人乳头状瘤病毒感染对孕妇和绒毛滋养细胞的影响
作者：陈晓端 赵承洛 张义龙 程琪 吕时铭 陈建萍
单位：浙江大学医学院附属妇产科医院 310006 杭州
关键词：妊娠并发症；感染性；绒毛膜绒毛；乳头状瘤病毒；人；原位杂交；聚合酶链反应
中国妇产科杂志990803 【摘要】 目的 探讨人乳头状瘤病毒(HPV)感染对孕妇和绒毛滋养细胞的影响。方法 观察62例早、中期孕妇尖锐湿疣的病理形态特点，用HPV6/11-DNA 探针原位杂交法检测其绒毛、胎盘组织及其中10例外阴、阴道、宫颈尖锐湿疣组织，并用HPV6/11聚合酶链反应(PCR)方法验证10例绒毛及胎盘组织。结果 孕期尖锐湿疣病变发展快，多部位发生比例高，大体形态、组织形态典型者多。HPV6/11-DNA原位杂交和PCR检测绒毛及胎盘组织HPV均呈阴性，尖锐湿疣组织中HPV阳性8例。结论 早、中期妊娠时，HPV感染不致造成宫内垂直传播，对绒毛滋养细胞及胎儿不构成潜伏感染的危险。
, 百拇医药
Effects of Human Papillomavirus Infection on Pregnant Women and Chorionic Trophoblasts
CHEN Xiaoduan, ZHAO Chengluo, ZHANG Yilong, et al.
Affiliated Obstetrics and Gynecology Hospital, Zhejiang University, Hangzhou 310006
【Abstract】 Objective To evaluate the effects of human papilloma virus (HPV) infection on pregnant women and chorionic trophoblasts. Methods The morphological characters were observed from 62 pregnant women with condyloma acuminatum during the first and second trimester. In situ hybridization (ISH) was performed to detect HPV 6/11 in chorionic villi of all these cases. In 10 cases, ISH was also performed in condyloma acuminatum of vulva, vaginal and cervix. In 10 cases HPV 6/11 was detected by polymerase chain reaction (PCR) in chorionic villi as well. Results The lesions condyloma acuminatum developed rapidly during pregnancy. Multiple lesions were found usually, and the gross appearances and histological features were more typical. Using ISH and PCR to detect HPV 6/11-DNA in chorionic villi all showed negative. 8 of 10 cases were positive in condyloma acuminatum sites by ISH. Conclusions HPV infection does not make vertical transmission during first and second trimester. It does not increase the potential risk for the fetus.
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【Key words】 Pregnancy complications, infections Chorionic villi Papillomavirus, human In situ hybridization Polymerase chain reaction
近年来，女性生殖道尖锐湿疣的发病率逐渐升高，该病属人乳头状瘤病毒(HPV)引起的性传播性疾病，因好发于年轻女性，因而该病与妊娠的关系值得探讨。本研究旨在了解妊娠期外生殖道尖锐湿疣的病理形态学变化特点，以及孕妇HPV感染对绒毛滋养细胞及胎儿的影响。
资料与方法
一、资料来源
收集1996～1998年我院妊娠合并尖锐湿疣患者人工流产和引产的绒毛及胎盘组织标本62例，年龄20～42岁，平均25岁。孕周5～14周，(早孕52例，中孕10例)，病变发生于外阴32例(51.6%)，宫颈30例(48.4%)，阴道16例(25.8%)，并发两个及两个以上部位者16例(25.8%)。自然病程1周～4月，孕前发病者2人。
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二、方法
