肿瘤坏死因子α与γ干扰素诱导人绒毛膜滋养层细胞凋亡的研究
作者：邢福祺 孔令红 陈士岭 刘忠 陈东红
单位：第一军医大学附属南方医院妇产科 510515广州
关键词：脱噬作用；滋养层；肿瘤坏死因子；干扰素Ⅱ型
中华妇产科杂志990809 【摘要】 目的 探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)与γ干扰素(IFN-γ)诱导妊娠早期人绒毛膜滋养层细胞凋亡的作用及其机理。方法 建立人妊娠早期滋养层细胞体外培养体系；TNF-α与IFN-γ联合作用36小时后，利用台盼蓝染色记数活细胞法检测其细胞毒性。在光镜和透射电镜下观察滋养层细胞凋亡的形态学变化；用琼脂糖凝胶电泳对DNA断裂片段进行分析；采用流式细胞仪测定滋养层细胞的凋亡指数；粘附式细胞仪检测TNF-α作用下滋养层细胞内氧自由基的变化。结果 TNF-α在1000、3000和5000 U/ml浓度时，活细胞数显著减少(P<0.05)；而在与IFN-γ共同作用下，TNF-α在500、1000、3000和5000 U/ml时，活细胞数均显著减少(P<0.05)；电镜下观察到染色体边集、核固缩、凋亡小体；DNA琼脂糖凝胶电泳有“梯形条带”。细胞凋亡指数具有TNF-α浓度的依赖性；在TNF-α的作用下，绒毛膜滋养层细胞内氧自由基升高。结论 TNF-α与IFN-γ能够诱导妊娠早期人绒毛膜滋养层细胞凋亡；氧自由基可能参与了TNF-α诱导滋养层细胞凋亡的过程。
, 百拇医药
Apoptosis of Cultured Human Trophoblasts Induced by Tumor Necrosis
Factor-α and Interferon-γ
XING Fuqi, KONG Linghong,CHEN Shiling, et al.
Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515
【Abstract】 Objective To investigate the potential role of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interferon -γ (IFN-γ) in inducing apoptosis of human trophoblast during early pregnancy and its mechanism. MethodsHuman trophoblast of early gestation were cultured in vitro. Having cultured with TNF-α and IFN-γ for 36 hours, their cytotoxic activity was determined by viable cell calculation. Apoptotic morphology was observed under light and electronic microscope. DNA fragment pattern and apoptotic index were analysed by agarose gel electrophoresis and flow cytometer assay (FCM) respectively. Adherent cell analysis and sorting interactive laser cytometer was used to examine the changes of cellular reactive oxygen species (ROS) caused by TNF-α. Results TNF-α alone significantly decreased the number of viable cells at the concentration of 1000，3000 and 5000 U/ml (P<0.05). While combined with IFN-γ, TNF-α decreased the number of viable cells more markedly. Electronic microscopic examination showed chromatin aggregating beneath the nuclear envelope, nuclear contraction and apoptotic bodies. Agarose gel electophoresis of fragmented DNA showed a ladder-like pattern. FCM showed that the apoptotic index of trophoblasts was TNF-α concentration dependent. Cellular ROS was increased by TNF-α. Conclusion TNF-α and IFN-γ could induce apoptosis of human trophoblasts during early pregnancy, partly through the mechanism of ROS.
