米非司酮对人绒毛膜癌细胞株体外作用的观察
作者：孙丽君 郑英 王春萍 崔金全 陶银贵 谭丽 廖予妹
单位：河南医科大学第二附属医院妇产科 450003 郑州
关键词：米非司酮；绒毛膜癌；Ki-67抗原
中华妇产科杂志990911 【摘要】 目的 探讨米非司酮对人绒毛膜癌细胞株JAR的作用。方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法，观察1、5、10、20μmol/L的米非司酮对JAR细胞的杀伤活性，通过免疫组化及酶联免疫法(ELISA)检测用药后，JAR细胞核增殖抗原Ki-67的表达及hCG分泌的变化。结果 4种浓度的米非司酮对JAR细胞均有杀伤作用，并呈剂量依赖性，以20 μmol/L浓度的米非司酮作用最强，杀伤率达73.19%。5 μmol/L的米非司酮与JAR细胞作用72小时，Ki-67抗原阳性率明显下降，第3天hCG分泌量明显下降。结论 米非司酮对JAR细胞具有细胞增殖抑制及细胞毒作用，并可抑制其hCG的分泌。
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Effects of Mifepristone on Choriocarcinoma Cell Line JAR in vitro
SUN Lijun, ZHENG Ying, WANG Chunping, et al.
The Second Affiliated Hospital, Henan Medical University, Zhengzhou 450003
【Abstract】 Objective To investigate the effects of mifepristone on cell proliferation and hCG secretion of human choriocarcinoma cell line JAR and the cytotoxic effects of mifepristone on this cell line. Methods The cytotoxic effects of four different concentration of mifeprstone (1、5、10、20 μmol/L) were assessed with methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) colorimetric assay. The expression of nuclear proliferative antigen Ki-67 and the amount of hCG secreation in JAR cells were detected with avidin-biotin complex method, immuno-histochemical method and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) respectively. Results There were dose-dependent cytotoxic effects on JAR cells in four different concentrations of mifepristone. This effect plateaued at 20 μmol/L. When the JAR cells were exposed to 5 μmol/L mifepristone for 72h, the expression of Ki-67 antigen was declined and the amount of hCG secretion was decreased significantly at the third day.Conclusion In vitro, mifepristone has cytostatic and cytotoxic effects on JAR cell line and may inhibit the secretion of hCG in JAR cells.
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【Key words】 Mifepristone Choriocarcinoma Ki-67 antigen
近年来，国外一些学者发现，孕激素受体拮抗剂——米非司酮对某些孕激素受体阳性的肿瘤有一定抑制作用。许多体内外试验证实，米非司酮对人乳腺癌[1]、脑膜瘤[2]、子宫肌瘤[3]等均有明显的抑制作用。有关米非司酮对绒毛膜癌的作用未见报道。本研究将米非司酮直接作用于人绒毛膜癌细胞株JAR，观察米非司酮对JAR细胞的杀伤活性及其对该细胞增殖和hCG分泌的影响。
材料与方法
一、材料
