閻犲洤鍢查崢娑㈡儌鐠囪尙绉�
四种补肾中药对去卵巢大鼠骨质疏松骨形态的作用
作者：马中书 王蕊 邱明才 李玉坤 郑方遒 张鑫
单位：300052 天津医科大学总医院天津市内分泌研究所
关键词：阉割；骨质疏松；绝经后；骨密度；骨碎补；锁阳
中华妇产科杂志990205 【摘要】 目的 比较骨碎补、锁阳、淫羊藿和狗脊4种补肾中药对去卵巢(OVX)大鼠骨质疏松的作用。方法 将54只3月龄雌性Wistar大鼠随机分成模型组和中药治疗组。模型组包括非手术组、假手术组和去卵巢组，每组10只；中药组包括骨碎补组、锁阳组、淫羊藿组和狗脊组，每组6只。去卵巢手术后1周，中药组分别用上述4种中药喂养，8周后放血处死全部小鼠，用骨形态计量学方法比较4种中药对OVX大鼠骨质疏松的防治作用。结果 与假手术组相比，去卵巢组的骨小梁体积占全部骨组织体积百分比明显减低(P<0.01)。腰椎骨密度显著降低(P<0.05)。与去卵巢组相比，骨碎补组和淫羊藿组的骨小梁体积占全部骨组织体积的百分比明显增加(P<0.05)；锁阳组与狗脊组增加不显著(P>0.05)。骨碎补组的四环素双标记表面低于去卵巢组(P<0.05)。淫羊藿组类骨质百分比明显高于去卵巢组(P<0.01)。结论 4种中药对OVX大鼠骨质疏松均有不同程度的防治作用，但以骨碎补和淫羊藿最为显著。
Study of Morphologic Effects of 4 Chinese Herbs by Bone Histomorphometry in Ovariectomized Rats MA Zhongshu, WANG Rui, QIU Mingcai, et al. General Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300052
【Abstract】 Objective To study the therapeutic effects of Chinese herbs Drynaria, Cynomorium, Epimedium and Chain Fern on osteoporotic ovariectomized (OVX) rat models. Methods 54 Wistar female rats at the age of 3 months were randomly divided into 2 groups: control groups and experimental group. The control group included: normal groups (N), Shamed oprations group(S) and ovariectomized group (OVX) (10 in each group); The experimental group: group A (Drynaria), group B (Cynomorium), group C (Epimedium) and group D (Chain Fern) (6 in each group). Each of the experimental groups was fed separately with the 4 Chinese herbs (0.25 g/100 g B.W/day) respectively by mouth every day for 2 months. Double tetracycline labels were carried out on these animals before the sacrifice. Their left tibia was reserved for the preparation of bone specimen and was studied by bone histomorphometry. Results The percentage of trabecular volume in total bone volume (TV/TBV) decreased significantly in OVX rats as compared with shame group (P<0.01). However, after treatment with Drynaria or Epimedium, TV/TBV increased significantly as compared with that before treatment (P<0.05). The surface area of tetracycline label in Drynaria group lowered and osteoid percentage increased in Epimedium group. Conclusions The 4 Chinese herbs have some therapeutic effects on osteoporotic rat models. Drynaria and Epimedium appeared to work better.