, 百拇医药
【Key words】 Trophoblast Apoptosis Tumor necrosis factor Interferon typeⅡ
一些研究表明，凋亡可能在胎盘绒毛组织结构的改建及功能的完善等方面发挥着重要的作用[1,2]，并可能参与某些病理产科过程，如早产的胎盘剥离区有大量绒毛膜滋养层细胞凋亡[3]。肿瘤坏死因子α(TNF-α)与γ干扰素(IFN-γ)及其受体在正常妊娠时即可在人绒毛组织中表达。Yui等[2]证明，TNF-α与IFN-γ可诱导人妊娠晚期滋养层细胞凋亡。本实验试图建立人妊娠早期滋养层细胞体外培养体系，从形态学及生物化学方面观察和检测经TNF-α与IFN-γ处理后滋养层细胞的凋亡情况，探讨TNF-α与IFN-γ诱导滋养层细胞凋亡的机理。
材料与方法
一、材料
, 百拇医药
TNF-α购自军事医学科学院；INF-γ由第一军医大学分子免疫所惠赠；DMEM粉剂、F12粉剂购自美国生物技术有限公司；胰酶、RNA酶、蛋白酶K购自美国Sigma公司；碘化丙锭(PI)、2′,7′-二氯二氢荧光素双醋酸盐荧光染料购自美国基因公司。
二、方法
1. 建立人妊娠早期滋养层细胞体外培养体系：参考文献[2]，取妊娠6～10周、发育正常、吸宫流产的绒毛，D-Hanks液冲洗3次后剪碎。0.25%胰酶37℃消化2次各10分钟，200目筛网过滤，800 r/min离心5分钟后弃上清。细胞用含10%小牛血清的DMEM/ F12(1∶1)培养基稀释为5×105个/ml左右，在37℃、5% CO2孵育箱培养。24小时后换液去除未附壁的细胞。以后每3天传代1次。
2.活细胞记数：细胞以5×105个/孔传到培养板内，8小时后经D-Hanks液冲洗，换无血清的基础培养基。设立空白对照、IFN-γ、TNF-α、TNF-α与IFN-γ(1000 U/ml)联合组，其中TNF-α及IFN-γ的浓度梯度为100、500、1000、3000及5000 U/ml。作用36小时后收集细胞，台盼蓝染色后，以血细胞记数板记数着色与未着色的细胞。
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3.凋亡细胞观察：细胞经IFN-γ与TNF-α联合作用36小时后，10%中性缓冲甲醛固定，HE染色。光镜下观察细胞形态及着色情况。细胞经胰酶消化、琼脂管离心、2%戊二醛固定、梯度丙酮脱水、环氧树脂渗透包埋、超薄切片及铀铅染色后，电镜下观察凋亡细胞染色质的分布及有无凋亡小体形成。
4. DNA琼脂糖凝胶电泳：根据活细胞记数的结果，以TNF-α0、3000 U/ml及 IFN-γ 1000 U/ml与TNF-α 3000 U/ml联合作用滋养细胞36小时，之后胰酶消化收集细胞，常规提取DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察有无“梯形条带”，从生化上证明TNF-α能够诱导滋养细胞凋亡。
5.凋亡指数测定：TNF-α及TNF-α与IFN-γ1 000 U/ml联合作用36小时后，0.25% 胰酶消化制成单细胞悬液，70%的乙醇4℃固定2小时。磷酸盐缓冲液(pH7.2)离心沉淀去除固定液，200 μl RNA 酶 37℃水浴30分后，加入800 μl 碘化丙锭4℃染色30分钟。经流式细胞仪测定。
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6.滋养层细胞氧自由基的变化：采用粘附式细胞仪。细胞于Corning培养皿经2′，7′-二氯二氢荧光素双醋酸盐 37℃避光染色30分钟，磷酸盐缓冲液冲洗3次后检测。选定视野后，扫描700秒。在扫描的第90秒开始时加入TNF-α，观察滋养细胞色度的变化。
三、统计学分析
定量检测均重复5次，所得结果以
±s表示，多样本均数比较采用方差分析。
结果
1.活细胞记数：48小时，IFN-γ组活细胞数没有减少；TNF-α在浓度为1000、3000和5000U/ml时活细胞数显著减少(P<0.05)；在TNF-α与IFN-γ联合组，TNF-α浓度为500、1000、3000和5000 U/ml时活细胞数都显著减少(P<0.05)。见表1。
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表1 IFN-γ、TNF-α及TNF-α与IFN-γ联合组
滋养层细胞生长与凋亡指数的变化(±s) 组 别
浓度
(U/ml)
活滋养层细胞数
(1×105/孔)
凋亡指数