1.瘤细胞：细胞株JAR，为人胎盘绒毛膜癌细胞株，由中国科学院上海细胞生物学研究所提供。
2.药物与试剂来源：四甲基偶氮唑蓝(MTT)购于美国Sigma公司；兔抗人Ki-67抗体由美国Zymed公司提供；卵白素生物素复合物法(ABC)抗兔IgG免疫组化试剂盒，购于北京华美公司；β-hCG酶联免疫试剂盒，由美国Maxim公司提供；米非司酮由上海华联制药厂提供。
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二、方法
1.细胞培养：将JAR细胞培养于含10%胎牛血清的PRMI-1640培养液内，0.25%胰酶消化传代。
2.MTT比色法测定：取对数生长期JAR细胞，以1×105个/ml，每孔100 μl，接种于96孔培养板中，于37℃、5%二氧化碳恒温培养箱内培养，24小时后换入分别含有1、5、10、20 μmol/L的米非司酮培养液(实验组)；另设对照组，培养液中含0.2%(V/V)乙醇，置培养箱内继续培养。隔日更换1次同种新鲜培养液，显微镜每天观察细胞生长形态。加入米非司酮5天后，参照温汉平等[4]的方法，经酶标仪以570nm的波长测定各孔吸光度(A)值，同法重复做3个培养板。
3.检测JAR细胞Ki-67抗原的表达：JAR细胞以1×105个/ml，接种于50 ml培养瓶内(每瓶4 ml)，培养24小时后更换培养液。实验组含米非司酮5 μmol/L，对照组含乙醇0.05%(V/V)。继续培养72小时，每组各取5瓶，用0.25%胰酶消化、吹打，制成细胞涂片，按常规方法进行ABC免疫组化染色，封片后显微镜下观察结果，以倪灿荣[5]的标准判断阳性结果。Ki-67阳性细胞均为细胞核着色，表现为细胞核呈棕黄色，或棕色网状，或细胞核内出现许多棕色小颗粒。高倍镜下计数每张涂片上500个细胞内Ki-67抗原阳性细胞数，计算阳性细胞百分率。
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4.JAR细胞培养上清液β-hCG的测定：同上述方法，接种JAR细胞于50 ml培养瓶内，实验组及对照组各取5瓶，分别收集第2天及第3天各培养瓶内的细胞上清液，采用酶联免疫法(ELISA)测定其β-hCG含量。每份标本重复测2次，取其平均值，质控符合要求。
三、统计学处理
所得实验数据经SAS统计软件包处理，分别采用方差分析及t检验。
结果
一、米非司酮对JAR细胞杀伤活性的测定
将实验组4种浓度的米非司酮作用于JAR细胞，显微镜观察发现，前2天细胞变化不明显，2天以后细胞增殖逐渐减慢，胞质粗糙，内有颗粒堆积，部分细胞附壁能力下降，继而脱落死亡，碎裂成块。以20 μmol/L浓度的米非司酮作用最明显。而对照组细胞透明，附壁能力好。4种浓度的米非司酮与JAR细胞作用5天，MTT比色法测定结果显示，各浓度米非司酮A值呈不同程度的下降，差异有极显著性(P<0.01)。见表1。
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表1 不同浓度的米非司酮对JAR细胞的杀伤率 组别
A值(
±s)
杀伤率(%)
实验组(μmol/L)
1
1.118±0.109
12.86
5
0.933±0.107
27.28
10
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0.488±0.106
61.96
20
0.344±0.049
73.19
对照组
1.283±0.122
注：实验组与对照组比较，实验组间两两浓度比较，P均<0.01
二、米非司酮对JAR细胞Ki-67抗原表达的作用
免疫组化染色结果显示，实验组5 μmol/L的米非司酮与JAR细胞作用72小时，Ki-67抗原表达阳性率为(46.59±2.44)%；而对照组为(63.88±2.83)%，实验组细胞Ki-67抗原阳性率较对照组明显下降，差异有极显著性(P<0.01)，见图1，2。
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图1 米非司酮5μmol/L与JAR细胞作用72小时，Ki-67抗原表达阴性，细胞不显色。ABC染色×400
图2 对照组JAR细胞Ki-67抗原表达阳性，细胞核呈棕黄色及可见棕色小颗粒。ABC染色×400
三、米非司酮对JAR细胞hCG分泌的作用
米非司酮作用第2天，实验组hCG分泌量为(16.78±2.70)IU/L，对照组为(19.65±2.10)IU/L；第3天实验组为(10.20±1.83)IU/L，对照组为(34.28±2.57)IU/L。实验组第3天JAR细胞hCG分泌量较对照组明显减少，差异有极显著性(P<0.01)；实验组第3天hCG分泌量较第2天也明显减少，差异有显著性(P<0.05)。
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讨论
一、米非司酮对JAR细胞的杀伤活性
