医药
74±29
37
化疗组
5
91±65
23
观察+化疗组
5
59±44
50
二、各组裸鼠体重的变化
观察组与对照组比较，裸鼠的体重无明显变化，而经DDP治疗后的裸鼠体重减轻。见表2。
, 百拇医药
表2 各组裸鼠脂质体-C-erbB2 S-ODNs不同作用时间
裸鼠体重的变化(g,±s) 组别
裸鼠
只数
脂质体-C-erbB2 S-ODNs 作用时间(天)
P值
0
7
14
21
对照组
, http://www.100md.com
5
19.3±1.1
20.5±1.2
20.9±1.0
21.0±1.0
观察组
5
18.4±1.3
19.8±1.2
20.9±1.1
20.9±1.2
>0.05
, 百拇医药
化疗组
5
18.4±1.0
20.0±0.7
20.9±1.0
17.4±2.4
<0.05
观察+
5
19.4±0.7
20.4±0.9
20.9±0.8
, 百拇医药 17.8±1.4
<0.05
化疗组
三、脂质体-C-erbB2 S-ODNs及DDP作用后肿瘤
细胞超微结构的改变
透射电镜检查提示，对照组肿瘤细胞符合上皮性细胞癌结构，细胞核大、浓染，分叶明显，核浆比例大，多见核分裂相，细胞器以线粒体为主(图1)。观察组肿瘤细胞异染色质增多，靠近核膜，胞浆内线粒体减少(图2)。化疗组肿瘤细胞异染色质增多，靠近核膜，线粒体退化，并可见细胞碎片。观察+化疗组肿瘤细胞异染色质凝聚，线粒体退化，胞浆中可见空泡(图3)。
图1 对照组人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤电镜下形态。肿瘤细胞核大、浓染，分叶明显，核浆比例大，细胞器以线粒体为主。 ×5 000
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图2 观察组人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤电镜下形态。肿瘤细胞异染色质增多，靠近核膜，胞浆内线粒体减少。×12 000
图3 观察+化疗组人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤电镜下形态。肿瘤细胞异染色质凝聚，线粒体退化，胞浆中可见空泡。×12 000
讨 论
一、脂质体-C-erbB2 S-ODNs对人卵巢肿瘤的生长及DDP敏感性的影响
近年来，卵巢肿瘤的反义基因治疗，国内外学者都进行了一些有意义的探索。其中，Wilhelm等[4]将尿激酶的反义脱氧寡核苷酸注入裸鼠体内，起到了抑制卵巢癌播散的作用。而大多数的研究仍局限在体外细胞培养水平。
我们以往的研究结果提示，脂质体-C-erbB2 S-ODNs可以特异性地抑制人卵巢癌细胞株SKOV3 C-erbB2蛋白的表达并抑制细胞的生长；由于脂质体的包裹，使C-erbB2 S-ODNs的作用效率大为提高。体内实验结果显示，经脂质体-C-erbB2 S-ODNs处理后的人卵巢癌细胞株SKOV3在裸鼠皮下成瘤的能力降低[5]。在上述研究的基础上，本研究进一步将该系统通过体内作用的方式，应用于人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤的治疗。结果提示，C-erbB2反义基因治疗与DDP化疗有一定的协同作用，可以提高DDP的疗效。此结果与吴令英等[6]的体外药物敏感实验结果一致。
, 百拇医药
二、脂质体-C-erbB2 S-ODNs治疗的安全性
应用反义脱氧寡核苷酸抑制异常基因的表达，是一种比较安全的方法，因为：(1)不存在外源基因整合到宿主细胞DNA分子中的过程。(2)只有肿瘤细胞才有这种异常基因的高表达，所以反义基因治疗本身就有一定的靶向性。(3)本研究所用的脂质体是由硬脂胺，即一种天然的阳离子脂质和二油酰磷脂酰乙醇胺合成，对细胞的毒性作用非常小[7]。通过对裸鼠的体重变化观察显示，应用化疗药物后，裸鼠体重明显减轻，而反义基因治疗对裸鼠体重无影响。提示，反义基因治疗具有一定的安全性，有临床应用价值。
本研究受国家自然科学基金资助(基金编号：39470724)
参考文献
1 Skiuing JS, Squatrito RC, Connor JP, et al. p53 gene mutation analysis and antisense-mediated growth inhibition of human ovarian carcinoma cell lines. Gynecol Oncol, 1996, 60:72-76.