(%)
IFN-γ组
空白对照
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6.23±0.63
100
6.35±0.48
500
6.26±0.57
1000
6.17±0.73
3000
6.12±0.45
5000
6.14±0.55
TNF-α组
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空白对照
6.25±0.67
1.2±0.4
100
6.34±0.85
2.2±0.8
500
5.95±0.64
2.7±1.3
1000
5.02±0.79*
6.5±2.7*
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3000
4.46±0.67*
21.4±6.6*
5000
4.12±0.82*
34.9±5.8*
TNF-α与IFN-γ
联合组**
空白对照
6.32±0.81
1.6±0.6
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100
5.82±0.66
2.5±0.7
500
5.13±0.48*
4.5±1.3*
1000
4.76±0.45*
14.7±3.6*
3000
4.37±0.56*
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26.3±6.2*
5000
3.43±0.69*
47.5±7.1*
*与对照组相比，P<0.05 **IFN-γ浓度为1 000U/ml
2. 凋亡细胞的形态学改变：光镜下正常的绒毛膜滋养层细胞体积大而伸展，胞浆及核染色浅；凋亡的滋养层细胞体积收缩变小、变圆，胞浆红染，核固缩呈蓝黑色。浓染的凋亡细胞随TNF-α浓度的增高而增多，并有凋亡细胞脱落遗留的空白区。透射电镜下染色体边集，有细胞固缩、凋亡小体等。
3.DNA断裂片段的琼脂糖凝胶电泳：空白对照DNA双链完整，聚集于尾部；经TNF-α和IFN-γ联合作用的细胞DNA断裂成180bp倍数的片段，呈“梯形条带”。单独TNF-α作用的凋亡细胞较少，其“梯形条带”不明显。
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4.滋养层细胞凋亡指数的检测：在DNA直方图上，凋亡细胞出现二倍体峰(G1峰)的减少，G1峰左侧出现的亚G1峰即凋亡峰(AP峰)。将亚G1峰值转换为细胞凋亡指数。细胞凋亡指数随TNF-α浓度的增加而增大，与空白对照差异有显著性(P<0.05)。结果与活细胞记数基本相符(表1)。
5.细胞内活性氧自由基的变化：2′，7′-二氯二氢荧光素双醋酸盐能自由通过细胞膜，细胞内的酯酶将其分解成乙酸和不能透过细胞膜的离子2′，7′-二氯二氢荧光素而留在细胞中。过氧化物和氢过氧化物能将离子型的2′，7′-二氯二氢荧光素氧化为发荧光的2′，7′-二氯荧光素。可见在加入TNF-α前细胞的荧光较弱(图1)。加入100、500及1 000 U/ml的TNF-α后，荧光强度变化不大；加入3000、5000 U/ml TNF-α后，细胞的荧光强度逐渐增强(图2)，提示此时细胞内活性氧自由基明显增多。
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图1 加入TNF-α前反映滋养细胞内氧自由基量的荧光色度较弱。
2′，7′-二氯二氢荧光素双醋酸盐染色 ×400
图2加入TNF-α后反映滋养细胞内氧自由基量的荧光色度增强。
2′，7′-二氯二氢荧光素双醋酸盐染色 ×400
讨论
胎盘的生长发育是一个动态过程，为更好地适应胎儿的需要，胎盘通过蜕膜细胞及滋养层细胞的增殖与凋亡不断进行组织结构的改建，进而实现其功能的完善。此点在妊娠的前期同样重要。