1. 原位杂交法：采用HPV 6/11-DNA探针检测62例绒毛、胎盘组织及10例外阴、阴道、宫颈尖锐湿疣组织。探针由解放军总医院分子生物研究室提供。组织切片预处理：标本经10%中性福马林固定，常规脱水，石蜡包埋，切片厚5μm，60℃烤片过夜。常规脱蜡水化，0.2%盐酸浸泡，梯度乙醇脱水,室温干燥组织片。变性:将装有HPV 6/11-DNA型探针的试管置入98～100℃沸水浴10分钟解链,冷却后备用。将已处理的组织片置于80℃ 70%的甲酰胺中10分钟，速入15℃ 95%乙醇冷却2分钟，加入20μl备用的HPV探针,加盖玻片37℃恒温18～20小时。逐级洗涤，山羊血清孵育后，滴加地高辛抗体复合物2小时，加显色剂，避光1～4小时，视染色深浅终止反应，树胶封固，加盖玻片观察。实验设阳性对照。
2. 聚合酶链反应(PCR)检测：随机抽取62例中10例绒毛标本,用PCR检测HPV6/11型，验证以上结果。HPV为伊利康生物技术有限公司产品。方法：将石蜡包埋组织切5μm厚4～5片放入试管中，按操作要求脱蜡后自然风干，加入消化液200μl，55℃振摇3小时，短暂离心，取5 μl上清液作DNA模板。PCR反应体系组成如下：20μl反应液，TaqDNA聚合酶1U，DNA模板5 μl，置94℃ 300S预变性，按下列条件扩增，94℃ 30S，55℃ 30S，72℃ 60S，共35个循环，最后置72℃保温300S，取PCR产物10 μl点样于2%琼脂糖凝胶，电泳30分钟，紫外灯300 nm下观察结果。设阳性对照。
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结果
一、孕期尖锐湿疣的临床及病理学特点
孕期尖锐湿疣除具有与非孕期湿疣的共同特点外，还有以下几点值得关注：(1)病程短，病变发展迅速，大多数患者可明显感觉到病灶的扩大及新病灶的出现。(2)多部位并发比例较高，该病病变部位以外阴多见，宫颈其次，25.8%发生于两个部位以上，与非孕期妇女比较，高10%～15%。(3)病变典型者多，孕期尖锐湿疣形态多呈菜花状，鸡冠花状，常融合成片，质软、色淡红、乳头细而尖。病理检查与临床诊断符合率高。尤其在宫颈部位，非孕期尖锐湿疣常以扁平型为多见，孕期病变与外阴部相类似。(4)组织形态较为典型，棘细胞增生活跃，挖空细胞异型性明显，核分裂相易见。表皮层小血管扩张，炎症细胞浸润，4例呈乳头瘤样改变。
光镜常规观察HPV感染孕妇的绒毛滋养细胞及胎盘组织病理形态与相同孕周正常绒毛滋养细胞无差异。
, 百拇医药 二、绒毛及胎盘组织检测结果
原位杂交检测62例绒毛滋养细胞及胎盘组织HPV6/11均呈阴性，即HPV感染孕妇无一例绒毛滋养细胞检出HPV6/11。10例外生殖器尖锐湿疣活检组织HPV6/11阳性8例。PCR检测10例绒毛滋养细胞及胎盘组织均呈阴性。
讨论
一、HPV感染与妊娠
HPV属乳多空病毒科，是最小的DNA病毒，呈球形。直径45～55nm，形态亚基72个，有衣壳蛋白和棒状粒子，核酸为双链DNA[1]。病毒在细胞核内复制，生长周期较长，能引起潜伏或慢性感染。孕期由于全身内分泌改变，雌激素、孕激素的作用，细胞免疫功能降低，局部免疫力低下，使孕妇更易发生HPV感染，且感染后病变容易进展，不易治愈。
二、HPV与宫内感染
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HPV是否会造成宫内感染尚无定论。目前，虽无HPV感染与流产、早产、死胎或畸形有关的报道，但先天性尖锐湿疣及喉乳头瘤可见报道，其HPV类型与生殖系统尖锐湿疣相同，而且其母亲大多有生殖系统湿疣病史[2-3]，曾认为系分娩过程中接触产道所感染，但无法解释剖宫产新生儿阴茎包皮、口腔及羊水中HPV的存在，Tseng等[4]对52例晚期妊娠妇女的外周血单核细胞、宫颈及阴道脱落细胞及其新生儿的脐血进行HPV-DNA检测，发现孕妇外周血单核细胞及新生儿脐血中同时存在相同的HPV-DNA，提示HPV可引起病毒血症，感染可能来自于产前的胎盘血流，即除性和直接接触的传播途径外，还存在宫内感染这一母儿间的传播途径。
马玉珠等[5]报道，对不同孕周妇女用PCR方法检测宫颈亚临床感染情况，阳性率高达28.9%，对HPV阳性孕妇的新生儿脐血、羊水、新生儿口腔分泌物进行HPV检测，其中脐血阳性3例，羊水阳性5例，新生儿口腔分泌物阳性3例。HPV引起的较高的隐性感染率值得大家关注。
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三、HPV感染与绒毛滋养细胞
胎盘是母儿间唯一的通道，绒毛滋养细胞具有角蛋白表达特性，而角蛋白恰恰是HPV生长的必要条件。因此，妊娠期HPV感染是否会引起滋养细胞绒毛改变，是否会致胎儿体内HPV的潜伏，是否对胎儿造成影响？是我们所关心的问题。
通过对62例早、中孕期尖锐湿疣孕妇的绒毛、胎盘组织进行HPV6/11-DNA原位杂交检测，并随机选取10例绒毛标本进行PCR方法检测HPV6/11，均无阳性发现。观察病理形态变化，与正常绒毛滋养细胞无明显差异。可以认为，早、中期妊娠时HPV感染不致造成胎儿感染，原因可能为(1)HPV主要由直接接触传染，而非血行传播。(2)HPV的易感细胞为鳞状细胞，病变部位为皮肤或粘膜组织，绒毛组织结构不适合HPV停留生长。(3)早、中期妊娠时绒毛组织滋养细胞形成较完整的双层结构，HPV即使进入血循环，因为其衣壳蛋白质量较大，难于通过胎盘屏障。实验结果证明，早、中期妊娠的HPV感染不致造成宫内的垂直传播，对胎儿不构成潜在感染的威胁，继续妊娠是安全可靠的。