鉴于米非司酮有效的孕激素拮抗作用，国外一些学者首先将其应用于孕激素受体阳性的乳腺癌的治疗。大量研究表明，米非司酮对多种乳腺癌细胞具有细胞增殖抑制及细胞毒作用，即杀伤作用。Rose等[6]发现，米非司酮对人卵巢上皮癌癌细胞也有上述作用。本研究将米非司酮直接作用于人绒毛膜癌JAR细胞株，根据米非司酮治疗乳腺癌的临床用药量及其抗早孕时的血药浓度，选择1、5、10、20 μmol/L的米非司酮为实验组用药浓度。MTT比色法测定结果发现，上述浓度的米非司酮对JAR细胞均有杀伤作用，且随药物浓度的增加，杀伤作用加强，表现为剂量依赖性关系，显微镜观察结果也证实了上述变化。
二、米非司酮对JAR细胞增殖的影响
Ki-67抗原为人增殖期细胞特异表达的核蛋白。Ki-67抗原可识别细胞周期中G1后期，S期、G2期和M期细胞核及染色体，而G0及G1早期细胞不被标记，故可作为评估增殖细胞生长组分的指标之一[7]。本研究应用ABC免疫组化染色发现，5 μmol/L的米非司酮作用JAR细胞72小时，Ki-67抗原表达阳性率较对照组显著下降，说明细胞增殖受到明显抑制，细胞可能被阻滞于G0及G1早期而不被染色。有关研究发现，米非司酮可使MCF-7乳腺癌细胞阻滞于G0/G1期，不能进入S期及G2/M期而抑制细胞增殖，认为米非司酮可能为一特异性细胞周期抑制因子。本研究结果提示，米非司酮可能对JAR细胞周期产生了影响，使细胞阻滞于G0及G1早期，抑制细胞增殖。
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三、米非司酮对JAR细胞hCG分泌的影响
绒毛膜癌细胞具有分泌hCG的功能，临床上将hCG检测作为该肿瘤的诊断、疗效观察及预后判断的重要指标。本研究通过ELISA检测发现，5 μmol/L的米非司酮作用于JAR细胞，第3天细胞β-hCG分泌量较对照组明显下降，说明米非司酮对JAR细胞hCG的分泌产生了明显的抑制作用。实验组细胞第3天β-hCG分泌量较第2天也明显减少，提示随作用时间的延长，米非司酮抑制JAR细胞hCG分泌的作用加强。有研究发现，0.1～10 μmol/L的米非司酮在体外均可抑制正常胎盘绒毛滋养细胞hCG的分泌，本研究结果与其相似。本研究中5 μmol/L的米非司酮对JAR细胞已有明显的细胞增殖抑制及细胞毒作用，且JAR细胞hCG分泌下降的时间与米非司酮产生增殖抑制及细胞毒作用的时间一致，故JAR细胞hCG分泌的下降，可能是由于米非司酮的细胞增殖抑制及细胞毒作用所致。
最近的研究结果证实，米非司酮在体内对早孕绒毛有直接作用。米非司酮可抑制细胞滋养细胞的增殖，诱导和促进滋养细胞的凋亡[8]。本研究结果证实，米非司酮在体外对人绒毛膜癌细胞具有细胞增殖抑制及细胞毒作用，且可使其hCG分泌下降。本研究结果为米非司酮治疗滋养细胞肿瘤提供了实验依据，米非司酮在体内对绒毛膜癌细胞的作用，有待进一步研究。
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参考文献
1 Klijn JG, Setyono-Han B, Sander HJ,et al. Pre -clinical and clinical treatment of breast cancer with antiprogestins. Hun Reprod， 1994,9: 181-189.
2 Matsuda Y, Kawamoto K, Kiya K, et al. Antitumor effects of antiprogesterones on human meningioma cells in vitro and in vivo. J Neuro surg, 1994,80:527-534.
3 Murphy AA, Morales AJ, Kettel LM, et al. Regression of uterine leomyoma to the antiprogesterone RU486: dose-response effect. Fertil Steril, 1995, 64:187-190.
, 百拇医药
4 温汉平，王小宁，孙华蕴，等. 肿瘤细胞体外药物敏感试验MTT分析法.中华肿瘤杂志,1993,15:470-471.
5 倪灿荣主编.免疫组织化学实验技术及应用.第2版. 北京: 人民卫生出版社,1995.360.
6 Rose FV, Barhea ER. Response of human ovarian carcinoma cell lines to antiprogestin mifepristone. Oncogene,1996,12:999-1003.
7 周丁华.肿瘤增殖力学的研究方法学.国外医学肿瘤学分册, 1995, 22: 136-138.
8 杨业洲,曹泽毅, 韩字研,等. 米非司酮对人早孕绒毛细胞增殖和凋亡的影响.中华妇产科杂志,1998, 33: 268-270.
