应用荧光原位杂交技术诊断羊水细胞染色体异常
作者：黄艳仪 孙筱放 黎青 麦卫阳 郑育红 陈元本
单位：510150 广州市第二人民医院妇产科
关键词：原位杂交；荧光；染色体异常；产前诊断；羊水
中华妇产科杂志990308 【摘要】 目的 探讨荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)于产前诊断羊水细胞染色体异常的实验方法及应用价值。方法 对34例孕16～23周有产前诊断指征者经腹部抽取羊水，用Chang培养液传代培养，常规制备羊水细胞分裂中期染色体，应用生物素及地高辛标记的人类全着丝粒探针和X、Y、13、21、18号染色体α-着丝粒探针及染色体全涂染探针，与培养的羊水细胞分裂中期染色体DNA进行原位杂交，杂交后用荧光显微镜观察玻片并摄像。结果 34例产前诊断者其羊水细胞分裂中期染色体的核型种类有正常核型46，XX 15例，46，XY 16例，异常核型有47，XY+21、47，XY+18、45，X/46，X，r(X)各1例。3例异常核型治疗性流产后取脐血，25例正常核型追踪至足月分娩时取脐血采用FISH及G带染色体检查证实，与产前羊水细胞染色体检查相符。 结论FISH用于羊水细胞染色体产前诊断具有快速、准确等优点，特别对染色体结构异常与来源不明的标记染色体诊断，具有更高的敏感性和可靠性。
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Application of Fluorescence Insitu Hybridization Technique for Prenatal Diagnosis of Chromosome Abnormality in Amniotic Cells HUANG Yanyi, SUN Xiaofang, LI Qing, et al. Second Municipal People's Hospital of Guangzhou, Guangzhou 510150
【Abstract】 Objective To study the technique and diagnostic value of fluorescence insitu hybridization (FISH) in chromosome abnormality for prenatal diagnosis. Methods Amniocenteses were performed in 34 pregnant women of 16～23 gestational weeks with indications for prenatal diagnosis. The amniotic fluid samples were cultured in Chang's medium. The metaphase chromosomes were hybridized insitu with the human centromere probes, α-satellites DNA probes of X, Y,13, 21, 18 chromosomes and all primer chromosome probes. These probes were conjugated by Biotin and Dioxin then. The treated slides were examined and taken photos under the fluoromicroscope. Results By FISH technique, normal karyotypes were shown in 31 cases: 16 cases of 46, XY, 15 cases of 46, XX. Abnormalities were found in 3 patients which were 47, XY+21; 47, XY+18 and 45, X/46, X,r (X)respectively. Conclusion Using FISH technique to detect chromosome abnormalities in amniotic fluid for prenatal diagnosis is a reliable method which is rapid and accurate. It has higher sensitivity and specificity in finding chromosome structure abnormalities and marking chromosome DNA sequences.