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TNF-α与IFN-γ是炎症细胞分泌的细胞因子,可诱导多种细胞凋亡。我们根据文献[2]设立TNF-α的浓度梯度，发现高浓度TNF-α单独作用就可引起妊娠早期人绒毛膜滋养层细胞凋亡。光镜和电镜下观察到滋养层细胞核浓染固缩、染色质边集、凋亡小体形成等凋亡的典型形态学变化。DNA琼脂糖凝胶电泳有“梯形条带”，是TNF-α与INF-γ诱导滋养层细胞凋亡的特征性生化改变。TNF-α对DNA合成活跃的人绒毛膜癌滋养层细胞[4]及大鼠妊娠中期的滋养层细胞有杀伤作用[5，6]，对处于静止期的小鼠滋养层细胞无任何效应[7]。但TNF-α能刺激大鼠的绒毛间质细胞增生[6]。推测,TNF-α对胚泡分化来的细胞有多重作用，既抑制迅速增殖的滋养层细胞对母体子宫的过度侵蚀；又可刺激间质细胞生长。在生理情况下，绒毛细胞滋养层细胞分泌TNF-α，诱发绒毛轴心的间质细胞分泌粒-巨噬细胞集落刺激因子和集落刺激因子，调节滋养层细胞增殖、分化及凋亡。在感染及由母儿Rh血型不合、子痫前期引起的缺氧情况下，巨噬细胞可大量分泌白细胞介素1、TNF-α；白细胞介素1也能促进滋养层细胞分泌TNF-α[3]。胎盘内细胞自分泌及旁分泌的平衡被打乱，细胞凋亡、坏死增多，胎盘容易剥离,导致流产或早产。
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IFN-γ单独作用没有诱导绒毛膜滋养层细胞凋亡，但与TNF-α联合作用明显提高TNF-α诱导凋亡的作用。细胞凋亡率具有TNF-α浓度的依赖性。目前研究认为，IFN-γ的协同促凋亡作用与促进APO-1/FAS的表达有关。APO-1/FAS是一种跨膜蛋白，是程序化细胞死亡的重要信号传递系统。克隆的人APO-1/FAS抗原的cDNA，与TNF-α受体的编码有高度同源性。应用免疫组化研究发现,人绒毛滋养层细胞也有APO-1/FAS抗原表达[8]。这方面的机理有待进一步的探讨。
TNF-α诱导细胞凋亡的机理尚不清楚，推测与氧自由基有关。有研究发现，用TNF-α诱导细胞凋亡，伴有氧自由基生成增加；抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸对TNF-α诱导的细胞凋亡有抑制作用[9]。细胞内的氧自由基即可直接损伤DNA ，也可攻击蛋白质，尤其可使酶活性蛋白质的功能丧失，从而诱导细胞凋亡。我们的实验也证实，TNF-α可促进人绒毛膜滋养层细胞内氧自由基的生成，提示氧自由基可能参与了TNF-α诱导滋养层细胞凋亡的过程。
, 百拇医药
参考文献
1 Noriaki S,Hiroshi I,Hitoshi H,et al.Apoptosis in human trophoblastic cells identified by in situ nickeng labeling of fragmented DNA.Acta Obstet Gynecol JPN,1994,46:533-534.
2 Yui J,Garcia-Lloret M,Wegmann TG, et al. Cytotoxicity of tumor necrosis factor-alpha and gamma-interferon against primary human placental trophoblasts. Placental, 1994,15:819-835.
3 Kakinuma C,Kuwayama C,Kaga N,et al. Trophoblastic apoptosis in mice with preterm delivery and its suppression by urinary trypsin inhibitor. Obstet Gynecol, 1997,90:117-124.
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4 Berkowitz RS,Hill JA,Kurtz CB,et al. Effect of products of activated leukocytes lymphokines and monokines on the growth of malignant trophoblast cells in vitro. Am J Obstet Gynecol,1988,158:199-203.
5 Hunt JS,Soares MT,Lei MG,et al. Products of activated macrophages (tumor necrosis factor-α, transforming growth factor-β) but not opolysaccharide modify DNA synthesis by rat trophblast cells exhibiting the 80 kDa lipopolysaccharide-binding protein. J Urol,1989,143:1606-1613.