, http://www.100md.com
2 Wiechen K, Dietel M. C-erbB2 antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotides inhibit growth and serum-induced cell spreading of p185-overexpression ovarian carcinoma cells. Int J Cancer, 1995, 63: 604-608.
3 徐丛剑，金志军，丰有吉，等. 人卵巢癌裸鼠腹腔及网膜常位移植. 现代妇产科进展，1997，6：111-112.
4 Wilhelm O, Schmitt M,Hohl S, et al. Antisense inhibition of urokinase reduces spread of human ovarian cancer in mice. Clin Exp Metastasis, 1995, 13: 296-301.
5 沈梅，丰有吉，周先荣,等.脂质体- C - erbB2反义寡核苷酸对人卵巢上皮癌裸鼠皮下移植瘤的作用. 现代妇产科进展，1998，7：314-316.
6 吴令英，吴爱如，姜琨，等. C - erbB2 反义核酸对卵巢癌细胞系生物学行为及药物敏感性的影响. 中华妇产科杂志，1996，31：169-172.
7 杨静平，孔玉英，林其谁. SA脂质体：高效介导DNA转染的新试剂. 生物化学与生物物理学报，1993，25：231-237.
(收稿：1998-02-21 修回：1998-12-02), http://www.100md.com
单位：200011上海医科大学妇产科医院(沈梅，丰有吉，周先荣);上海市肿瘤研究所(姚明)
关键词：原癌基因；寡核苷酸类；反义；卵巢肿瘤；疾病模型；动物
中华妇产科杂志990213 【摘要】 目的 探讨脂质体-C-erbB2反义脱氧寡核苷酸(C-erbB2 S-ODNs)对人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤生长及顺铂(DDP)敏感性的影响。方法 对20只裸鼠建立人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤模型，分为对照组(腹腔注射无菌水)、观察组(腹腔注射脂质体-C-erbB2 S-ODNs)、化疗组(腹腔注射无菌水及DDP)、观察+化疗组(腹腔注射脂质体-C-erbB2 S-ODNs及DDP)。治疗期间观测裸鼠体重变化，治疗结束后取瘤体称重进行电镜观察。结果 观察组抑瘤率为37%，电镜下可见细胞异染色质增多，线粒体退化。观察+化疗组抑瘤率可达50%。观察组裸鼠体重无明显改变。结论 C-erbB2反义基因治疗在卵巢癌基因治疗中有一定作用，与化疗联合应用可以取得更好的治疗效果。
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Effect of Liposome-C-erbB2 Antisense Oligodeoxynucleotides on the Growth and the Chemotherapeutic Drug Sensitivity of Human Ovarian Cancer Transplanted in the Omentum of Nude Mice SHEN Mei，FENG Youji，ZHOU Xianrong，et al. Gynecology and Obstetrics Hospital，Shanghai Medical University，Shanghai 200011
【Abstract】 Objective To investigate the effects of liposome-C-erbB2 antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotides(S-ODNs)on the growth and the chemotherapeutic drug sensitivity of human ovarian cancer transplanted in the omentum of nude mice. Methods Human ovarian cancer transplanted in the omentum of nude mice model was established, then divided into four groups： control group, experimental group, chemotherapeutic group, and experimental +chemotherapeutic group. Different treatments were given respectively. The weight of nude mice was observed and the morphology of tumor cells was observed by electromicroscope. Results The growth inhibitory rate in the experimental group was 37%. There were more heterochromatins in the treated tumor cells. The growth inhibitory rate in the experimental+ chemotherapeutic group was increased to 50%. There was no obvious alteration in the weight of experimental group. Conclusion The data in this study suggest that antisense therapy is an useful method of gene therapy in ovarian cancer；Moreover, it could enhance the effectiveness of antitumor drug.