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【Key words】 In situ hybridization, fluorescence Chromosome abnormalities Prenatal diagnosis Amniotic fluid
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是分子杂交与组织化学相结合的一项新技术，近年来用于人类染色体分析，它能快速、准确地确定在传统方法中无法判别的染色体异常，特别对来源不明的标记染色体(marker chromosome)能作出正确诊断[1，2]。有作者应用FISH方法分析绒毛间期细胞染色体，虽具有快速的优点，但其只能分析染色体数目异常，不能分析结构异常，不能准确诊断胎儿染色体核型，且受杂交率限制，有一定的局限性。我们通过提高羊水细胞培养和制片技术，采用Chang培养基，通过传代培养，获得数量较多的羊水细胞分裂中期相，成功地将FISH技术用于羊水细胞分裂中期染色体诊断。现报道如下。
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资料与方法
一、资料来源
1.研究对象：选择1996年1月至1998年1月，在我院优生门诊需进行产前诊断者34例。年龄25～43岁，孕周16～23周。产前诊断指征包括孕妇年龄≥35岁16例；不良分娩史11例；围产期感染2例；B超发现胎儿畸型2例；孕妇或其丈夫为染色体平衡易位2例；接受X线照射1例。
2.羊水采集：在B超腹部穿刺探头引导下，用20G腹部穿刺针抽取羊水20 ml，置无菌试管中待检。
二、实验方法
1.羊水细胞培养及收获：取20 ml羊水离心，取沉淀物0.5 ml加入4.5 ml张氏培养液，在培养瓶内混匀，放入37℃， 5% CO2培养箱内培养，5天后隔天观察换液，10～12天传代培养，用EDTA胰酶洗脱细胞后再加入培养液培养过夜，按常规收获细胞。羊水细胞G带染色体制备按常规进行。
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2.羊水细胞FISH检测：常规滴片，放入2倍氯化钠，柠檬酸钠溶液(SSC)中37℃30分钟，再分别放入70%、90%、100%冰乙醇中各2分钟。70%甲酰胺(pH 7.0)(72±2)℃ 2分钟。然后再分别放入70%、90%、100%冰乙醇中各2分钟。将变性的探针涂到玻片上，加盖玻片，周围封胶，37℃过夜。然后在50%甲酰胺/2倍SSC液中(37℃)浸泡2次，各5分钟；2倍SSC液中2次，各5分钟，磷酸缓冲液(PBS)中1次5分钟，放入地高辛标记的荧光素50 μl，37℃，5分钟，PBD 5分钟2次。兔抗血清50 μl， 37℃ 15分钟，PBD 5分钟2次。荧光标记的抗兔血清50 μl， 15分钟，37℃ PBD 5分钟2次。加碘化丙啶15 μl于玻片上，加盖玻片，于BX 60荧光显微镜下观察并摄片。
3.探针选择：每例分别用人类全着丝粒探针及X、Y、13、21、18号染色体着丝粒探针进行FISH，1例18，三体选用18号染色体全涂染探针，1例拟诊X染色体异常者选用X染色体全涂染探针杂交。
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结 果
一、羊水细胞染色体检测结果
34例产前诊断者羊水细胞染色体检测，正常核型31例，其中46，XX 15例、46，XY 16例；异常核型3例，其中有47，XY+21、47，XY+18各1例；1例羊水细胞染色体G带分析为45，X/46，X，mar标记染色体，来源不明，经FISH证实为45，X/46，X,r(X)，mar为X环形染色体。见表1。羊水细胞染色体FISH正确杂交率在96%以上。
表1 3例孕妇羊水细胞染色体异常标本的FISH结果 病
例
核 型
探
针
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计数核
(个)
1个荧光
点(%)
2个荧光
点(%)
3个荧光
点(%)
4个荧光
点(%)
临床诊断
例1
47，XY+18
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18
100
1
2
96
1
18，三体
例2
47，XY+21
21
100
0
3
, http://www.100md.com 96
1
21，三体
例3
45，X/46，X,r(X)
X
100
33
63
2
2
45，X/46，X，r(X)嵌合体
1例孕20周，将分裂中期羊水细胞染色体用人类全染色体着丝粒探针杂交，见染色体总数47条，用21、13、18、X、Y着丝粒探针杂交，见21、13号染色体各有2点发黄光。18号染色体有3点发黄光。X、Y染色体各有1点发黄光。证实为47，XY+18。再用18号染色体全涂染探针杂交，见3条18号染色体全部发黄光，证实为18，三体。
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1例常规羊水细胞染色体G带分析见45，X/46，X，mar标记染色体，未能明确辨认。应用FISH在染色体分裂中期，用21、13、18、X、Y着丝粒探针杂交，见mar染色体是X环形染色体，发黄光，证实是46，X，r(X)，此标记染色体是X环形染色体。患者是45，X/46，X，r(X)嵌合体。
二、临床追踪结果
对产前羊水细胞染色体异常的3例行治疗性流产，胎儿娩出后取脐血染色体G带行FISH检测，与产前诊断相符。产前羊水细胞染色体正常者追踪其新生儿25例，取脐血行染色体G带及FISH检测，其核型与产前诊断全部相符，临床符合率为100%。
讨 论
