内皮型一氧化氮合酶mRNA在人类胎盘中的表达
作者：沈文洁 杨梦庚 鲁永鲜 李东红
单位：100037 北京，解放军第三○四医院妇产科(沈文洁，鲁永鲜)；第四军医大学唐都医院妇产科(杨梦庚，李东红)
关键词：一氧化氮合酶；妊娠；胎盘；RNA；信使
中华妇产科杂志990307 【摘要】 目的 探讨内皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA在胎盘、脐带中的表达，及eNOS在胎盘中的定位。方法 采用原位聚合酶链反应与原位杂交的方法，对10例正常足月妊娠的胎盘及脐带中的eNOS mRNA的表达进行定位研究。结果 脐动、静脉内皮细胞及胎盘合体滋养细胞均呈eNOS阳性染色，干绒毛血管内皮细胞也呈eNOS阳性染色，但弱于合体滋养细胞，终末绒毛血管内皮细胞未见eNOS染色。结论 eNOS主要定位于胎盘合体滋养细胞及干绒毛血管内皮细胞。
Expression of Endothelial Nitric Oxide Synthase mRNA in Human Placenta SHEN Wenjie, YANG Menggeng, LU Yongxian, et al. 304th Hospital of PLA, Beijing 100037
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To determine the localization and type of nitric oxide synthase in human placenta. Methods By polymerase chain reaction and in situ hybridization. The eNOS mRNA expression was observed in 10 cases of human normal term placenta and cord. Results In human normal term placenta, positive staining of eNOS was evident in the syncytiotrophoblast and the endothelium of umbilical artery and vein, positive staining also presented in the endothelium of stem villous vessels, but it was absent in the endothelium of terminal villous capillary. Conclusion eNOS is present in syncytiotrophoblast and endothelium of stem villi vessels, and it can synthesize nitric oxide which results in the increase of nitric oxide in pregnancy.
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【Key words】 Nitric-oxide synthase Pregnancy Placenta RNA, messenger
妊娠妇女体内一氧化氮(NO)合成增加，是妊娠期母体适应性改变的环节之一。但一氧化氮合酶(NOS)在胎盘中的合成部位及表达亚型尚未完全明了。本研究应用高度特异的内皮型NOS (eNOS)探针，采用原位聚合酶链反应(PCR)与原位杂交技术，研究胎盘中eNOS mRNA的表达和定位。
材料与方法
一、引物
根据Janssens等[1]研究的人类基因数据库中eNOS cDNA序列而设计引物，由上海生物工程有限公司DNA合成仪合成，序列分别为5′GAG GAA GGA GTC CAG TAA CAC AG 3′；5′CTC GAG GAC TTG CTG CTT TGC 3′。由这对引物可以扩增出自1 907～2 347 bp的eNOS cDNA序列，相当于636～782 aa的氨基酸序列。
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二、探针合成
正常足月胎盘娩出后即刻取胎盘组织，经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理后置液氮中，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿方法提取组织总RNA，逆转录后重复PCR两次，取反应液进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下照片，可见400 bp长度的DNA探针。应用地高辛DNA标记和检测试剂盒(德国宝灵曼公司产品)标记、纯化探针，-20℃贮存备用。
三、原位PCR
选择1997年3月在第四军医大学唐都医院产科自然分娩的10例健康初产妇，年龄23～26岁，平均孕周为(39.57±1.14)周。胎盘娩出后即刻取脐带及胎盘组织，经DEPC处理后制成6 μm厚石蜡切片，经常规脱蜡、酸化、蛋白酶K及DNA酶消化等预处理后，于组织切片上滴加逆转录反应液(包括：8 μl RNA酶抑制剂，1 μl下游引物，2 μl二硫苏糖醇，5 μl脱氧三磷酸核苷混合物，1 μl M-MLV逆转录酶，4 μl DEPC，4 μl缓冲液)，37 ℃反应1小时，98℃3分钟终止反应。逆转录结束后滴加PCR反应液(包括：TAG聚合酶1 μl，上、下游引物各1 μl，脱氧三磷酸核苷混合物4 μl，DEPC 38 μl，缓冲液5 μl)，98℃变性5分钟，速冷，进入PCR循环：94℃30分钟、48℃45分钟、72℃45分钟，20次循环后72℃延伸10分钟。