【Key words】 Castration Osteoporosis, postmenopausal Bone density Drynaria fortunei Cynomorium songaricum
绝经后骨质疏松(postmenopausal osteoporosis, PMO)是老年妇女常患的一种代谢性骨病。随着我国人均寿命的延长，PMO的发病率呈上升趋势。现代医学对绝经后骨质疏松的治疗方法主要是雌激素替代疗法，但长期使用有一定副作用[1，2]。因此，选用毒副作用小的中药治疗绝经后骨质疏松已成为一个研究热点。目前，国内有关这方面的报道较多，但多为复方制剂，且疗效难以肯定[3-5]。我们根据中医肾主骨的理论，用骨形态计量学方法观察4种常用的补肾壮阳中草药防治去卵巢(OVX)大鼠骨质疏松的作用，探索补肾中药防治PMO的作用机理，从中选出防治PMO的有效药物。
材料与方法
一、材料
(一)实验动物
选取54只雌性Wistar大鼠(由中国军事医学科学院天津动物实验中心提供)，平均月龄3个月，体重(200±30) g，随机分为模型组和中药治疗两组。模型组大鼠30只，随机分为非手术组、假手术组和去卵巢组(每组10只)。中药治疗组24只，随机分为骨碎补组、锁阳组、淫羊藿组和狗脊组(每组6只)。所有大鼠均喂养于不锈钢金属笼内，每笼不多于4只，室温在(24±2)℃，自由摄入相同的固体饲料和自来水。
(二)实验药物
1.中草药：从我院中药房购得骨碎补、锁阳、淫羊藿和狗脊各0.5 kg。
2.盐酸四环素：上海制药厂生产，每支0.25 g。
3.Villanueva骨染色剂、乙醇、丙酮、聚甲基丙烯酸甲酯等。
二、方法
(一)中草药的煎制
将4种中药分别倒入容量为5 000 ml的大烧瓶内，加蒸馏水2 000 ml浸泡15分钟后用温火煮沸半小时，剩汁1 000 ml，用无菌纱布过滤。残余药渣再加蒸馏水1 500 ml再煎半小时，剩汁750 ml。两次共得原汁1 750 ml，加蒸馏水稀释至2 000 ml，分装在4个无菌瓶中，-4℃保存。每毫升药液中含生药0.25 g。
(二)造模
将大鼠用乙醚麻醉，无菌操作，经腰椎旁切口进入大鼠腹腔背侧，将去卵巢组、骨碎补组、锁阳组、淫羊藿组和狗脊组的大鼠双侧卵巢完全切除，假手术组不切卵巢，止血缝合。术后摄食和饮水如前。1周后中药治疗组开始经口灌服单剂中药，每100 g体重每天1 ml(含生药0.25 g)，每天1次。给药剂量每周按体重校正1次，共喂养、给药8周。8周后处死全部大鼠。
(三)四环素双标记
于处死前第10天和第2天用盐酸四环素灌胃，每天30 mg/kg，进行四环素荧光双标记。
(四)骨标本的制备
喂养8周后股动脉放血处死大鼠。留取左侧胫骨近端2/3，去除所有软组织，用水砂纸沿纵向将两侧骨标本磨平，暴露骨髓腔，然后放入0.5%的Villanueva染色剂中染色5天。乙醇梯度脱水，丙酮脱脂，聚甲基丙烯酸甲酯包埋剂包埋骨标本。待组织块变硬后，用低速锯沿胫骨暴露面纵向锯成约300 μm厚骨片，用水砂纸将骨片仔细研磨成100 μm厚的薄片，脱水、透明后封片。
(五)骨形态计量学参数的测量和计算
在Olympus荧光显微镜下用Opton半自动图像处理系统测量距骺板线至远端5mm范围内骨磨片的形态学和动力学参数。
1.骨组织形态学参数：(1)骨小梁体积占全部骨组织体积的百分比[TBV/TTV(%)]；(2)骨小梁表面和其体积之比[S/V(mm2/mm3)]；(3)骨小梁体积占海绵骨体积的百分比[TBV/SBV(%)]；(4)平均骨小梁板厚度[MTPT(μm)]，MTPT=TBV/TBS×2 000；(5)平均骨小梁板密度[MTPD(/mm2)]，MTPD=(TBV/SBV)×(10/MTPT)；(6)平均骨小梁板间隙[MTPS(μm)]，MTPS=(1000/MTPD)-MTPT；(7)平均骨皮质厚度[MCW(μm)]。