FISH是利用已知碱基序列的非同位素标记的核酸探针，依据碱基互补配对原理，通过荧光亲和素免疫组化检测体系，在组织切片、细胞间期核及染色体等标本上，对待测核酸进行定性、定位及相对定量分析的一种方法。是分子杂交与组织化学相结合的一项新技术。近年来，用于人类染色体分析，是细胞遗传学与分子生物学相结合的一大进展，能够快速、准确地确定在传统细胞学中无法判别的染色体异常病例，是目前国内外细胞遗传学研究的热点[1，2]。本研究分析了34例应用羊水细胞染色体FISH技术行染色体异常的产前诊断结果。因新生儿最常见的染色体异常是21、13、18号染色体的三体和X染色体单体和其他性染色体的非整倍体[2]，我们选用人类全染色体着丝粒探针和特异性较强的21、13、18、X、Y染色体着丝粒探针与染色体全涂染探针对34例产前诊断者孕中期羊水细胞染色体行FISH，发现3例异常的染色体病例，包括47，XY+18、47，XY+21、45，X/46，X，r(X)。羊水细胞分裂中期染色体FISH比常规G带分析更准确，可确定在传统细胞学中无法判读的染色体异常病例。本研究对1例常规G带分析为45，X/46，X，mar的病例，用生物素标记的X着丝粒探针与羊水细胞分裂中期染色体DNA FISH杂交，确定了标记染色体mar的来源是X环形染色体。应用羊水细胞分裂中期染色体FISH技术进行产前诊断，提高了羊水细胞产前诊断的准确率。尤其对微小标记染色体、染色体的微小相互易位具有高度敏感性和可靠性[2]。
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参考文献
1 向阳，Thue B, John P, 等.荧光原位杂交法快速诊断早孕期常见染色体数目畸变.中国医学科学院学报，1995，17：120-124.
2 Schubert R,Raff R, Schwanitz G. Molecular-cytogenetic investigations of ten term placentae in cases of prenatally diagnosed mosaicism. Prenat Diagn, 1996, 16:907-913.
(收稿：1998-04-18 修回：1998-12-20), 百拇医药
单位：510150 广州市第二人民医院妇产科
关键词：原位杂交；荧光；染色体异常；产前诊断；羊水
中华妇产科杂志990308 【摘要】 目的 探讨荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)于产前诊断羊水细胞染色体异常的实验方法及应用价值。方法 对34例孕16～23周有产前诊断指征者经腹部抽取羊水，用Chang培养液传代培养，常规制备羊水细胞分裂中期染色体，应用生物素及地高辛标记的人类全着丝粒探针和X、Y、13、21、18号染色体α-着丝粒探针及染色体全涂染探针，与培养的羊水细胞分裂中期染色体DNA进行原位杂交，杂交后用荧光显微镜观察玻片并摄像。结果 34例产前诊断者其羊水细胞分裂中期染色体的核型种类有正常核型46，XX 15例，46，XY 16例，异常核型有47，XY+21、47，XY+18、45，X/46，X，r(X)各1例。3例异常核型治疗性流产后取脐血，25例正常核型追踪至足月分娩时取脐血采用FISH及G带染色体检查证实，与产前羊水细胞染色体检查相符。 结论FISH用于羊水细胞染色体产前诊断具有快速、准确等优点，特别对染色体结构异常与来源不明的标记染色体诊断，具有更高的敏感性和可靠性。
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Application of Fluorescence Insitu Hybridization Technique for Prenatal Diagnosis of Chromosome Abnormality in Amniotic Cells HUANG Yanyi, SUN Xiaofang, LI Qing, et al. Second Municipal People's Hospital of Guangzhou, Guangzhou 510150
【Abstract】 Objective To study the technique and diagnostic value of fluorescence insitu hybridization (FISH) in chromosome abnormality for prenatal diagnosis. Methods Amniocenteses were performed in 34 pregnant women of 16～23 gestational weeks with indications for prenatal diagnosis. The amniotic fluid samples were cultured in Chang's medium. The metaphase chromosomes were hybridized insitu with the human centromere probes, α-satellites DNA probes of X, Y,13, 21, 18 chromosomes and all primer chromosome probes. These probes were conjugated by Biotin and Dioxin then. The treated slides were examined and taken photos under the fluoromicroscope. Results By FISH technique, normal karyotypes were shown in 31 cases: 16 cases of 46, XY, 15 cases of 46, XX. Abnormalities were found in 3 patients which were 47, XY+21; 47, XY+18 and 45, X/46, X,r (X)respectively. Conclusion Using FISH technique to detect chromosome abnormalities in amniotic fluid for prenatal diagnosis is a reliable method which is rapid and accurate. It has higher sensitivity and specificity in finding chromosome structure abnormalities and marking chromosome DNA sequences.