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四、原位杂交
滴加地高辛标记的eNOS基因探针，42℃杂交过夜，滴加碱性磷酸酶标记的地高辛抗体复合物，显色后封片。
五、阴性对照
分别以缺乏逆转录酶、缺乏引物以及反应前经RNA酶消化后的组织切片作为阴性对照。
结 果
一、脐带染色结果
脐动脉及脐静脉内皮细胞中均有eNOS阳性染色，染色位于胞质中，染色强度与脐带距胎盘的距离无关，脐动脉与脐静脉相比，染色强度无明显差异。
二、胎盘绒毛染色结果
所有胎盘组织切片，位于绒毛最外层的合体滋养细胞均呈强阳性染色，以终末绒毛最强，干绒毛次之。染色主要位于核周围，呈斑片状分布。绒毛间滋养细胞也呈阳性染色，而绒毛基质细胞为阴性染色。
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胎盘绒毛中轴胎儿血管内皮细胞染色存在差异，绒毛膜板下层干绒毛内的胎儿血管内皮细胞有广泛染色，呈斑片状分布，但染色强度次于合体滋养细胞，而终末绒毛中轴内的毛细血管内皮细胞却没有eNOS染色。
讨 论
一、胎盘具有合成内皮源性NO的功能
有关研究发现，妊娠及假孕治疗的小鼠体内NO代谢产物及第二信使cGMP水平增加[2]，NOS催化活性增加，但增高幅度妊娠鼠明显大于假孕治疗鼠，说明胎儿-胎盘系统在NO生成中可能起重要作用。
Myatt等[3，4]发现，在组织胺刺激下，胎儿-胎盘单位循环系统不仅能够合成释放NO，并能对NO产生反应，降低血管张力，减弱对内皮素、血栓素的敏感性反应，从而认为，胎儿-胎盘单位是NO的主要来源，NO的基础分泌能够维持该循环的低阻力，有利于胎儿宫内发育。
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二、应用原位PCR技术进行NOS定位
NOS是内源性NO合成过程中的限速酶，分别从脑组织、内皮细胞及巨噬细胞中纯化克隆出3种同工酶，即脑型、内皮型及诱导型。目前，许多研究利用还原型辅酶Ⅱ脱氢酶进行组织化学染色，研究NOS在胎盘中的分布。但是其他黄素酶的存在也可使NADPH脱氢酶组化染色呈阳性表现，因而NADPH脱氢酶组化反应对NOS测定是非特异的，而且不能区分NOS类型。本研究采用先进的原位PCR技术对NOS在胎盘中的分布进行定位，与组织化学及抗原抗体免疫组织化学相比，具有敏感性高、特异性强等优点。
三、eNOS探针的检测特点
Conrad等[5]研究发现，人类胎盘绒毛中NOS的活性具有钙、钙调蛋白依赖性的特点，分别以脑型及内皮型NOS制成探针进行原位杂交，发现前者染色均为阴性，而后者为阳性，从而判定胎盘绒毛中主要存在eNOS。Buttery等[6]用eNOS抗血清与胎盘组织进行Western杂交，认为胎盘中表达eNOS，是NO合成的主要部位。本研究根据人类eNOS cDNA序列制备eNOS探针，特异性地检测人类胎盘中eNOS mRNA的基因表达及细胞分布，显示出高效、敏感的检测特点。
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四、合体滋养细胞与NO的关系
合体滋养细胞位于绒毛最外层，直接与母血接触，其位置和功能类似于血管内皮细胞。本研究发现，所有胎盘组织切片中，合体滋养细胞的原位PCR检测均为阳性染色，且染色强度高于胎儿血管内皮细胞。因而认为，合体滋养细胞具有eNOS mRNA的表达，能够合成NO。妊娠晚期人类胎盘绒毛中合体滋养细胞面积达12 m2[7],而且其染色强度高于胎儿血管内皮细胞，因而可以推测，合体滋养细胞是妊娠期基础状态下内皮源性NO合成的主要来源。Eis等[8]观察体外培养的细胞滋养细胞向合体滋养细胞分化的不同阶段，用eNOS抗体进行免疫组化染色，发现细胞滋养细胞阴性，而合体滋养细胞为阳性，表明NO可能与滋养细胞分化有关。
五、胎儿-胎盘单位循环与NO的关系
本研究还发现，脐动脉、脐静脉内皮细胞均有eNOS表达。而绒毛内胎儿血管的不同部位的表达上则存在差异。干绒毛内胎儿血管内皮细胞均呈斑片状阳性染色，但染色强度较弱。随着血管管径的减小，eNOS mRNA表达减少；终末绒毛内毛细血管内皮细胞则未见eNOS mRNA表达。体外胎盘绒毛小叶灌注实验发现，胎儿-胎盘单位能够产生NO[5]，作用于下层平滑肌，调节血管张力，维持该循环的低阻力，与本研究结果一致。但为何终末绒毛内毛细血管内皮细胞未见eNOS mRNA的表达等有关问题，尚需进一步探讨。
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参考文献
1 Janssens CP, Shimouchi A, Quertermous T, et al. Cloning and expression of a cDNA encoding human endothelial-derived relaxing factor/nitric oxide synthase. J Biol Chem, 1992, 267:14519-14522.