(收稿：1998-12-21 修回：1999-06-22), 百拇医药
单位：河南医科大学第二附属医院妇产科 450003 郑州
关键词：米非司酮；绒毛膜癌；Ki-67抗原
中华妇产科杂志990911 【摘要】 目的 探讨米非司酮对人绒毛膜癌细胞株JAR的作用。方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法，观察1、5、10、20μmol/L的米非司酮对JAR细胞的杀伤活性，通过免疫组化及酶联免疫法(ELISA)检测用药后，JAR细胞核增殖抗原Ki-67的表达及hCG分泌的变化。结果 4种浓度的米非司酮对JAR细胞均有杀伤作用，并呈剂量依赖性，以20 μmol/L浓度的米非司酮作用最强，杀伤率达73.19%。5 μmol/L的米非司酮与JAR细胞作用72小时，Ki-67抗原阳性率明显下降，第3天hCG分泌量明显下降。结论 米非司酮对JAR细胞具有细胞增殖抑制及细胞毒作用，并可抑制其hCG的分泌。
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Effects of Mifepristone on Choriocarcinoma Cell Line JAR in vitro
SUN Lijun, ZHENG Ying, WANG Chunping, et al.
The Second Affiliated Hospital, Henan Medical University, Zhengzhou 450003
【Abstract】 Objective To investigate the effects of mifepristone on cell proliferation and hCG secretion of human choriocarcinoma cell line JAR and the cytotoxic effects of mifepristone on this cell line. Methods The cytotoxic effects of four different concentration of mifeprstone (1、5、10、20 μmol/L) were assessed with methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) colorimetric assay. The expression of nuclear proliferative antigen Ki-67 and the amount of hCG secreation in JAR cells were detected with avidin-biotin complex method, immuno-histochemical method and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) respectively. Results There were dose-dependent cytotoxic effects on JAR cells in four different concentrations of mifepristone. This effect plateaued at 20 μmol/L. When the JAR cells were exposed to 5 μmol/L mifepristone for 72h, the expression of Ki-67 antigen was declined and the amount of hCG secretion was decreased significantly at the third day.Conclusion In vitro, mifepristone has cytostatic and cytotoxic effects on JAR cell line and may inhibit the secretion of hCG in JAR cells.
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【Key words】 Mifepristone Choriocarcinoma Ki-67 antigen
近年来，国外一些学者发现，孕激素受体拮抗剂——米非司酮对某些孕激素受体阳性的肿瘤有一定抑制作用。许多体内外试验证实，米非司酮对人乳腺癌[1]、脑膜瘤[2]、子宫肌瘤[3]等均有明显的抑制作用。有关米非司酮对绒毛膜癌的作用未见报道。本研究将米非司酮直接作用于人绒毛膜癌细胞株JAR，观察米非司酮对JAR细胞的杀伤活性及其对该细胞增殖和hCG分泌的影响。
材料与方法
一、材料
1.瘤细胞：细胞株JAR，为人胎盘绒毛膜癌细胞株，由中国科学院上海细胞生物学研究所提供。