, 百拇医药
6 Hunt JS,Atherton RA,Pace JL,et al. Differential responses of rat trophoblast cells and embryonic fibroblast cells to cytokines that regulate proliferation and class I MHC antigen expression. J Immunol, 1990,145:184-189.
7 Drake BL, Head JR. Murine tropholast cells are not killed by tumor necrosis factor-alpha. J Reprod Immunol, 1990,17:93-99.
8 Bamberger AM,Menon RJ,Kuno K,et al.Expression of the apoptosis-inducing fas ligand (FASL) in human first and third trimester placenta and choriocarcinoma cells. J Clin Endocrinol Met, 1997,82:3173-3175.
9 Mayer M,Kim CJ. N-acetyl-L-cysteine is a pluripotent protector against cell death and enhancer of trophic factor-mediated cell survival in vitro.Natl Acad Sci USA,1994,91:7496-7500.
(收稿：1998-08-10 修回：1999-05-11), 百拇医药
单位：第一军医大学附属南方医院妇产科 510515广州
关键词：脱噬作用；滋养层；肿瘤坏死因子；干扰素Ⅱ型
中华妇产科杂志990809 【摘要】 目的 探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)与γ干扰素(IFN-γ)诱导妊娠早期人绒毛膜滋养层细胞凋亡的作用及其机理。方法 建立人妊娠早期滋养层细胞体外培养体系；TNF-α与IFN-γ联合作用36小时后，利用台盼蓝染色记数活细胞法检测其细胞毒性。在光镜和透射电镜下观察滋养层细胞凋亡的形态学变化；用琼脂糖凝胶电泳对DNA断裂片段进行分析；采用流式细胞仪测定滋养层细胞的凋亡指数；粘附式细胞仪检测TNF-α作用下滋养层细胞内氧自由基的变化。结果 TNF-α在1000、3000和5000 U/ml浓度时，活细胞数显著减少(P<0.05)；而在与IFN-γ共同作用下，TNF-α在500、1000、3000和5000 U/ml时，活细胞数均显著减少(P<0.05)；电镜下观察到染色体边集、核固缩、凋亡小体；DNA琼脂糖凝胶电泳有“梯形条带”。细胞凋亡指数具有TNF-α浓度的依赖性；在TNF-α的作用下，绒毛膜滋养层细胞内氧自由基升高。结论 TNF-α与IFN-γ能够诱导妊娠早期人绒毛膜滋养层细胞凋亡；氧自由基可能参与了TNF-α诱导滋养层细胞凋亡的过程。
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Apoptosis of Cultured Human Trophoblasts Induced by Tumor Necrosis
Factor-α and Interferon-γ
XING Fuqi, KONG Linghong,CHEN Shiling, et al.
Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515
【Abstract】 Objective To investigate the potential role of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interferon -γ (IFN-γ) in inducing apoptosis of human trophoblast during early pregnancy and its mechanism. MethodsHuman trophoblast of early gestation were cultured in vitro. Having cultured with TNF-α and IFN-γ for 36 hours, their cytotoxic activity was determined by viable cell calculation. Apoptotic morphology was observed under light and electronic microscope. DNA fragment pattern and apoptotic index were analysed by agarose gel electrophoresis and flow cytometer assay (FCM) respectively. Adherent cell analysis and sorting interactive laser cytometer was used to examine the changes of cellular reactive oxygen species (ROS) caused by TNF-α. Results TNF-α alone significantly decreased the number of viable cells at the concentration of 1000，3000 and 5000 U/ml (P<0.05). While combined with IFN-γ, TNF-α decreased the number of viable cells more markedly. Electronic microscopic examination showed chromatin aggregating beneath the nuclear envelope, nuclear contraction and apoptotic bodies. Agarose gel electophoresis of fragmented DNA showed a ladder-like pattern. FCM showed that the apoptotic index of trophoblasts was TNF-α concentration dependent. Cellular ROS was increased by TNF-α. Conclusion TNF-α and IFN-γ could induce apoptosis of human trophoblasts during early pregnancy, partly through the mechanism of ROS.