2 Conrad KP, Joffe GM, Kruszyna H, et al. Identification of increased nitric oxide biosynthesis during pregnancy in rats. FASEB J, 1993, 7:566-571.
3 Myatt L, Brewer AS, Brockman DE, et al. The action of nitric oxide in the perfused human fetal-placental circulation. Am J Obstet Gynecol, 1991, 164:687-692.
, 百拇医药
4 Myatt L, Brewer AS, Langdon G, et al. Attenuation of the vasoconstrictor effects of thromboxane and endothelin by nitric oxide in the human fetal-placental circulation. Am J Obstet Gyencol, 1992, 166:224-230.
5 Conrad KP, Vill M, Mc Guire PG, et al. Expression of nitric oxide synthase by syncytiotrophoblast in human placental villi. FASEB J, 1993, 7:1269-1276.
6 Buttery LDK, McCarthy A, Springall DR, et al. Enodthelial nitric oxide synthase in the human placenta: regional distribution and proposed regulatory role at the fetomaternal interface. Placenta, 1994, 15:257-265.
, http://www.100md.com
7 Jackson MR, Mayhew TM, Boyd PA. Quantitative description of the elaboration and maturation of villi from ten weeks gestation to term. Placenta, 1992, 13:357-370.
8 Eis ALW, Brockman DE, Pollock JS, et al. Immunohistochemical localization of endothelial nitric oxide synthase in human villous and extravillous trophoblast populations and expression during syncytiotrophoblast formation in vitro. Placenta, 1995, 16:113-126.
(收稿：1998-09-04 修回：1998-12-08), http://www.100md.com
单位：100037 北京，解放军第三○四医院妇产科(沈文洁，鲁永鲜)；第四军医大学唐都医院妇产科(杨梦庚，李东红)
关键词：一氧化氮合酶；妊娠；胎盘；RNA；信使
中华妇产科杂志990307 【摘要】 目的 探讨内皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA在胎盘、脐带中的表达，及eNOS在胎盘中的定位。方法 采用原位聚合酶链反应与原位杂交的方法，对10例正常足月妊娠的胎盘及脐带中的eNOS mRNA的表达进行定位研究。结果 脐动、静脉内皮细胞及胎盘合体滋养细胞均呈eNOS阳性染色，干绒毛血管内皮细胞也呈eNOS阳性染色，但弱于合体滋养细胞，终末绒毛血管内皮细胞未见eNOS染色。结论 eNOS主要定位于胎盘合体滋养细胞及干绒毛血管内皮细胞。
Expression of Endothelial Nitric Oxide Synthase mRNA in Human Placenta SHEN Wenjie, YANG Menggeng, LU Yongxian, et al. 304th Hospital of PLA, Beijing 100037
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【Abstract】 Objective To determine the localization and type of nitric oxide synthase in human placenta. Methods By polymerase chain reaction and in situ hybridization. The eNOS mRNA expression was observed in 10 cases of human normal term placenta and cord. Results In human normal term placenta, positive staining of eNOS was evident in the syncytiotrophoblast and the endothelium of umbilical artery and vein, positive staining also presented in the endothelium of stem villous vessels, but it was absent in the endothelium of terminal villous capillary. Conclusion eNOS is present in syncytiotrophoblast and endothelium of stem villi vessels, and it can synthesize nitric oxide which results in the increase of nitric oxide in pregnancy.