2.动力学参数:(1)四环素单标记线占骨小梁表面的百分比[Sfract(s)(%)]；(2)四环素双标记线占骨小梁表面的百分比[Sfract(d)(%)]；(3)四环素单标记线的1/2和双标记线之和占骨小梁表面的百分比[Sfract(s/2+d)(%)]；(4)四环素双标记线间的平均距离[DDL(μm)]；(5)骨小梁类骨质表面占骨小梁表面的百分比[TOS(%)]；(6)平均类骨质宽度[MOSW(μm)]；(7)矿化沉积率[MiAR(μm/d)]，MiAR=(DDL×π/4)/11；(8)矿化延迟时间[MLT(d)]，MLT=MOSW/MiAR；(9)组织水平的骨形成率[Svf(μm3/μm2/d)]，Svf=MiAR×Sfract(s/2+d)；(10)类骨质成熟时间[OPM(d)]，OPM=MOSW/Svf。
(六)骨密度(BMD)的测定
去势8周后，腹腔内注射10%的水合氯醛(0.75 ml/100 g)，麻醉后用双能X线吸收测量仪测定大鼠腰椎BMD。
三、统计学方法
所有参数均以
±s表示，使用SPSS 6.0统计软件进行多均值单因方差分析，用SNK法进行两两比较。结 果
一、各组大鼠实验前、后体重和实验后BMD的变化
实验前，各组间大鼠体重差异无显著性。处死前,与假手术组和非手术组相比，去卵巢组体重显著增加，且差异有显著性(P<0.01)；淫羊藿组体重明显低于去卵巢组，差异有显著性(P<0.05)，但与非手术组和假手术组之间差异无显著性。实验完成后，非手术组和假手术组的BMD明显高于去卵巢组(P<0.05)。与去卵巢组比较，中药治疗组BMD有增加趋势，差异无显著性(P<0.05)。见表1。
表1 各组大鼠体重的变化和BMD比较(
±s) 组别只数
体重(g)
BMD(g/cm2)
实验前
实验后
非手术组
10
191.2±31.4
279.8±36.5*
0.175±0.016**
假手术组
10
194.8±17.4
262.4±21.5*
0.173±0.020**
去卵巢组
10
185.4±28.4
332.4±56.5
0.146±0.019
骨碎补组
6
196.2±49.1
325.6±18.4
0.153±0.014
锁阳组
6
189.9±27.2
331.6±20.1
0.155±0.025
淫羊藿组
6
200.3±35.6
298.1±32.3**
0.162±0.017**
狗脊组
6
193.0±33.3
322.6±32.7
0.158±0.024
注：与去卵巢组比较，*P<0.01 **P<0.05
二、各组大鼠胫骨近侧干骺端骨形态学和动力学参数比较
1.切除卵巢对骨结构的影响：形态学参数的结果表明，非手术组和假手术组各参数间差异无显著性(P>0.05)。与非手术组和假手术组相比，去卵巢组大鼠的骨量明显减少，即TBV/TTV和TBV/SBV明显降低(P<0.01)，MTPS增加(P<0.01)，骨皮质厚度变薄(P<0.01)。代表骨形成的参数Sfract(s)、Sfract(d)、Sfract(s/2+d)和TOS有增加趋势，但差异无显著性(P>0.05)，而OPM降低(P<0.01)。见表2，3。
表2 各组大鼠胫骨干骺端形态计量学参数比较(
±s) 组别只
数
TBV/TTV
(%)
S/V
(mm2/mm3)
TBV/SBV
(%)
MTPT
(μm)
MTPD
(/mm2)
MTPS
(μm)
MCW
(μm)
非手术组
10
18.1±2.2*
33.2±2.7
21.4±1.9*
52.8±3.4
4.1±0.5*
195.9±30.4*
240.0±53.7*
假手术组
10
18.4±2.5*
32.4±3.0
21.1±2.2*
57.2±3.5
3.7±0.5*
217.1±35.5*
246.5±33.0*
去卵巢组
10
11.2±2.8
34.3±2.9
12.8±3.3
58.7±4.9
2.2±0.7
425.1±125.0
177.7±41.3
骨碎补组
6
16.3±3.7**
26.8±1.2*
18.7±3.9**
63.5±3.0
3.0±0.6**
291.2±87.4**
247.0±34.1*
锁阳组
6
14.7±2.4
28.9±3.2
17.1±2.9
63.1±7.8
2.7±0.3
309.9±44.4
227.7±21.0
淫羊藿组
6
16.1±4.3**
33.7±3.2
19.7±5.2*
59.8±5.7
3.6±1.0*
243.7±87.3**
215.7±37.5
狗脊组
6
15.0±2.8
30.9±3.0
16.9±3.4
55.2±6.2