2.药物与试剂来源：四甲基偶氮唑蓝(MTT)购于美国Sigma公司；兔抗人Ki-67抗体由美国Zymed公司提供；卵白素生物素复合物法(ABC)抗兔IgG免疫组化试剂盒，购于北京华美公司；β-hCG酶联免疫试剂盒，由美国Maxim公司提供；米非司酮由上海华联制药厂提供。
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二、方法
1.细胞培养：将JAR细胞培养于含10%胎牛血清的PRMI-1640培养液内，0.25%胰酶消化传代。
2.MTT比色法测定：取对数生长期JAR细胞，以1×105个/ml，每孔100 μl，接种于96孔培养板中，于37℃、5%二氧化碳恒温培养箱内培养，24小时后换入分别含有1、5、10、20 μmol/L的米非司酮培养液(实验组)；另设对照组，培养液中含0.2%(V/V)乙醇，置培养箱内继续培养。隔日更换1次同种新鲜培养液，显微镜每天观察细胞生长形态。加入米非司酮5天后，参照温汉平等[4]的方法，经酶标仪以570nm的波长测定各孔吸光度(A)值，同法重复做3个培养板。
3.检测JAR细胞Ki-67抗原的表达：JAR细胞以1×105个/ml，接种于50 ml培养瓶内(每瓶4 ml)，培养24小时后更换培养液。实验组含米非司酮5 μmol/L，对照组含乙醇0.05%(V/V)。继续培养72小时，每组各取5瓶，用0.25%胰酶消化、吹打，制成细胞涂片，按常规方法进行ABC免疫组化染色，封片后显微镜下观察结果，以倪灿荣[5]的标准判断阳性结果。Ki-67阳性细胞均为细胞核着色，表现为细胞核呈棕黄色，或棕色网状，或细胞核内出现许多棕色小颗粒。高倍镜下计数每张涂片上500个细胞内Ki-67抗原阳性细胞数，计算阳性细胞百分率。
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4.JAR细胞培养上清液β-hCG的测定：同上述方法，接种JAR细胞于50 ml培养瓶内，实验组及对照组各取5瓶，分别收集第2天及第3天各培养瓶内的细胞上清液，采用酶联免疫法(ELISA)测定其β-hCG含量。每份标本重复测2次，取其平均值，质控符合要求。
三、统计学处理
所得实验数据经SAS统计软件包处理，分别采用方差分析及t检验。
结果
一、米非司酮对JAR细胞杀伤活性的测定
将实验组4种浓度的米非司酮作用于JAR细胞，显微镜观察发现，前2天细胞变化不明显，2天以后细胞增殖逐渐减慢，胞质粗糙，内有颗粒堆积，部分细胞附壁能力下降，继而脱落死亡，碎裂成块。以20 μmol/L浓度的米非司酮作用最明显。而对照组细胞透明，附壁能力好。4种浓度的米非司酮与JAR细胞作用5天，MTT比色法测定结果显示，各浓度米非司酮A值呈不同程度的下降，差异有极显著性(P<0.01)。见表1。
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表1 不同浓度的米非司酮对JAR细胞的杀伤率 组别
A值(
±s)杀伤率(%)
实验组(μmol/L)
1
1.118±0.109
12.86
5
0.933±0.107
27.28
10
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0.488±0.106
61.96
20
0.344±0.049
73.19
对照组
1.283±0.122
注：实验组与对照组比较，实验组间两两浓度比较，P均<0.01
二、米非司酮对JAR细胞Ki-67抗原表达的作用
免疫组化染色结果显示，实验组5 μmol/L的米非司酮与JAR细胞作用72小时，Ki-67抗原表达阳性率为(46.59±2.44)%；而对照组为(63.88±2.83)%，实验组细胞Ki-67抗原阳性率较对照组明显下降，差异有极显著性(P<0.01)，见图1，2。
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图1 米非司酮5μmol/L与JAR细胞作用72小时，Ki-67抗原表达阴性，细胞不显色。ABC染色×400
图2 对照组JAR细胞Ki-67抗原表达阳性，细胞核呈棕黄色及可见棕色小颗粒。ABC染色×400
三、米非司酮对JAR细胞hCG分泌的作用
米非司酮作用第2天，实验组hCG分泌量为(16.78±2.70)IU/L，对照组为(19.65±2.10)IU/L；第3天实验组为(10.20±1.83)IU/L，对照组为(34.28±2.57)IU/L。实验组第3天JAR细胞hCG分泌量较对照组明显减少，差异有极显著性(P<0.01)；实验组第3天hCG分泌量较第2天也明显减少，差异有显著性(P<0.05)。
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讨论
一、米非司酮对JAR细胞的杀伤活性
