检测颗粒细胞凋亡对胚胎质量及其种植潜能的预测
作者：梁晓燕 庄广伦 周灿权 张敏芳 李蓉 李满 孔庆喻
单位：中山医科大学附属第一医院生殖医学研究中心 510080 广州
关键词：
中华妇产科杂志990917
从胚胎的角度看，目前临床上仅限于以镜下的形态学观察来确定移植胚胎的质量。 1997年Xia报道在单精子胞浆内注射(ICSI)治疗中，通过对卵母细胞评分、分级及相应移植胚胎的选择，显著提高了ICSI的临床妊娠率[1]。已证实卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡密切相关，因此推测，卵丘颗粒细胞的功能状态将直接影响卵母细胞的质量，这对于随后胚胎的生存潜能尤其重要。本研究对卵丘颗粒细胞的凋亡程度进行检测，评估卵母细胞和受精卵的质量，观察胚胎相应的卵丘颗粒细胞凋亡程度与临床妊娠率的关系，根据胚胎的卵裂细胞数及颗粒细胞凋亡检测结果选择移植胚胎，与体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的临床妊娠率的关系。
, 百拇医药
一、资料和方法
1.研究对象：收集少、弱精及无精症要求行ICSI的患者共28例(28个周期)，年龄23～38岁，平均(29.0±2.8)岁。不孕时间3～9年，因以下原因进行ICSI：(1)活动精子的数量<2000 000/ml；(2)前次周期的受精率<20%；(3)阻塞性无精症。所有患者使用相同促排卵方案：促黄体素释放激素(Busereline，德国Hoechst公司产品)/促卵泡成熟素(Metrodin，瑞士Serono公司产品；人体绝经期促性腺激素(Pergonal，瑞士Serono公司产品)，当至少4个卵泡的直径达到17 mm以上时，注射人绒毛膜促性腺激素Profasi瑞士Serono公司产品)10000 IU，36小时后，在B超指引下经阴道取卵，共取卵268个，平均每周期取卵9.5个，周期妊娠率为32%。根据是否妊娠分为妊娠组与未妊娠组进行比较。
2.方法：取卵后将卵母细胞置于37℃、5%二氧化碳培养箱内，用Earl培养液(美国Sigma公司产品)培养3～4小时，在40倍显微镜下把卵细胞移入40 IU/ml透明质酸酶(美国Sigma公司产品)中30秒，然后用吸管轻轻吹打下卵丘颗粒细胞。成熟卵母细胞(MII期)逐个进行显微注射。48小时后，根据镜下观察胚胎分裂的卵裂数及其评分选择移植胚胎[2]。ICSI的同时，分别收集上述患者每个卵母细胞相应的颗粒细胞，分别立刻移入75%的冰乙醇内，轻摇、过夜固定，用离心或稀释的方法调节细胞浓度至3～10×106个/ml。加入碘化丙锭标记细胞核的双链DNA及RNA，当发生凋亡时，细胞内DNA部分断裂成小片段，漏出细胞，DNA丢失，细胞核内DNA含量下降。经流式细胞仪检测DNA含量后，计算凋亡细胞所占的百分比，比较妊娠组、非妊娠组移植胚胎的相应颗粒细胞凋亡程度，及与卵裂细胞数、胚胎评分、妊娠率及年龄的关系。
, 百拇医药
3. 统计学方法：采用配对t检验及成组比较t检验。
二、结果
1.妊娠组中移植胚胎与未移植胚胎比较:妊娠组(9例)115个胚胎中，移植胚胎共37个(平均4.1个胚胎)，移植胚胎的凋亡指数为(6.6±2.9)%，显著低于未移植的胚胎的(10.7±4.3)%(P<0.05)。
2.非妊娠组移植胚胎与未移植胚胎比较:非妊娠组(19例)的153 个胚胎，移植胚胎共58个(平均3.1个胚胎)，卵丘颗粒细胞凋亡指数移植胚胎为(13.4±9.6)%，未移植胚胎为(14.5±9.4)%，(P>0.05)。
3. 妊娠组与未妊娠组比较:二组平均凋亡指数比较，差异有显著性(P<0.05)。妊娠组的平均年龄为(30.0±3.2)岁，未妊娠组为(31.2±4.6)岁，差异无显著性。年龄与凋亡指数之间在两组均无显著相关性。
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两组的受精数及卵裂细胞数相似，选出的植入胚胎总评分相似(表1)。
表1 妊娠组与未妊娠组受精及卵裂数的比较(
±s) 组别
总例数
受精数(个)
胚胎数(个)
植入胚胎总评分
妊娠组
9
8.5±4.2
8.2±4.2
, 百拇医药
21.6±1.9
未妊娠组
19
6.4±4.0
6.3±4.3
18.5±5.6
三、讨论