3.1±1.0**
285.6±79.6**
240.0±34.9*
注：与去卵巢组比较，* P<0.01 **P<0.05表3 各组大鼠胫骨干骺端动力学参数比较(
±s) 组别只
数
Sfract
(s)(%)
Sfract
(d)(%)
Sfract
(s/2+d)(%)
DDL
(μm)
TOS
(%)
MOSW
(μm)
MiAR
(μm/d)
MLT
(d)
Svf
(μm/d)
OPM
(d)
非手术组
10
2.3±0.8
1.0±0.1
2.1±0.4
5.9±0.6
0.6±0.3
2.8±0.5
0.42±0.04
6.4±0.7
0.9±0.2
30.0±4.3*
假手术组
10
2.5±1.4
0.9±0.3
2.1±0.7
7.1±0.9
0.6±0.2
3.6±0.3
0.51±0.06
7.3±1.1
1.2±0.3
30.1±5.5*
去卵巢组
10
3.0±1.2
2.0±1.3
3.5±1.6
7.5±1.2
1.1±0.8
2.9±0.3
0.54±0.09
5.2±0.5
1.9±1.0
15.9±5.0
骨碎补组
6
1.2±0.7**
2.1±0.8
2.8±0.9
8.2±1.0
0.9±0.1
3.8±0.8
0.59±0.07
6.0±0.4
1.6±0.4
25.8±12.9**
锁阳组
6
1.7±0.9
1.9±0.7
2.9±1.0
8.8±0.4
1.4±0.3
4.1±0.9
0.62±0.04
6.6±1.4
2.2±1.1
23.0±13.1
淫羊藿组
6
2.3±0.5
2.5±2.1
3.5±2.3
8.7±1.0
2.4±1.6*
4.5±0.9
0.62±0.07
7.4±2.2
2.1±1.3
28.2±6.7**
狗脊组
6
1.7±1.2
1.9±1.2
2.8±1.4
8.3±0.4
2.2±0.6
4.1±0.6
0.59±0.03
6.9±1.2
1.6±0.8
24.1±10.4
注：与去卵巢组比较，*P<0.01 **P<0.05 2.补肾中药对骨结构的影响：从表2可以看出，与去卵巢组相比，骨碎补组、淫羊藿组的TBV/TTV、TBV/SBV、MDPD和MCW明显增加，而MTPS显著减少(P<0.01)。骨碎补组的S/V显著低于去卵巢组(P<0.01)。各中药组的MTPD均高于去卵巢组，但差异无显著性(P>0.05)。
与去卵巢组相比，骨碎补组Sfract(s)降低显著(P<0.05)。淫羊藿组TOS显著高于去卵巢组(P<0.01)。骨碎补组和淫羊藿组的OPM明显高于去卵巢组(P<0.05)。
讨 论
去卵巢后大鼠体重明显增加。这可能因雌激素减少、大鼠活动减少所致。体重增加可部分抑制去卵巢大鼠的骨丢失[6]。淫羊藿能抑制去卵巢后雌激素减少所至的体重增加，使体重维持在正常水平。实验后去卵巢组大鼠的BMD明显低于假手术组和非手术组，说明大鼠骨质疏松模型建立成功。
用去卵巢大鼠建立骨质疏松模型来研究妇女PMO已被国际上公认和广泛采纳[7,8]。本实验选用3月龄大鼠，手术切除双侧卵巢以诱导骨质疏松的发生。去势大鼠骨小梁厚度和骨小梁相对体积均减少，皮质骨平均厚度变薄，表明骨丢失存在。去卵巢后8周骨形成表面，四环素标记表面和骨矿化率均增加，提示骨转换加快。尽管骨形成率增加，但骨小梁减少，提示破骨细胞活性增强，骨吸收加强。即去卵巢既导致骨吸收增加，又导致骨形成增加。由于骨吸收丢失的骨量超过骨形成的骨量，导致骨转换的负平衡，是高转换型骨质疏松的特有表现[9]。
与去卵巢组相比，骨碎补组与淫羊藿组的TBV/TTV、TBV/SBV、MCW和MTPD增加，而MTPS减少，说明骨碎补和淫羊藿可以阻止大鼠去卵巢后雌激素减少所致的骨丢失，其机理为增加骨小梁宽度和密度，减少骨小梁间隙。从骨动力学参数看，与去卵巢组相比，骨碎补的Sfract(s)显著降低，而Sfract(d)、Sfract(s/2+d)和TOS均有下降趋势，OPM明显延长，说明骨碎补防止去卵巢后骨丢失主要是通过降低骨转换率来实现的。淫羊藿组骨形成指标明显增加，表现为TOS百分比显著高于去卵巢组，四环素标记表面也有增加趋势。OPM明显延长说明，淫羊藿不但抑制骨吸收，而且还可以刺激骨形成，从而有效地预防去卵巢所致骨质疏松的发生。具有类雌激素样作用[10-13]。