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【Key words】 Trophoblast Apoptosis Tumor necrosis factor Interferon typeⅡ
一些研究表明，凋亡可能在胎盘绒毛组织结构的改建及功能的完善等方面发挥着重要的作用[1,2]，并可能参与某些病理产科过程，如早产的胎盘剥离区有大量绒毛膜滋养层细胞凋亡[3]。肿瘤坏死因子α(TNF-α)与γ干扰素(IFN-γ)及其受体在正常妊娠时即可在人绒毛组织中表达。Yui等[2]证明，TNF-α与IFN-γ可诱导人妊娠晚期滋养层细胞凋亡。本实验试图建立人妊娠早期滋养层细胞体外培养体系，从形态学及生物化学方面观察和检测经TNF-α与IFN-γ处理后滋养层细胞的凋亡情况，探讨TNF-α与IFN-γ诱导滋养层细胞凋亡的机理。
材料与方法
一、材料
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TNF-α购自军事医学科学院；INF-γ由第一军医大学分子免疫所惠赠；DMEM粉剂、F12粉剂购自美国生物技术有限公司；胰酶、RNA酶、蛋白酶K购自美国Sigma公司；碘化丙锭(PI)、2′,7′-二氯二氢荧光素双醋酸盐荧光染料购自美国基因公司。
二、方法
1. 建立人妊娠早期滋养层细胞体外培养体系：参考文献[2]，取妊娠6～10周、发育正常、吸宫流产的绒毛，D-Hanks液冲洗3次后剪碎。0.25%胰酶37℃消化2次各10分钟，200目筛网过滤，800 r/min离心5分钟后弃上清。细胞用含10%小牛血清的DMEM/ F12(1∶1)培养基稀释为5×105个/ml左右，在37℃、5% CO2孵育箱培养。24小时后换液去除未附壁的细胞。以后每3天传代1次。
2.活细胞记数：细胞以5×105个/孔传到培养板内，8小时后经D-Hanks液冲洗，换无血清的基础培养基。设立空白对照、IFN-γ、TNF-α、TNF-α与IFN-γ(1000 U/ml)联合组，其中TNF-α及IFN-γ的浓度梯度为100、500、1000、3000及5000 U/ml。作用36小时后收集细胞，台盼蓝染色后，以血细胞记数板记数着色与未着色的细胞。
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3.凋亡细胞观察：细胞经IFN-γ与TNF-α联合作用36小时后，10%中性缓冲甲醛固定，HE染色。光镜下观察细胞形态及着色情况。细胞经胰酶消化、琼脂管离心、2%戊二醛固定、梯度丙酮脱水、环氧树脂渗透包埋、超薄切片及铀铅染色后，电镜下观察凋亡细胞染色质的分布及有无凋亡小体形成。
4. DNA琼脂糖凝胶电泳：根据活细胞记数的结果，以TNF-α0、3000 U/ml及 IFN-γ 1000 U/ml与TNF-α 3000 U/ml联合作用滋养细胞36小时，之后胰酶消化收集细胞，常规提取DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察有无“梯形条带”，从生化上证明TNF-α能够诱导滋养细胞凋亡。
5.凋亡指数测定：TNF-α及TNF-α与IFN-γ1 000 U/ml联合作用36小时后，0.25% 胰酶消化制成单细胞悬液，70%的乙醇4℃固定2小时。磷酸盐缓冲液(pH7.2)离心沉淀去除固定液，200 μl RNA 酶 37℃水浴30分后，加入800 μl 碘化丙锭4℃染色30分钟。经流式细胞仪测定。
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6.滋养层细胞氧自由基的变化：采用粘附式细胞仪。细胞于Corning培养皿经2′，7′-二氯二氢荧光素双醋酸盐 37℃避光染色30分钟，磷酸盐缓冲液冲洗3次后检测。选定视野后，扫描700秒。在扫描的第90秒开始时加入TNF-α，观察滋养细胞色度的变化。
三、统计学分析
定量检测均重复5次，所得结果以
±s表示，多样本均数比较采用方差分析。结果