, http://www.100md.com
晚期妊娠HPV感染对胎儿的影响，因胎盘屏障作用较早、中期妊娠减弱；分娩过程影响因素增多，加上标本收集困难，本文暂不作讨论。新生儿先天性乳头状瘤病毒被单独分类距今已有100余年，但病因仍在探讨中，是否会有产道以外的其他途径感染，有待进一步的研究。
参考文献
1 杜平，朱关福，刘湘云. 现代临床病毒学. 第1版. 北京：人民军医出版社. 1991.436-437.
2 杜平，朱关福，刘湘云. 现代临床病毒学. 第1版. 北京：人民军医出版社. 1991. 680-681.
3 Moscicki AB. Genital HPV infection in children and adolescents. Obstet Gynecol Clin North Am, 1996,23:675-697.
4 Tseng CJ, Lin CY, Wang RL, et al. Possible transplacental transmission of human papillomaviruses. Am J Obstet Gynecol,1992,16:35-37.
5 马玉珠,韩建勋,刘竞成,等.妊娠期人乳头状瘤病毒的亚临床型感染. 中华妇产科杂志,1997, 32: 555-556.
(收稿：1998-12-21 修回：1999-05-20), 百拇医药
单位：浙江大学医学院附属妇产科医院 310006 杭州
关键词：妊娠并发症；感染性；绒毛膜绒毛；乳头状瘤病毒；人；原位杂交；聚合酶链反应
中国妇产科杂志990803 【摘要】 目的 探讨人乳头状瘤病毒(HPV)感染对孕妇和绒毛滋养细胞的影响。方法 观察62例早、中期孕妇尖锐湿疣的病理形态特点，用HPV6/11-DNA 探针原位杂交法检测其绒毛、胎盘组织及其中10例外阴、阴道、宫颈尖锐湿疣组织，并用HPV6/11聚合酶链反应(PCR)方法验证10例绒毛及胎盘组织。结果 孕期尖锐湿疣病变发展快，多部位发生比例高，大体形态、组织形态典型者多。HPV6/11-DNA原位杂交和PCR检测绒毛及胎盘组织HPV均呈阴性，尖锐湿疣组织中HPV阳性8例。结论 早、中期妊娠时，HPV感染不致造成宫内垂直传播，对绒毛滋养细胞及胎儿不构成潜伏感染的危险。
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Effects of Human Papillomavirus Infection on Pregnant Women and Chorionic Trophoblasts
CHEN Xiaoduan, ZHAO Chengluo, ZHANG Yilong, et al.
Affiliated Obstetrics and Gynecology Hospital, Zhejiang University, Hangzhou 310006
【Abstract】 Objective To evaluate the effects of human papilloma virus (HPV) infection on pregnant women and chorionic trophoblasts. Methods The morphological characters were observed from 62 pregnant women with condyloma acuminatum during the first and second trimester. In situ hybridization (ISH) was performed to detect HPV 6/11 in chorionic villi of all these cases. In 10 cases, ISH was also performed in condyloma acuminatum of vulva, vaginal and cervix. In 10 cases HPV 6/11 was detected by polymerase chain reaction (PCR) in chorionic villi as well. Results The lesions condyloma acuminatum developed rapidly during pregnancy. Multiple lesions were found usually, and the gross appearances and histological features were more typical. Using ISH and PCR to detect HPV 6/11-DNA in chorionic villi all showed negative. 8 of 10 cases were positive in condyloma acuminatum sites by ISH. Conclusions HPV infection does not make vertical transmission during first and second trimester. It does not increase the potential risk for the fetus.