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【Key words】 In situ hybridization, fluorescence Chromosome abnormalities Prenatal diagnosis Amniotic fluid
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是分子杂交与组织化学相结合的一项新技术，近年来用于人类染色体分析，它能快速、准确地确定在传统方法中无法判别的染色体异常，特别对来源不明的标记染色体(marker chromosome)能作出正确诊断[1，2]。有作者应用FISH方法分析绒毛间期细胞染色体，虽具有快速的优点，但其只能分析染色体数目异常，不能分析结构异常，不能准确诊断胎儿染色体核型，且受杂交率限制，有一定的局限性。我们通过提高羊水细胞培养和制片技术，采用Chang培养基，通过传代培养，获得数量较多的羊水细胞分裂中期相，成功地将FISH技术用于羊水细胞分裂中期染色体诊断。现报道如下。
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资料与方法
一、资料来源
1.研究对象：选择1996年1月至1998年1月，在我院优生门诊需进行产前诊断者34例。年龄25～43岁，孕周16～23周。产前诊断指征包括孕妇年龄≥35岁16例；不良分娩史11例；围产期感染2例；B超发现胎儿畸型2例；孕妇或其丈夫为染色体平衡易位2例；接受X线照射1例。
2.羊水采集：在B超腹部穿刺探头引导下，用20G腹部穿刺针抽取羊水20 ml，置无菌试管中待检。
二、实验方法
1.羊水细胞培养及收获：取20 ml羊水离心，取沉淀物0.5 ml加入4.5 ml张氏培养液，在培养瓶内混匀，放入37℃， 5% CO2培养箱内培养，5天后隔天观察换液，10～12天传代培养，用EDTA胰酶洗脱细胞后再加入培养液培养过夜，按常规收获细胞。羊水细胞G带染色体制备按常规进行。
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2.羊水细胞FISH检测：常规滴片，放入2倍氯化钠，柠檬酸钠溶液(SSC)中37℃30分钟，再分别放入70%、90%、100%冰乙醇中各2分钟。70%甲酰胺(pH 7.0)(72±2)℃ 2分钟。然后再分别放入70%、90%、100%冰乙醇中各2分钟。将变性的探针涂到玻片上，加盖玻片，周围封胶，37℃过夜。然后在50%甲酰胺/2倍SSC液中(37℃)浸泡2次，各5分钟；2倍SSC液中2次，各5分钟，磷酸缓冲液(PBS)中1次5分钟，放入地高辛标记的荧光素50 μl，37℃，5分钟，PBD 5分钟2次。兔抗血清50 μl， 37℃ 15分钟，PBD 5分钟2次。荧光标记的抗兔血清50 μl， 15分钟，37℃ PBD 5分钟2次。加碘化丙啶15 μl于玻片上，加盖玻片，于BX 60荧光显微镜下观察并摄片。
3.探针选择：每例分别用人类全着丝粒探针及X、Y、13、21、18号染色体着丝粒探针进行FISH，1例18，三体选用18号染色体全涂染探针，1例拟诊X染色体异常者选用X染色体全涂染探针杂交。
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结 果
一、羊水细胞染色体检测结果
34例产前诊断者羊水细胞染色体检测，正常核型31例，其中46，XX 15例、46，XY 16例；异常核型3例，其中有47，XY+21、47，XY+18各1例；1例羊水细胞染色体G带分析为45，X/46，X，mar标记染色体，来源不明，经FISH证实为45，X/46，X,r(X)，mar为X环形染色体。见表1。羊水细胞染色体FISH正确杂交率在96%以上。
表1 3例孕妇羊水细胞染色体异常标本的FISH结果 病
例
核 型
探
针
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计数核
(个)
1个荧光
点(%)
2个荧光
点(%)
3个荧光