1.活细胞记数：48小时，IFN-γ组活细胞数没有减少；TNF-α在浓度为1000、3000和5000U/ml时活细胞数显著减少(P<0.05)；在TNF-α与IFN-γ联合组，TNF-α浓度为500、1000、3000和5000 U/ml时活细胞数都显著减少(P<0.05)。见表1。
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表1 IFN-γ、TNF-α及TNF-α与IFN-γ联合组
滋养层细胞生长与凋亡指数的变化(
±s) 组 别浓度
(U/ml)
活滋养层细胞数
(1×105/孔)
凋亡指数
(%)
IFN-γ组
空白对照
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6.23±0.63
100
6.35±0.48
500
6.26±0.57
1000
6.17±0.73
3000
6.12±0.45
5000
6.14±0.55
TNF-α组
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空白对照
6.25±0.67
1.2±0.4
100
6.34±0.85
2.2±0.8
500
5.95±0.64
2.7±1.3
1000
5.02±0.79*
6.5±2.7*
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3000
4.46±0.67*
21.4±6.6*
5000
4.12±0.82*
34.9±5.8*
TNF-α与IFN-γ
联合组**
空白对照
6.32±0.81
1.6±0.6
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100
5.82±0.66
2.5±0.7
500
5.13±0.48*
4.5±1.3*
1000
4.76±0.45*
14.7±3.6*
3000
4.37±0.56*
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26.3±6.2*
5000
3.43±0.69*
47.5±7.1*
*与对照组相比，P<0.05 **IFN-γ浓度为1 000U/ml
2. 凋亡细胞的形态学改变：光镜下正常的绒毛膜滋养层细胞体积大而伸展，胞浆及核染色浅；凋亡的滋养层细胞体积收缩变小、变圆，胞浆红染，核固缩呈蓝黑色。浓染的凋亡细胞随TNF-α浓度的增高而增多，并有凋亡细胞脱落遗留的空白区。透射电镜下染色体边集，有细胞固缩、凋亡小体等。
3.DNA断裂片段的琼脂糖凝胶电泳：空白对照DNA双链完整，聚集于尾部；经TNF-α和IFN-γ联合作用的细胞DNA断裂成180bp倍数的片段，呈“梯形条带”。单独TNF-α作用的凋亡细胞较少，其“梯形条带”不明显。
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4.滋养层细胞凋亡指数的检测：在DNA直方图上，凋亡细胞出现二倍体峰(G1峰)的减少，G1峰左侧出现的亚G1峰即凋亡峰(AP峰)。将亚G1峰值转换为细胞凋亡指数。细胞凋亡指数随TNF-α浓度的增加而增大，与空白对照差异有显著性(P<0.05)。结果与活细胞记数基本相符(表1)。
5.细胞内活性氧自由基的变化：2′，7′-二氯二氢荧光素双醋酸盐能自由通过细胞膜，细胞内的酯酶将其分解成乙酸和不能透过细胞膜的离子2′，7′-二氯二氢荧光素而留在细胞中。过氧化物和氢过氧化物能将离子型的2′，7′-二氯二氢荧光素氧化为发荧光的2′，7′-二氯荧光素。可见在加入TNF-α前细胞的荧光较弱(图1)。加入100、500及1 000 U/ml的TNF-α后，荧光强度变化不大；加入3000、5000 U/ml TNF-α后，细胞的荧光强度逐渐增强(图2)，提示此时细胞内活性氧自由基明显增多。
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图1 加入TNF-α前反映滋养细胞内氧自由基量的荧光色度较弱。
2′，7′-二氯二氢荧光素双醋酸盐染色 ×400
图2加入TNF-α后反映滋养细胞内氧自由基量的荧光色度增强。