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【Key words】 Nitric-oxide synthase Pregnancy Placenta RNA, messenger
妊娠妇女体内一氧化氮(NO)合成增加，是妊娠期母体适应性改变的环节之一。但一氧化氮合酶(NOS)在胎盘中的合成部位及表达亚型尚未完全明了。本研究应用高度特异的内皮型NOS (eNOS)探针，采用原位聚合酶链反应(PCR)与原位杂交技术，研究胎盘中eNOS mRNA的表达和定位。
材料与方法
一、引物
根据Janssens等[1]研究的人类基因数据库中eNOS cDNA序列而设计引物，由上海生物工程有限公司DNA合成仪合成，序列分别为5′GAG GAA GGA GTC CAG TAA CAC AG 3′；5′CTC GAG GAC TTG CTG CTT TGC 3′。由这对引物可以扩增出自1 907～2 347 bp的eNOS cDNA序列，相当于636～782 aa的氨基酸序列。
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二、探针合成
正常足月胎盘娩出后即刻取胎盘组织，经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理后置液氮中，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿方法提取组织总RNA，逆转录后重复PCR两次，取反应液进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下照片，可见400 bp长度的DNA探针。应用地高辛DNA标记和检测试剂盒(德国宝灵曼公司产品)标记、纯化探针，-20℃贮存备用。
三、原位PCR
选择1997年3月在第四军医大学唐都医院产科自然分娩的10例健康初产妇，年龄23～26岁，平均孕周为(39.57±1.14)周。胎盘娩出后即刻取脐带及胎盘组织，经DEPC处理后制成6 μm厚石蜡切片，经常规脱蜡、酸化、蛋白酶K及DNA酶消化等预处理后，于组织切片上滴加逆转录反应液(包括：8 μl RNA酶抑制剂，1 μl下游引物，2 μl二硫苏糖醇，5 μl脱氧三磷酸核苷混合物，1 μl M-MLV逆转录酶，4 μl DEPC，4 μl缓冲液)，37 ℃反应1小时，98℃3分钟终止反应。逆转录结束后滴加PCR反应液(包括：TAG聚合酶1 μl，上、下游引物各1 μl，脱氧三磷酸核苷混合物4 μl，DEPC 38 μl，缓冲液5 μl)，98℃变性5分钟，速冷，进入PCR循环：94℃30分钟、48℃45分钟、72℃45分钟，20次循环后72℃延伸10分钟。
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四、原位杂交
滴加地高辛标记的eNOS基因探针，42℃杂交过夜，滴加碱性磷酸酶标记的地高辛抗体复合物，显色后封片。
五、阴性对照
分别以缺乏逆转录酶、缺乏引物以及反应前经RNA酶消化后的组织切片作为阴性对照。
结 果
一、脐带染色结果
脐动脉及脐静脉内皮细胞中均有eNOS阳性染色，染色位于胞质中，染色强度与脐带距胎盘的距离无关，脐动脉与脐静脉相比，染色强度无明显差异。
二、胎盘绒毛染色结果
所有胎盘组织切片，位于绒毛最外层的合体滋养细胞均呈强阳性染色，以终末绒毛最强，干绒毛次之。染色主要位于核周围，呈斑片状分布。绒毛间滋养细胞也呈阳性染色，而绒毛基质细胞为阴性染色。
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胎盘绒毛中轴胎儿血管内皮细胞染色存在差异，绒毛膜板下层干绒毛内的胎儿血管内皮细胞有广泛染色，呈斑片状分布，但染色强度次于合体滋养细胞，而终末绒毛中轴内的毛细血管内皮细胞却没有eNOS染色。
讨 论
一、胎盘具有合成内皮源性NO的功能
有关研究发现，妊娠及假孕治疗的小鼠体内NO代谢产物及第二信使cGMP水平增加[2]，NOS催化活性增加，但增高幅度妊娠鼠明显大于假孕治疗鼠，说明胎儿-胎盘系统在NO生成中可能起重要作用。
Myatt等[3，4]发现，在组织胺刺激下，胎儿-胎盘单位循环系统不仅能够合成释放NO，并能对NO产生反应，降低血管张力，减弱对内皮素、血栓素的敏感性反应，从而认为，胎儿-胎盘单位是NO的主要来源，NO的基础分泌能够维持该循环的低阻力，有利于胎儿宫内发育。
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二、应用原位PCR技术进行NOS定位
NOS是内源性NO合成过程中的限速酶，分别从脑组织、内皮细胞及巨噬细胞中纯化克隆出3种同工酶，即脑型、内皮型及诱导型。目前，许多研究利用还原型辅酶Ⅱ脱氢酶进行组织化学染色，研究NOS在胎盘中的分布。但是其他黄素酶的存在也可使NADPH脱氢酶组化染色呈阳性表现，因而NADPH脱氢酶组化反应对NOS测定是非特异的，而且不能区分NOS类型。本研究采用先进的原位PCR技术对NOS在胎盘中的分布进行定位，与组织化学及抗原抗体免疫组织化学相比，具有敏感性高、特异性强等优点。
三、eNOS探针的检测特点
Conrad等[5]研究发现，人类胎盘绒毛中NOS的活性具有钙、钙调蛋白依赖性的特点，分别以脑型及内皮型NOS制成探针进行原位杂交，发现前者染色均为阴性，而后者为阳性，从而判定胎盘绒毛中主要存在eNOS。Buttery等[6]用eNOS抗血清与胎盘组织进行Western杂交，认为胎盘中表达eNOS，是NO合成的主要部位。本研究根据人类eNOS cDNA序列制备eNOS探针，特异性地检测人类胎盘中eNOS mRNA的基因表达及细胞分布，显示出高效、敏感的检测特点。