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【Key words】 Pregnancy complications, infections Chorionic villi Papillomavirus, human In situ hybridization Polymerase chain reaction
近年来，女性生殖道尖锐湿疣的发病率逐渐升高，该病属人乳头状瘤病毒(HPV)引起的性传播性疾病，因好发于年轻女性，因而该病与妊娠的关系值得探讨。本研究旨在了解妊娠期外生殖道尖锐湿疣的病理形态学变化特点，以及孕妇HPV感染对绒毛滋养细胞及胎儿的影响。
资料与方法
一、资料来源
收集1996～1998年我院妊娠合并尖锐湿疣患者人工流产和引产的绒毛及胎盘组织标本62例，年龄20～42岁，平均25岁。孕周5～14周，(早孕52例，中孕10例)，病变发生于外阴32例(51.6%)，宫颈30例(48.4%)，阴道16例(25.8%)，并发两个及两个以上部位者16例(25.8%)。自然病程1周～4月，孕前发病者2人。
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二、方法
1. 原位杂交法：采用HPV 6/11-DNA探针检测62例绒毛、胎盘组织及10例外阴、阴道、宫颈尖锐湿疣组织。探针由解放军总医院分子生物研究室提供。组织切片预处理：标本经10%中性福马林固定，常规脱水，石蜡包埋，切片厚5μm，60℃烤片过夜。常规脱蜡水化，0.2%盐酸浸泡，梯度乙醇脱水,室温干燥组织片。变性:将装有HPV 6/11-DNA型探针的试管置入98～100℃沸水浴10分钟解链,冷却后备用。将已处理的组织片置于80℃ 70%的甲酰胺中10分钟，速入15℃ 95%乙醇冷却2分钟，加入20μl备用的HPV探针,加盖玻片37℃恒温18～20小时。逐级洗涤，山羊血清孵育后，滴加地高辛抗体复合物2小时，加显色剂，避光1～4小时，视染色深浅终止反应，树胶封固，加盖玻片观察。实验设阳性对照。
2. 聚合酶链反应(PCR)检测：随机抽取62例中10例绒毛标本,用PCR检测HPV6/11型，验证以上结果。HPV为伊利康生物技术有限公司产品。方法：将石蜡包埋组织切5μm厚4～5片放入试管中，按操作要求脱蜡后自然风干，加入消化液200μl，55℃振摇3小时，短暂离心，取5 μl上清液作DNA模板。PCR反应体系组成如下：20μl反应液，TaqDNA聚合酶1U，DNA模板5 μl，置94℃ 300S预变性，按下列条件扩增，94℃ 30S，55℃ 30S，72℃ 60S，共35个循环，最后置72℃保温300S，取PCR产物10 μl点样于2%琼脂糖凝胶，电泳30分钟，紫外灯300 nm下观察结果。设阳性对照。
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结果
一、孕期尖锐湿疣的临床及病理学特点
孕期尖锐湿疣除具有与非孕期湿疣的共同特点外，还有以下几点值得关注：(1)病程短，病变发展迅速，大多数患者可明显感觉到病灶的扩大及新病灶的出现。(2)多部位并发比例较高，该病病变部位以外阴多见，宫颈其次，25.8%发生于两个部位以上，与非孕期妇女比较，高10%～15%。(3)病变典型者多，孕期尖锐湿疣形态多呈菜花状，鸡冠花状，常融合成片，质软、色淡红、乳头细而尖。病理检查与临床诊断符合率高。尤其在宫颈部位，非孕期尖锐湿疣常以扁平型为多见，孕期病变与外阴部相类似。(4)组织形态较为典型，棘细胞增生活跃，挖空细胞异型性明显，核分裂相易见。表皮层小血管扩张，炎症细胞浸润，4例呈乳头瘤样改变。
光镜常规观察HPV感染孕妇的绒毛滋养细胞及胎盘组织病理形态与相同孕周正常绒毛滋养细胞无差异。
, 百拇医药 二、绒毛及胎盘组织检测结果
原位杂交检测62例绒毛滋养细胞及胎盘组织HPV6/11均呈阴性，即HPV感染孕妇无一例绒毛滋养细胞检出HPV6/11。10例外生殖器尖锐湿疣活检组织HPV6/11阳性8例。PCR检测10例绒毛滋养细胞及胎盘组织均呈阴性。