Hughes等[3]和Palumbo等[4]已证实，在正常卵巢的周期性卵泡发育过程中，各期卵泡的闭锁与颗粒细胞凋亡密切相关。过强的细胞凋亡会引起组织细胞的退化、萎缩及功能低下，卵丘颗粒细胞异常过强的细胞凋亡可能影响卵母细胞质量，卵丘的质量对相应胚胎的生存潜能尤其重要。
细胞的凋亡最先出现的形态学变化是染色体的改变,如DNA量的异常、DNA链的断裂和凋亡小体的出现，通过标记DNA或DNA末端可检测到细胞凋亡的程度。本研究将颗粒细胞凋亡的研究用于临床，在短时间内通过对卵丘颗粒细胞DNA含量的自动测定，以实现在胚胎移植前预测胚胎的质量。
, 百拇医药
在本研究中仍按胚胎细胞形态及卵裂数(评分)选择需要移植的胚胎，最后根据临床妊娠结果及流式细胞仪的检测结果回顾性分析。发现，妊娠组凋亡指数明显低于未妊娠组(P<0.05)；妊娠组移植胚胎的凋亡指数显著低于未移植胚胎(P<0.05)；在未妊娠组中，移植与未移植胚胎间凋亡指数无明显差异。而妊娠组与非妊娠组的年龄相似，取卵数、受精率、卵裂率及相应胚胎的评分均无显著性差异。显然，低凋亡指数的颗粒细胞的相应胚胎，移植后成活率高，颗粒细胞凋亡指数较高的卵母细胞质量不高，Nakahara等[5，6]也证实，颗粒细胞凋亡小体数低的卵泡其相应的卵母细胞质量好。临床上移植的胚胎数是有限的，在胚胎同样评分的情形下，究竟选择哪个胚胎进行移植，用相应卵丘颗粒细胞的凋亡指数来指导选择植入胚胎是有益的。随着助孕技术的发展，体外培养环境的改善，以及对种植窗的深入研究，妊娠率正得到稳步的提高，为避免多胎妊娠的发生，植入胚胎数将会越来越少，因此，植入胚胎的质量不容忽视。
本课题受广东省卫生厅基金资助(基金号：A1998158)
, http://www.100md.com
参考文献
1 Xia P. Intracytoplasmic sperm injection: correlation of oocyte grade based on polar body, perivitelline space and cytoplasmic inclusions with fertilization rate and embryo quality. Human Reprod, 1997, 12: 1750-1755.
2 Puissant F. Embryo scoring as a prognostic tool in IVF treatment. Hum Repord, 1987,2:705-708.
3 Hughes FM, Jr Gorospe WC. Biochemical identification of apoptosis (programmed cell death) in granulosa cells: evidence for a potential mechanism underlying follicular atresia. Endocrinology, 1991,129:2415-2422.
, http://www.100md.com
4 Palumbo A, Yeh J. In situ localization of apoptosis in the rat ovary during follicle atresia. Biol Reprod, 1994,54：183-187.
5 Nakahara K, Saito H, Saito T, et al. The incidence of apoptotic bodies in membrana granulosa can predict prognosis of ova from patients participating in in vitro fertilization programs.Fertil Steril, 1997, 68: 312-317.
6 Nakahara K, Saito H, Saito T, et al. Incidence of apoptosis bodies in membrana granulosa of the patients participating in an in vitro fertilization program. Fertil Steril, 1997, 67:302-308.