点(%)
4个荧光
点(%)
临床诊断
例1
47，XY+18
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18
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18，三体
例2
47，XY+21
21
100
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21，三体
例3
45，X/46，X,r(X)
X
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45，X/46，X，r(X)嵌合体
1例孕20周，将分裂中期羊水细胞染色体用人类全染色体着丝粒探针杂交，见染色体总数47条，用21、13、18、X、Y着丝粒探针杂交，见21、13号染色体各有2点发黄光。18号染色体有3点发黄光。X、Y染色体各有1点发黄光。证实为47，XY+18。再用18号染色体全涂染探针杂交，见3条18号染色体全部发黄光，证实为18，三体。
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1例常规羊水细胞染色体G带分析见45，X/46，X，mar标记染色体，未能明确辨认。应用FISH在染色体分裂中期，用21、13、18、X、Y着丝粒探针杂交，见mar染色体是X环形染色体，发黄光，证实是46，X，r(X)，此标记染色体是X环形染色体。患者是45，X/46，X，r(X)嵌合体。
二、临床追踪结果
对产前羊水细胞染色体异常的3例行治疗性流产，胎儿娩出后取脐血染色体G带行FISH检测，与产前诊断相符。产前羊水细胞染色体正常者追踪其新生儿25例，取脐血行染色体G带及FISH检测，其核型与产前诊断全部相符，临床符合率为100%。
讨 论
FISH是利用已知碱基序列的非同位素标记的核酸探针，依据碱基互补配对原理，通过荧光亲和素免疫组化检测体系，在组织切片、细胞间期核及染色体等标本上，对待测核酸进行定性、定位及相对定量分析的一种方法。是分子杂交与组织化学相结合的一项新技术。近年来，用于人类染色体分析，是细胞遗传学与分子生物学相结合的一大进展，能够快速、准确地确定在传统细胞学中无法判别的染色体异常病例，是目前国内外细胞遗传学研究的热点[1，2]。本研究分析了34例应用羊水细胞染色体FISH技术行染色体异常的产前诊断结果。因新生儿最常见的染色体异常是21、13、18号染色体的三体和X染色体单体和其他性染色体的非整倍体[2]，我们选用人类全染色体着丝粒探针和特异性较强的21、13、18、X、Y染色体着丝粒探针与染色体全涂染探针对34例产前诊断者孕中期羊水细胞染色体行FISH，发现3例异常的染色体病例，包括47，XY+18、47，XY+21、45，X/46，X，r(X)。羊水细胞分裂中期染色体FISH比常规G带分析更准确，可确定在传统细胞学中无法判读的染色体异常病例。本研究对1例常规G带分析为45，X/46，X，mar的病例，用生物素标记的X着丝粒探针与羊水细胞分裂中期染色体DNA FISH杂交，确定了标记染色体mar的来源是X环形染色体。应用羊水细胞分裂中期染色体FISH技术进行产前诊断，提高了羊水细胞产前诊断的准确率。尤其对微小标记染色体、染色体的微小相互易位具有高度敏感性和可靠性[2]。
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参考文献
1 向阳，Thue B, John P, 等.荧光原位杂交法快速诊断早孕期常见染色体数目畸变.中国医学科学院学报，1995，17：120-124.
2 Schubert R,Raff R, Schwanitz G. Molecular-cytogenetic investigations of ten term placentae in cases of prenatally diagnosed mosaicism. Prenat Diagn, 1996, 16:907-913.
(收稿：1998-04-18 修回：1998-12-20), 百拇医药