鉴于米非司酮有效的孕激素拮抗作用，国外一些学者首先将其应用于孕激素受体阳性的乳腺癌的治疗。大量研究表明，米非司酮对多种乳腺癌细胞具有细胞增殖抑制及细胞毒作用，即杀伤作用。Rose等[6]发现，米非司酮对人卵巢上皮癌癌细胞也有上述作用。本研究将米非司酮直接作用于人绒毛膜癌JAR细胞株，根据米非司酮治疗乳腺癌的临床用药量及其抗早孕时的血药浓度，选择1、5、10、20 μmol/L的米非司酮为实验组用药浓度。MTT比色法测定结果发现，上述浓度的米非司酮对JAR细胞均有杀伤作用，且随药物浓度的增加，杀伤作用加强，表现为剂量依赖性关系，显微镜观察结果也证实了上述变化。
二、米非司酮对JAR细胞增殖的影响
Ki-67抗原为人增殖期细胞特异表达的核蛋白。Ki-67抗原可识别细胞周期中G1后期，S期、G2期和M期细胞核及染色体，而G0及G1早期细胞不被标记，故可作为评估增殖细胞生长组分的指标之一[7]。本研究应用ABC免疫组化染色发现，5 μmol/L的米非司酮作用JAR细胞72小时，Ki-67抗原表达阳性率较对照组显著下降，说明细胞增殖受到明显抑制，细胞可能被阻滞于G0及G1早期而不被染色。有关研究发现，米非司酮可使MCF-7乳腺癌细胞阻滞于G0/G1期，不能进入S期及G2/M期而抑制细胞增殖，认为米非司酮可能为一特异性细胞周期抑制因子。本研究结果提示，米非司酮可能对JAR细胞周期产生了影响，使细胞阻滞于G0及G1早期，抑制细胞增殖。
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三、米非司酮对JAR细胞hCG分泌的影响
绒毛膜癌细胞具有分泌hCG的功能，临床上将hCG检测作为该肿瘤的诊断、疗效观察及预后判断的重要指标。本研究通过ELISA检测发现，5 μmol/L的米非司酮作用于JAR细胞，第3天细胞β-hCG分泌量较对照组明显下降，说明米非司酮对JAR细胞hCG的分泌产生了明显的抑制作用。实验组细胞第3天β-hCG分泌量较第2天也明显减少，提示随作用时间的延长，米非司酮抑制JAR细胞hCG分泌的作用加强。有研究发现，0.1～10 μmol/L的米非司酮在体外均可抑制正常胎盘绒毛滋养细胞hCG的分泌，本研究结果与其相似。本研究中5 μmol/L的米非司酮对JAR细胞已有明显的细胞增殖抑制及细胞毒作用，且JAR细胞hCG分泌下降的时间与米非司酮产生增殖抑制及细胞毒作用的时间一致，故JAR细胞hCG分泌的下降，可能是由于米非司酮的细胞增殖抑制及细胞毒作用所致。
最近的研究结果证实，米非司酮在体内对早孕绒毛有直接作用。米非司酮可抑制细胞滋养细胞的增殖，诱导和促进滋养细胞的凋亡[8]。本研究结果证实，米非司酮在体外对人绒毛膜癌细胞具有细胞增殖抑制及细胞毒作用，且可使其hCG分泌下降。本研究结果为米非司酮治疗滋养细胞肿瘤提供了实验依据，米非司酮在体内对绒毛膜癌细胞的作用，有待进一步研究。
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参考文献
1 Klijn JG, Setyono-Han B, Sander HJ,et al. Pre -clinical and clinical treatment of breast cancer with antiprogestins. Hun Reprod， 1994,9: 181-189.
2 Matsuda Y, Kawamoto K, Kiya K, et al. Antitumor effects of antiprogesterones on human meningioma cells in vitro and in vivo. J Neuro surg, 1994,80:527-534.
3 Murphy AA, Morales AJ, Kettel LM, et al. Regression of uterine leomyoma to the antiprogesterone RU486: dose-response effect. Fertil Steril, 1995, 64:187-190.
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4 温汉平，王小宁，孙华蕴，等. 肿瘤细胞体外药物敏感试验MTT分析法.中华肿瘤杂志,1993,15:470-471.
5 倪灿荣主编.免疫组织化学实验技术及应用.第2版. 北京: 人民卫生出版社,1995.360.
6 Rose FV, Barhea ER. Response of human ovarian carcinoma cell lines to antiprogestin mifepristone. Oncogene,1996,12:999-1003.
7 周丁华.肿瘤增殖力学的研究方法学.国外医学肿瘤学分册, 1995, 22: 136-138.
8 杨业洲,曹泽毅, 韩字研,等. 米非司酮对人早孕绒毛细胞增殖和凋亡的影响.中华妇产科杂志,1998, 33: 268-270.
(收稿：1998-12-21 修回：1999-06-22), 百拇医药