(收稿：1998-12-09 修回：1999-06-25), http://www.100md.com
单位：中山医科大学附属第一医院生殖医学研究中心 510080 广州
关键词：
中华妇产科杂志990917
从胚胎的角度看，目前临床上仅限于以镜下的形态学观察来确定移植胚胎的质量。 1997年Xia报道在单精子胞浆内注射(ICSI)治疗中，通过对卵母细胞评分、分级及相应移植胚胎的选择，显著提高了ICSI的临床妊娠率[1]。已证实卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡密切相关，因此推测，卵丘颗粒细胞的功能状态将直接影响卵母细胞的质量，这对于随后胚胎的生存潜能尤其重要。本研究对卵丘颗粒细胞的凋亡程度进行检测，评估卵母细胞和受精卵的质量，观察胚胎相应的卵丘颗粒细胞凋亡程度与临床妊娠率的关系，根据胚胎的卵裂细胞数及颗粒细胞凋亡检测结果选择移植胚胎，与体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的临床妊娠率的关系。
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一、资料和方法
1.研究对象：收集少、弱精及无精症要求行ICSI的患者共28例(28个周期)，年龄23～38岁，平均(29.0±2.8)岁。不孕时间3～9年，因以下原因进行ICSI：(1)活动精子的数量<2000 000/ml；(2)前次周期的受精率<20%；(3)阻塞性无精症。所有患者使用相同促排卵方案：促黄体素释放激素(Busereline，德国Hoechst公司产品)/促卵泡成熟素(Metrodin，瑞士Serono公司产品；人体绝经期促性腺激素(Pergonal，瑞士Serono公司产品)，当至少4个卵泡的直径达到17 mm以上时，注射人绒毛膜促性腺激素Profasi瑞士Serono公司产品)10000 IU，36小时后，在B超指引下经阴道取卵，共取卵268个，平均每周期取卵9.5个，周期妊娠率为32%。根据是否妊娠分为妊娠组与未妊娠组进行比较。
2.方法：取卵后将卵母细胞置于37℃、5%二氧化碳培养箱内，用Earl培养液(美国Sigma公司产品)培养3～4小时，在40倍显微镜下把卵细胞移入40 IU/ml透明质酸酶(美国Sigma公司产品)中30秒，然后用吸管轻轻吹打下卵丘颗粒细胞。成熟卵母细胞(MII期)逐个进行显微注射。48小时后，根据镜下观察胚胎分裂的卵裂数及其评分选择移植胚胎[2]。ICSI的同时，分别收集上述患者每个卵母细胞相应的颗粒细胞，分别立刻移入75%的冰乙醇内，轻摇、过夜固定，用离心或稀释的方法调节细胞浓度至3～10×106个/ml。加入碘化丙锭标记细胞核的双链DNA及RNA，当发生凋亡时，细胞内DNA部分断裂成小片段，漏出细胞，DNA丢失，细胞核内DNA含量下降。经流式细胞仪检测DNA含量后，计算凋亡细胞所占的百分比，比较妊娠组、非妊娠组移植胚胎的相应颗粒细胞凋亡程度，及与卵裂细胞数、胚胎评分、妊娠率及年龄的关系。
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3. 统计学方法：采用配对t检验及成组比较t检验。
二、结果
1.妊娠组中移植胚胎与未移植胚胎比较:妊娠组(9例)115个胚胎中，移植胚胎共37个(平均4.1个胚胎)，移植胚胎的凋亡指数为(6.6±2.9)%，显著低于未移植的胚胎的(10.7±4.3)%(P<0.05)。
2.非妊娠组移植胚胎与未移植胚胎比较:非妊娠组(19例)的153 个胚胎，移植胚胎共58个(平均3.1个胚胎)，卵丘颗粒细胞凋亡指数移植胚胎为(13.4±9.6)%，未移植胚胎为(14.5±9.4)%，(P>0.05)。
3. 妊娠组与未妊娠组比较:二组平均凋亡指数比较，差异有显著性(P<0.05)。妊娠组的平均年龄为(30.0±3.2)岁，未妊娠组为(31.2±4.6)岁，差异无显著性。年龄与凋亡指数之间在两组均无显著相关性。
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两组的受精数及卵裂细胞数相似，选出的植入胚胎总评分相似(表1)。
表1 妊娠组与未妊娠组受精及卵裂数的比较(
±s) 组别总例数
受精数(个)
胚胎数(个)
植入胚胎总评分
妊娠组
9
8.5±4.2
8.2±4.2
, 百拇医药
21.6±1.9
未妊娠组
19
6.4±4.0
6.3±4.3
18.5±5.6
