C-erbB2、nm23和p53蛋白在卵巢上皮性癌中的表达及其临床意义
作者：刘履光 杨坤禹
单位：430022 武汉，同济医科大学附属协和医院肿瘤科
关键词：卵巢肿瘤；原癌基因蛋白质C-erbB2类；蛋白质p53；基因表达
中华妇产科杂志990210 【摘要】 目的 探讨C-erbB2、nm 23和p53 3种基因蛋白在卵巢上皮性癌中表达的关系。 方法应用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接法检测70例卵巢上皮性癌石蜡切片中C-erbB2、nm23和p53蛋白的表达情况。应用Kaplan-Meier法及多变量Cox比例风险回归模型，分析这3种蛋白表达与患者预后的关系。结果 (1)C-erbB2蛋白表达率为31.4%，与其临床分期有关；nm23蛋白表达率为38.6%,其表达在有无盆腔淋巴结转移标本中有一定意义；p53蛋白表达率为34.3%，在浆液性卵巢癌中的表达率较粘液癌为高。(2)3种基因蛋白表达比较，差异无显著性(P>0.05)。(3)患者生存随访表明，C-erbB2表达患者的平均生存时间短于无表达患者；nm23和p53对生存期影响不显著。结论 C-erbB2蛋白表达与卵巢上皮性癌的恶性程度有显著相关性，对其预后有显著影响。nm23蛋白表达可能与盆腔淋巴结转移有关，p53蛋白表达与卵巢癌病理分型有关，但二者均与预后关系不显著。
A Study on C-erbB2、nm23 and p53 Expressions in Epithelial Ovarian Cancer and Their Clinical Significance LIU L
guang, YANG Kunyu. Department of Oncology, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022【Abstract】 Objective To investigate the expressions of C-erbB2、nm23 and p53 in epithelial ovarian cancer and their clinical significance. Methods Expression of C-erbB2、nm23 and p53 proteins was retros pectively studied by immunohistochemistry, and Kaplan-Meier Method and Cox's proportional hazard regression model were used to analyze the relationship of their expressions with prognosis. Results (1) The expre ssion rate of C-erbB2 was 31.4%, and was in connection with clinical stage. (2)The expression rate of nm23 was 38.6%, while it maybe correlated with perlvic lymph node metastasis.(3)The expression rate of p53 was 34.3%, and the rate was higher in serous ovarian cancer than in mucinous.(4)There was no correlation among the expression of the three proteins.(5)Survival follow-up data showed that mean survival time was shorter in patients with C-erbB2 expression than those without; and nm23 and p53 were not significantly related to survival time. Multivariate Cox's propo rtional hazard regression model analysis suggest that C-erbB2 expressi on clinical stage and residual tumor size were three variates significantly contributing to patients prognosis. Conclusions C-erbB2 expression has a close relationship with malignancy degree of epithelial ovarian cancer, and significantly contributes to prognosis. p53 expression correlates with its subtype and nm23 with its status of pelvic lymph node metastasis， however, neither contributes to prognosis.