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【Key words】 Proto-oncogenes Oligonucleotides, antisense Ovarian neoplasms Disease models, animal
近年来，国内外学者对卵巢癌的反义基因治疗进行了探索，在体外细胞水平取得了一定的效果[1，2]。本研究采用体内治疗，观察脂质体-C-ErbB2反义脱氧寡核苷酸(C-erbB2 S-ODNs)对卵巢癌裸鼠网膜移植瘤生长及顺铂(DDP)敏感性的影响。
资料与方法
一、资料
SKOV3细胞由美国ATCC提供。C-erbB2 S-ODNs由中国科学院上海细胞生物学研究所合成，序列为5′-CAGCTCCATGGTGCT-3′，并用硫代磷酸修饰(S-ODNs)。脂质体由中国科学院上海生物化学研究所提供。DDP为山东齐鲁制药厂产品。BALC/C遗传背景的裸鼠由上海市肿瘤研究所动物室提供。透射电镜为JEM-1200EX型。
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二、方法
1.裸鼠饲养：本研究所选用的裸鼠均为4～6周龄雌鼠，体重(19.4±1.4) g，由上海市肿瘤研究所动物室饲养。
2.人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤模型的建立：(1)SKOV3细胞卵巢癌裸鼠皮下瘤形成：先将SKOV3细胞接种于裸鼠背部皮下，6周后取出瘤体，切成约2 mm×2 mm×2 mm大小瘤块，再从中选出大小接近的20块，浸于生理盐水中备用。(2)肿瘤网膜移植：受体裸鼠共20只，依次用1.25%戊巴比妥钠(45 mg/kg体重，腹腔注射)麻醉后打开腹腔，找到脾区网膜，将瘤块半包埋缝植其上，之后缝合腹腔[3]。
3.脂质体-C-erbB2 S-ODNs体内转染：肿瘤网膜移植术后第5天，将20只裸鼠称重后按随机数字分为4组，每组5只，分别给予以下处理：对照组与化疗组：腹腔注射无菌水0.6 ml；观察组与观察+化疗组：腹腔注射脂质体-C-erbB2 S-ODNs 0.6 ml(内含脂质体400 μg,C-erbB2 S-ODNs 40 μg)，每周注射1次，共3次。
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4.DDP治疗：上述处理结束后第2天，分别给予化疗组和观察+化疗组裸鼠腹腔注射DDP 0.25 mg，继续饲养6天后取瘤体称重，并进行电镜观察。
5.肿瘤超微结构的观察：将所取肿瘤标本于2.5%戊二醛中固定2小时，0.1M磷酸缓冲液冲洗后再用1%氧化锇后固定2小时。梯度乙醇脱水后用618还氧树脂没透包埋，LKBⅠ型超薄切片机切片。将切片用铀和铅双重染色后置于电镜下观察、摄片。
结 果
一、脂质体-C-erbB2S-ODNs及DDP对人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤生长的作用
观察组与对照组比较，肿瘤体积缩小，抑瘤率为37%。化疗组抑瘤率为23%。观察+化疗组抑瘤率达50%。见表1。
表1 3组裸鼠脂质体-C-erbB2 S-ODNs及DDP
, 百拇医药
对人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤生长的作用 组别
裸鼠
只数
癌瘤重量
(mg,
±s)抑瘤率
(%)
对照组
5
118±54
观察组
5
, 百拇医药
74±29
37
化疗组
5
91±65
23
观察+化疗组
5
59±44
50
二、各组裸鼠体重的变化
观察组与对照组比较，裸鼠的体重无明显变化，而经DDP治疗后的裸鼠体重减轻。见表2。
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表2 各组裸鼠脂质体-C-erbB2 S-ODNs不同作用时间
裸鼠体重的变化(g,
±s) 组别裸鼠
只数
脂质体-C-erbB2 S-ODNs 作用时间(天)
P值
0
7
14
21
对照组
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5
19.3±1.1
20.5±1.2
20.9±1.0
21.0±1.0
观察组
5
18.4±1.3
19.8±1.2
20.9±1.1
20.9±1.2
>0.05
, 百拇医药
化疗组
5
18.4±1.0
20.0±0.7
20.9±1.0
17.4±2.4
<0.05
观察+
5
19.4±0.7
20.4±0.9
20.9±0.8
, 百拇医药 17.8±1.4
<0.05
化疗组
三、脂质体-C-erbB2 S-ODNs及DDP作用后肿瘤
细胞超微结构的改变