2′，7′-二氯二氢荧光素双醋酸盐染色 ×400
讨论
胎盘的生长发育是一个动态过程，为更好地适应胎儿的需要，胎盘通过蜕膜细胞及滋养层细胞的增殖与凋亡不断进行组织结构的改建，进而实现其功能的完善。此点在妊娠的前期同样重要。
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TNF-α与IFN-γ是炎症细胞分泌的细胞因子,可诱导多种细胞凋亡。我们根据文献[2]设立TNF-α的浓度梯度，发现高浓度TNF-α单独作用就可引起妊娠早期人绒毛膜滋养层细胞凋亡。光镜和电镜下观察到滋养层细胞核浓染固缩、染色质边集、凋亡小体形成等凋亡的典型形态学变化。DNA琼脂糖凝胶电泳有“梯形条带”，是TNF-α与INF-γ诱导滋养层细胞凋亡的特征性生化改变。TNF-α对DNA合成活跃的人绒毛膜癌滋养层细胞[4]及大鼠妊娠中期的滋养层细胞有杀伤作用[5，6]，对处于静止期的小鼠滋养层细胞无任何效应[7]。但TNF-α能刺激大鼠的绒毛间质细胞增生[6]。推测,TNF-α对胚泡分化来的细胞有多重作用，既抑制迅速增殖的滋养层细胞对母体子宫的过度侵蚀；又可刺激间质细胞生长。在生理情况下，绒毛细胞滋养层细胞分泌TNF-α，诱发绒毛轴心的间质细胞分泌粒-巨噬细胞集落刺激因子和集落刺激因子，调节滋养层细胞增殖、分化及凋亡。在感染及由母儿Rh血型不合、子痫前期引起的缺氧情况下，巨噬细胞可大量分泌白细胞介素1、TNF-α；白细胞介素1也能促进滋养层细胞分泌TNF-α[3]。胎盘内细胞自分泌及旁分泌的平衡被打乱，细胞凋亡、坏死增多，胎盘容易剥离,导致流产或早产。
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IFN-γ单独作用没有诱导绒毛膜滋养层细胞凋亡，但与TNF-α联合作用明显提高TNF-α诱导凋亡的作用。细胞凋亡率具有TNF-α浓度的依赖性。目前研究认为，IFN-γ的协同促凋亡作用与促进APO-1/FAS的表达有关。APO-1/FAS是一种跨膜蛋白，是程序化细胞死亡的重要信号传递系统。克隆的人APO-1/FAS抗原的cDNA，与TNF-α受体的编码有高度同源性。应用免疫组化研究发现,人绒毛滋养层细胞也有APO-1/FAS抗原表达[8]。这方面的机理有待进一步的探讨。
TNF-α诱导细胞凋亡的机理尚不清楚，推测与氧自由基有关。有研究发现，用TNF-α诱导细胞凋亡，伴有氧自由基生成增加；抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸对TNF-α诱导的细胞凋亡有抑制作用[9]。细胞内的氧自由基即可直接损伤DNA ，也可攻击蛋白质，尤其可使酶活性蛋白质的功能丧失，从而诱导细胞凋亡。我们的实验也证实，TNF-α可促进人绒毛膜滋养层细胞内氧自由基的生成，提示氧自由基可能参与了TNF-α诱导滋养层细胞凋亡的过程。
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参考文献
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8 Bamberger AM,Menon RJ,Kuno K,et al.Expression of the apoptosis-inducing fas ligand (FASL) in human first and third trimester placenta and choriocarcinoma cells. J Clin Endocrinol Met, 1997,82:3173-3175.
9 Mayer M,Kim CJ. N-acetyl-L-cysteine is a pluripotent protector against cell death and enhancer of trophic factor-mediated cell survival in vitro.Natl Acad Sci USA,1994,91:7496-7500.
(收稿：1998-08-10 修回：1999-05-11), 百拇医药