【Key words】 Ovarian neoplasms Proto-oncogene proteins C-erbB2 Protein p53 Gene expression
C-erbB2是与表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor, EGFR)具有高度同源性的原癌基因(oncogene)。已知其过度表达与乳腺癌患者预后关系密切。nm23是近年来发现的与肿瘤转移关系密切的抑癌基因。p53基因是典型的抑癌基因, 许多肿瘤中均发现有该基因的突变和缺失。以上3种在肿瘤发生过程中功能不同的基因，均定位于人体17号染色体上。关于3种基因蛋白产物在卵巢上皮性癌中的表达及其之间的相互关系，目前有关报道较少。本研究回顾性分析了70例卵巢上皮性癌3种基因蛋白的表达及其临床意义。
资料和方法
一、 临床资料
70例卵巢癌手术标本取自同济医科大学附属同济医院和协和医院1988年6月至1995年6月收治的卵巢癌患者。所有患者均进行了肿瘤切除，其中46例进行了盆腔淋巴结清扫术，其中11例有淋巴结转移癌。70例中，浆液性癌38例，粘液性癌32例。根据FIGO (1985年)分期，Ⅰ、Ⅱ期18例，Ⅲ、Ⅳ期52例。患者平均年龄53岁(23～72岁)。同期选取正常卵巢及良性卵巢肿瘤的各10例组织标本。
二、 方法
1.试剂：兔抗人C-erbB2多克隆抗体、鼠抗人p53单克隆抗体、鼠抗人nm23单克隆抗体、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接法应用试剂盒，均由美国Maxim公司生产(购自福建迈新公司)。
2.步骤：切除标本用10%甲醛固定，石蜡包埋，蜡块以厚度4 μm连续切片，分别进行免疫组织化学(免疫组化)和HE染色。免疫组化采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SPCM)。取已知有基因蛋白表达(即切片观察为阳性)切片为阳性对照，无基因蛋白表达(即切片观察为阴性)切片作为对照者，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗。
3.结果判定：(1)C-erbB2阳性效应物质主要见于细胞膜，细胞膜染成棕黄色，少许细胞浆也可见阳性效应物沉积。镜下见阳性细胞呈片状，即1个癌巢或腺体中所有细胞均表达该蛋白，因而具有“团块状”的特点(图1)。正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤均未见着色。 (2) nm23阳性效应物质主要定位于细胞浆，可见胞浆内有棕黄色物质沉积(图2)。(3) p53阳性效应物质主要见于细胞核，可见阳性细胞核染成棕黄色，胞膜、胞浆均无着色(图3)。正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤及卵巢基质成分均无黄染。(4)反应强度：(-)为无明显阳性细胞；(+)为阳性细胞<40%；(++)为阳性细胞>40%。
图1 卵巢癌C-erbB2蛋白表达阳性。 ×400
图2 卵巢癌nm23蛋白表达阳性。 ×400
图3 卵巢癌p53蛋白表达阳性。 ×200
4.统计学方法：本研究采用SAS 6.04版Kaplan-Meier法[1]与Cox比例风险回归模式，进行患者的随访分析；统计学处理采用χ2检验法。
结 果
一、C-erbB2蛋白的表达率
C-erbB2蛋白的表达率为31.4%。 该蛋白过度表达与肿瘤的病理学分级、病理类型、患者的年龄，差异均无显著性(P>0.05)。但其过度表达与临床分期关系显著，在Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌中，C-erbB2表达率为11.1%, 低于Ⅲ、Ⅳ期患者的38.5%(P<0.05)。见表1。
表1 70例患者临床病理特征与
C-erbB2、nm 23和p53蛋白表达(例数) 类别
总例数
C-erbB2
nm23
p53
年龄(岁)
<50
29
10
12
13
>50
41
12
15
11
临床分期
Ⅰ、Ⅱ
18
2
6
9
Ⅲ、Ⅳ
52
20*
12
15
病理类型
浆液型
38
14
14
17
粘液型
32
8
13
7*
病理学分级
1、2
42
15
17
14
3
28
7
10
10
*3种基因比较，P<0.05
二、nm23蛋白的表达率
nm23蛋白的表达率为38.6%。该蛋白表达与患者的年龄、病理学分级、病理类型、临床分期等比较，差异无显著性(P>0.05)。见表1。在46例行盆腔淋巴结清扫的11例有淋巴结转移的标本中，nm23表达率为18.2% (2/11), 而在35例无淋巴结转移的标本中，nm23表达率为48.6%(17/35), 二者差异无显著性(P=0.08)。
三、p53蛋白的表达率