透射电镜检查提示，对照组肿瘤细胞符合上皮性细胞癌结构，细胞核大、浓染，分叶明显，核浆比例大，多见核分裂相，细胞器以线粒体为主(图1)。观察组肿瘤细胞异染色质增多，靠近核膜，胞浆内线粒体减少(图2)。化疗组肿瘤细胞异染色质增多，靠近核膜，线粒体退化，并可见细胞碎片。观察+化疗组肿瘤细胞异染色质凝聚，线粒体退化，胞浆中可见空泡(图3)。
图1 对照组人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤电镜下形态。肿瘤细胞核大、浓染，分叶明显，核浆比例大，细胞器以线粒体为主。 ×5 000
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图2 观察组人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤电镜下形态。肿瘤细胞异染色质增多，靠近核膜，胞浆内线粒体减少。×12 000
图3 观察+化疗组人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤电镜下形态。肿瘤细胞异染色质凝聚，线粒体退化，胞浆中可见空泡。×12 000
讨 论
一、脂质体-C-erbB2 S-ODNs对人卵巢肿瘤的生长及DDP敏感性的影响
近年来，卵巢肿瘤的反义基因治疗，国内外学者都进行了一些有意义的探索。其中，Wilhelm等[4]将尿激酶的反义脱氧寡核苷酸注入裸鼠体内，起到了抑制卵巢癌播散的作用。而大多数的研究仍局限在体外细胞培养水平。
我们以往的研究结果提示，脂质体-C-erbB2 S-ODNs可以特异性地抑制人卵巢癌细胞株SKOV3 C-erbB2蛋白的表达并抑制细胞的生长；由于脂质体的包裹，使C-erbB2 S-ODNs的作用效率大为提高。体内实验结果显示，经脂质体-C-erbB2 S-ODNs处理后的人卵巢癌细胞株SKOV3在裸鼠皮下成瘤的能力降低[5]。在上述研究的基础上，本研究进一步将该系统通过体内作用的方式，应用于人卵巢癌裸鼠网膜移植瘤的治疗。结果提示，C-erbB2反义基因治疗与DDP化疗有一定的协同作用，可以提高DDP的疗效。此结果与吴令英等[6]的体外药物敏感实验结果一致。
, 百拇医药
二、脂质体-C-erbB2 S-ODNs治疗的安全性
应用反义脱氧寡核苷酸抑制异常基因的表达，是一种比较安全的方法，因为：(1)不存在外源基因整合到宿主细胞DNA分子中的过程。(2)只有肿瘤细胞才有这种异常基因的高表达，所以反义基因治疗本身就有一定的靶向性。(3)本研究所用的脂质体是由硬脂胺，即一种天然的阳离子脂质和二油酰磷脂酰乙醇胺合成，对细胞的毒性作用非常小[7]。通过对裸鼠的体重变化观察显示，应用化疗药物后，裸鼠体重明显减轻，而反义基因治疗对裸鼠体重无影响。提示，反义基因治疗具有一定的安全性，有临床应用价值。
本研究受国家自然科学基金资助(基金编号：39470724)
参考文献
1 Skiuing JS, Squatrito RC, Connor JP, et al. p53 gene mutation analysis and antisense-mediated growth inhibition of human ovarian carcinoma cell lines. Gynecol Oncol, 1996, 60:72-76.
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2 Wiechen K, Dietel M. C-erbB2 antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotides inhibit growth and serum-induced cell spreading of p185-overexpression ovarian carcinoma cells. Int J Cancer, 1995, 63: 604-608.
3 徐丛剑，金志军，丰有吉，等. 人卵巢癌裸鼠腹腔及网膜常位移植. 现代妇产科进展，1997，6：111-112.
4 Wilhelm O, Schmitt M,Hohl S, et al. Antisense inhibition of urokinase reduces spread of human ovarian cancer in mice. Clin Exp Metastasis, 1995, 13: 296-301.
5 沈梅，丰有吉，周先荣,等.脂质体- C - erbB2反义寡核苷酸对人卵巢上皮癌裸鼠皮下移植瘤的作用. 现代妇产科进展，1998，7：314-316.
6 吴令英，吴爱如，姜琨，等. C - erbB2 反义核酸对卵巢癌细胞系生物学行为及药物敏感性的影响. 中华妇产科杂志，1996，31：169-172.
7 杨静平，孔玉英，林其谁. SA脂质体：高效介导DNA转染的新试剂. 生物化学与生物物理学报，1993，25：231-237.
(收稿：1998-02-21 修回：1998-12-02), http://www.100md.com