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四、合体滋养细胞与NO的关系
合体滋养细胞位于绒毛最外层，直接与母血接触，其位置和功能类似于血管内皮细胞。本研究发现，所有胎盘组织切片中，合体滋养细胞的原位PCR检测均为阳性染色，且染色强度高于胎儿血管内皮细胞。因而认为，合体滋养细胞具有eNOS mRNA的表达，能够合成NO。妊娠晚期人类胎盘绒毛中合体滋养细胞面积达12 m2[7],而且其染色强度高于胎儿血管内皮细胞，因而可以推测，合体滋养细胞是妊娠期基础状态下内皮源性NO合成的主要来源。Eis等[8]观察体外培养的细胞滋养细胞向合体滋养细胞分化的不同阶段，用eNOS抗体进行免疫组化染色，发现细胞滋养细胞阴性，而合体滋养细胞为阳性，表明NO可能与滋养细胞分化有关。
五、胎儿-胎盘单位循环与NO的关系
本研究还发现，脐动脉、脐静脉内皮细胞均有eNOS表达。而绒毛内胎儿血管的不同部位的表达上则存在差异。干绒毛内胎儿血管内皮细胞均呈斑片状阳性染色，但染色强度较弱。随着血管管径的减小，eNOS mRNA表达减少；终末绒毛内毛细血管内皮细胞则未见eNOS mRNA表达。体外胎盘绒毛小叶灌注实验发现，胎儿-胎盘单位能够产生NO[5]，作用于下层平滑肌，调节血管张力，维持该循环的低阻力，与本研究结果一致。但为何终末绒毛内毛细血管内皮细胞未见eNOS mRNA的表达等有关问题，尚需进一步探讨。
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参考文献
1 Janssens CP, Shimouchi A, Quertermous T, et al. Cloning and expression of a cDNA encoding human endothelial-derived relaxing factor/nitric oxide synthase. J Biol Chem, 1992, 267:14519-14522.
2 Conrad KP, Joffe GM, Kruszyna H, et al. Identification of increased nitric oxide biosynthesis during pregnancy in rats. FASEB J, 1993, 7:566-571.
3 Myatt L, Brewer AS, Brockman DE, et al. The action of nitric oxide in the perfused human fetal-placental circulation. Am J Obstet Gynecol, 1991, 164:687-692.
, 百拇医药
4 Myatt L, Brewer AS, Langdon G, et al. Attenuation of the vasoconstrictor effects of thromboxane and endothelin by nitric oxide in the human fetal-placental circulation. Am J Obstet Gyencol, 1992, 166:224-230.
5 Conrad KP, Vill M, Mc Guire PG, et al. Expression of nitric oxide synthase by syncytiotrophoblast in human placental villi. FASEB J, 1993, 7:1269-1276.
6 Buttery LDK, McCarthy A, Springall DR, et al. Enodthelial nitric oxide synthase in the human placenta: regional distribution and proposed regulatory role at the fetomaternal interface. Placenta, 1994, 15:257-265.
, http://www.100md.com
7 Jackson MR, Mayhew TM, Boyd PA. Quantitative description of the elaboration and maturation of villi from ten weeks gestation to term. Placenta, 1992, 13:357-370.
8 Eis ALW, Brockman DE, Pollock JS, et al. Immunohistochemical localization of endothelial nitric oxide synthase in human villous and extravillous trophoblast populations and expression during syncytiotrophoblast formation in vitro. Placenta, 1995, 16:113-126.
(收稿：1998-09-04 修回：1998-12-08), http://www.100md.com