三、讨论
Hughes等[3]和Palumbo等[4]已证实，在正常卵巢的周期性卵泡发育过程中，各期卵泡的闭锁与颗粒细胞凋亡密切相关。过强的细胞凋亡会引起组织细胞的退化、萎缩及功能低下，卵丘颗粒细胞异常过强的细胞凋亡可能影响卵母细胞质量，卵丘的质量对相应胚胎的生存潜能尤其重要。
细胞的凋亡最先出现的形态学变化是染色体的改变,如DNA量的异常、DNA链的断裂和凋亡小体的出现，通过标记DNA或DNA末端可检测到细胞凋亡的程度。本研究将颗粒细胞凋亡的研究用于临床，在短时间内通过对卵丘颗粒细胞DNA含量的自动测定，以实现在胚胎移植前预测胚胎的质量。
, 百拇医药
在本研究中仍按胚胎细胞形态及卵裂数(评分)选择需要移植的胚胎，最后根据临床妊娠结果及流式细胞仪的检测结果回顾性分析。发现，妊娠组凋亡指数明显低于未妊娠组(P<0.05)；妊娠组移植胚胎的凋亡指数显著低于未移植胚胎(P<0.05)；在未妊娠组中，移植与未移植胚胎间凋亡指数无明显差异。而妊娠组与非妊娠组的年龄相似，取卵数、受精率、卵裂率及相应胚胎的评分均无显著性差异。显然，低凋亡指数的颗粒细胞的相应胚胎，移植后成活率高，颗粒细胞凋亡指数较高的卵母细胞质量不高，Nakahara等[5，6]也证实，颗粒细胞凋亡小体数低的卵泡其相应的卵母细胞质量好。临床上移植的胚胎数是有限的，在胚胎同样评分的情形下，究竟选择哪个胚胎进行移植，用相应卵丘颗粒细胞的凋亡指数来指导选择植入胚胎是有益的。随着助孕技术的发展，体外培养环境的改善，以及对种植窗的深入研究，妊娠率正得到稳步的提高，为避免多胎妊娠的发生，植入胚胎数将会越来越少，因此，植入胚胎的质量不容忽视。
本课题受广东省卫生厅基金资助(基金号：A1998158)
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参考文献
1 Xia P. Intracytoplasmic sperm injection: correlation of oocyte grade based on polar body, perivitelline space and cytoplasmic inclusions with fertilization rate and embryo quality. Human Reprod, 1997, 12: 1750-1755.
2 Puissant F. Embryo scoring as a prognostic tool in IVF treatment. Hum Repord, 1987,2:705-708.
3 Hughes FM, Jr Gorospe WC. Biochemical identification of apoptosis (programmed cell death) in granulosa cells: evidence for a potential mechanism underlying follicular atresia. Endocrinology, 1991,129:2415-2422.
, http://www.100md.com
4 Palumbo A, Yeh J. In situ localization of apoptosis in the rat ovary during follicle atresia. Biol Reprod, 1994,54：183-187.
5 Nakahara K, Saito H, Saito T, et al. The incidence of apoptotic bodies in membrana granulosa can predict prognosis of ova from patients participating in in vitro fertilization programs.Fertil Steril, 1997, 68: 312-317.
6 Nakahara K, Saito H, Saito T, et al. Incidence of apoptosis bodies in membrana granulosa of the patients participating in an in vitro fertilization program. Fertil Steril, 1997, 67:302-308.
(收稿：1998-12-09 修回：1999-06-25), http://www.100md.com