讨论
一、HPV感染与妊娠
HPV属乳多空病毒科，是最小的DNA病毒，呈球形。直径45～55nm，形态亚基72个，有衣壳蛋白和棒状粒子，核酸为双链DNA[1]。病毒在细胞核内复制，生长周期较长，能引起潜伏或慢性感染。孕期由于全身内分泌改变，雌激素、孕激素的作用，细胞免疫功能降低，局部免疫力低下，使孕妇更易发生HPV感染，且感染后病变容易进展，不易治愈。
二、HPV与宫内感染
, 百拇医药
HPV是否会造成宫内感染尚无定论。目前，虽无HPV感染与流产、早产、死胎或畸形有关的报道，但先天性尖锐湿疣及喉乳头瘤可见报道，其HPV类型与生殖系统尖锐湿疣相同，而且其母亲大多有生殖系统湿疣病史[2-3]，曾认为系分娩过程中接触产道所感染，但无法解释剖宫产新生儿阴茎包皮、口腔及羊水中HPV的存在，Tseng等[4]对52例晚期妊娠妇女的外周血单核细胞、宫颈及阴道脱落细胞及其新生儿的脐血进行HPV-DNA检测，发现孕妇外周血单核细胞及新生儿脐血中同时存在相同的HPV-DNA，提示HPV可引起病毒血症，感染可能来自于产前的胎盘血流，即除性和直接接触的传播途径外，还存在宫内感染这一母儿间的传播途径。
马玉珠等[5]报道，对不同孕周妇女用PCR方法检测宫颈亚临床感染情况，阳性率高达28.9%，对HPV阳性孕妇的新生儿脐血、羊水、新生儿口腔分泌物进行HPV检测，其中脐血阳性3例，羊水阳性5例，新生儿口腔分泌物阳性3例。HPV引起的较高的隐性感染率值得大家关注。
, 百拇医药
三、HPV感染与绒毛滋养细胞
胎盘是母儿间唯一的通道，绒毛滋养细胞具有角蛋白表达特性，而角蛋白恰恰是HPV生长的必要条件。因此，妊娠期HPV感染是否会引起滋养细胞绒毛改变，是否会致胎儿体内HPV的潜伏，是否对胎儿造成影响？是我们所关心的问题。
通过对62例早、中孕期尖锐湿疣孕妇的绒毛、胎盘组织进行HPV6/11-DNA原位杂交检测，并随机选取10例绒毛标本进行PCR方法检测HPV6/11，均无阳性发现。观察病理形态变化，与正常绒毛滋养细胞无明显差异。可以认为，早、中期妊娠时HPV感染不致造成胎儿感染，原因可能为(1)HPV主要由直接接触传染，而非血行传播。(2)HPV的易感细胞为鳞状细胞，病变部位为皮肤或粘膜组织，绒毛组织结构不适合HPV停留生长。(3)早、中期妊娠时绒毛组织滋养细胞形成较完整的双层结构，HPV即使进入血循环，因为其衣壳蛋白质量较大，难于通过胎盘屏障。实验结果证明，早、中期妊娠的HPV感染不致造成宫内的垂直传播，对胎儿不构成潜在感染的威胁，继续妊娠是安全可靠的。
, http://www.100md.com
晚期妊娠HPV感染对胎儿的影响，因胎盘屏障作用较早、中期妊娠减弱；分娩过程影响因素增多，加上标本收集困难，本文暂不作讨论。新生儿先天性乳头状瘤病毒被单独分类距今已有100余年，但病因仍在探讨中，是否会有产道以外的其他途径感染，有待进一步的研究。
参考文献
1 杜平，朱关福，刘湘云. 现代临床病毒学. 第1版. 北京：人民军医出版社. 1991.436-437.
2 杜平，朱关福，刘湘云. 现代临床病毒学. 第1版. 北京：人民军医出版社. 1991. 680-681.
3 Moscicki AB. Genital HPV infection in children and adolescents. Obstet Gynecol Clin North Am, 1996,23:675-697.
4 Tseng CJ, Lin CY, Wang RL, et al. Possible transplacental transmission of human papillomaviruses. Am J Obstet Gynecol,1992,16:35-37.
5 马玉珠,韩建勋,刘竞成,等.妊娠期人乳头状瘤病毒的亚临床型感染. 中华妇产科杂志,1997, 32: 555-556.
(收稿：1998-12-21 修回：1999-05-20), 百拇医药