p53蛋白的表达率为34.3%。其中浆液性卵巢癌的p53表达率为44.7%, 粘液性卵巢癌为21.9%，二者差异有显著性(P<0.05)。p53蛋白表达与患者年龄、病理学分级、临床分期比较，差异均无显著性(P>0.05)。见表1。
四、3种基因之间的关系
3种基因比较，差异均无显著性(P>0.05)，见表2，3。
表2 70例患者C-erbB2和p53表达的关系(例数) p53表达
总例数
C-erbB2表达
阴性
阳性
阴性
46
30
16
阳性
24
16
8
表3 70例患者C-erbB2、p53与nm23表达的关系(例数) 类别
总例数
nm 23表达
阴性
阳性
p53表达
阴性
46
27
19
阳性
24
16
8
C-erbB2表达
阴性
48
26
22
阳性
22
17
5
五、3种基因蛋白表达患者的生存时间
应用Kaplan-Meier 法分析表明，C-erbB2蛋白表达患者的平均生存时间为89周，无蛋白表达患者的平均生存时间为127周(P<0.01)。有nm23蛋白表达患者的平均生存时间为115周，无表达患者平均生存时间为107周(P>0.05)。有p53蛋白表达患者的平均生存时间109周，无表达患者平均生存时间为116周(P>0.05)。讨 论
一、C-erbB2蛋白表达与卵巢上皮性癌临床及病理学的关系
目前研究表明，C-erbB2原癌基因激活(activation)主要表现为该基因的扩增或癌基因蛋白的过度表达。本研究中，C-erbB2 蛋白表达仅见于癌组织，正常卵巢组织及癌旁组织均未见表达。表明C-erbB2蛋白表达发生于细胞癌变的后期，是细胞发生恶性变的标志之一。本研究中，Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌组织中C-erbB2过表达率显著低于Ⅲ、Ⅳ期患者。有关研究发现，Ⅰ期卵巢上皮性癌C-erbB2表达率是15%～19%[2]，低于未分期卵巢癌24%～33%的表达率[3，4]。国外有研究表明，C-erbB2蛋白表达的卵巢癌患者术后虽经系统化疗，但其复发及转移时间均显著短于无该蛋白表达者[5]。表明，C-erbB2蛋白表达的卵巢上皮性癌可能恶性程度更高，肿瘤发生后迅速进入晚期，而且对化疗敏感性较差。
二、nm23蛋白表达与卵巢上皮性癌临床及病理学的关系
nm23基因，是Steeg等对转移能力不同的肿瘤细胞株，应用“克隆差异杂交法”(clone differentiation hybridization assay)时发现的一个具有抑制肿瘤细胞转移作用的基因。在具有高度转移能力的癌细胞中，该基因mRNA水平显著降低[6]。该基因由两个同源基因nm23-H1及nm23-H2构成，nm23-H1与肿瘤转移关系密切(本研究使用的是nm23-H1抗原)。
本研究中，nm23蛋白在卵巢上皮性癌中的表达率是38.6%, 与其他报道一致[7，8]。盆腔淋巴结转移阳性与阴性标本两者比较，差异无显著性(P=0.08)。但由于P接近0.05，而且考虑到以下因素：(1)本组样本例数偏小；(2)病理学检查可能遗漏了某些已经具有微转移(micrometastasis)的淋巴结。我们认为，虽然统计学处理淋巴结转移阳性与阴性比较，两者差异仅具有边缘显著意义，但nm23蛋白表达可能说明，其在乳腺癌及宫颈癌中有类似的肿瘤转移抑制作用[9，10]，对此仍有待进一步研究。
三、p53蛋白表达与卵巢上皮性癌临床及病理学的关系
本研究中，p53蛋白表达仅与卵巢上皮性癌病理学类型具有相关关系。目前研究表明，p53基因作为细胞调节通路中的一个重要抑癌基因，该基因突变(即蛋白过度表达)常可导致肿瘤细胞对放、化疗的敏感性降低[11]，从而导致患者生存期缩短。但在本研究中，未发现这种相关性。
四、C-erbB2、nm23和p53蛋白表达之间的关系
关于C-erbB2、nm23和p53蛋白表达之间的关系尚未见报道。本研究也未发现p53与C-erbB2之间具有相关关系，C-erbB2作为一个原癌基因，其激活并非由于p53抑制作用减弱所引起。Liotta等曾报道，体外将C-erbB2基因导入卵巢癌细胞株中，发现nm23 mRNA表达水平降低[12]。p53和nm23间也无明确的相关性。因而我们认为，虽然这3种基因位于同一号染色体上，且位置互相毗邻，但其蛋白表达异常均由不同的病因所引起。对其各自的病因，有待进一步研究。
五、卵巢上皮性癌患者的生存随访分析
应用Kaplan-Meier法表明，有C-erbB2蛋白表达患者的生存期显著缩短；有nm23蛋白表达患者的生存期长于无表达患者，但不显著；p53对生存期的影响也不显著。经多变量Cox比例风险回归模式分析表明，C-erbB2的表达、术后残存瘤大小、临床分期是3个对患者生存期有显著意义的指标，说明C-erbB2表达的卵巢上皮性癌恶性程度高，患者预后差。
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(收稿：1998-04-02 修回：1998-10-19)