锁阳组与狗脊组对去卵巢大鼠骨量丢失的防治作用似乎不甚明显，但也显示出骨量增加的趋势。与去卵巢组相比，其四环素标记和TOS均有增加趋势，提示它们可能有增加骨激活频率和刺激骨形成的作用。根据骨形态学和动力学参数的测定结果，我们认为，骨碎补、淫羊藿防治去卵巢大鼠骨丢失的作用优于锁阳和狗脊。由于所用中药剂量不大且观察的时间较短，补肾中药防治去卵巢大鼠骨质疏松的药效和剂量之间的关系，还有待进一步研究。
本研究受天津市自然科学基金资助
参考文献
1 Colditz GA, Hankinson SE, Hunter DJ, et al. The use of estrogen and progestins and the risk of breast cancer in postmenopausal women. N Eng J Med, 1995, 332:1589-1593.
2 Grady D, Gebretsadik T, Kelikowske K, et al. Hormone replacement therapy and endometrial cancer risk: a meta-analysis. Obstet Gynecol, 1995, 85:304-313.
3 廖进民，李青南，谢华，等.中药补骨2号对去势雌性大鼠骨代谢影响的研究.中华老年医学杂志，1995，15：113-115.
4 黄宏昌，陈训华.中医药防治骨质疏松的分析与对策.中国中西医结合杂志，1996，16：498-500.
5 蒋淑媛，高亚平，吴林生，等.骨疏康颗粒治疗骨质疏松症的临床观察.中国骨质疏松杂志，1995，1：167-169.
6 Wronski TJ, Schenck PA, Cintron M, et al. Effect of body weight on onsteopenia in ovariectomized rats. Calcif Tissue Int, 1987, 40:155-159.
7 Kalu D. The ovariectomized rat model of postmenopausal bone loss. Bone Miner, 1991, 15:175-192.
8 顾增发，沈琰，林风如.用切除卵巢大鼠建立骨质疏松模型的研究.中华老年医学杂志，1989，8：118-120.
9 Riggs BL, Melton LJ. Clinical review 8: clinical heterogeneity of involutional osteoporosis: implications for preventive therapy. J Clin Endocrinol Metab, 1990, 70:1229-1232.
10 Parfitt AM, Mundy GR, Roodman GD, et al. Estrogen maintains trabecular bone volume in rats not only by suppression of bone resorption, but also by stimulation of bone formation. J Clin Invest, 1992, 89:74-78.
11 Bain SD, Bailey MC, celino DL, et al. High-dose estrogen inhibits bone resorption and stimulates bone formation in the ovariectomized mouse. J Bone Miner Res, 1993, 8:435-442.
12 Chow JWN, Lean JM, Chambers JJ. 17β-estradiol stimulates cancellous bone formation in female rats. Endocrinol,1992, 130:3025-3032.
13 李青南，吴铁，谢华，等.淫羊藿提取液对去睾大鼠骨代谢的影响.中草药，1993，24：637-638.
(收稿：1998-05-01 修回：1998-09-26)