正常早孕蜕膜非免疫细胞免疫活性的实验研究
作者：胡冬梅 陈竹钦 颜建华 曹咏清 王妮
单位：胡冬梅(现在第一军医大学珠江医院妇产科)，曹咏清，王妮 中国科学院动物研究所计划生育生殖生物学国家重点实验室 100080；陈竹钦，颜建华 第三军医大学大坪医院妇产科
关键词：妊娠初期；蜕膜；免疫活性；淋巴细胞转化
中华妇产科杂志990905 【摘要】 目的 了解蜕膜中非免疫细胞的免疫活性。方法 取蜕膜中非免疫细胞培养的上清液，用放射免疫方法(RIA)测定其对人外周血T细胞的转化、自然杀伤(NK)细胞的杀伤率、淋巴细胞分泌白细胞介素2(IL-2)及B细胞分泌IgG的影响。结果 蜕膜非免疫细胞培养的上清液可使T细胞、NK细胞、B细胞的免疫学活性不同程度地受到抑制，其最大抑制率分别为22.7%、52.3%和14.8%，但对淋巴细胞IL-2的分泌无显著改变。结论 蜕膜非免疫细胞具有免疫抑制功能，这有助于防止母体对胎儿产生免疫排斥，保证妊娠的建立与进行。
, http://www.100md.com
Research on Immunological Activity of Non-immunological Cells of Decidua in Normal Early Pregnancy
HU Dongmei*, CHEN Zhuqing, YAN Jianhua, et al.
*Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282
【Abstract】 Objectives To investigate the immunological activity of non-immunological cells of decidua in normal early pregnancy. Methods Harvest the supernatant from cultured non-immunological cells of decidua. Inspect the effects of the supernatant on transforming function of T cells, killing activity of natural killer cells, the IgG secretion of B cells and the interleukin-2 (IL-2) secretion by lymphocytes of human peripheral blood by radioimmunological assay (RIA). Results The supernatant of the cultured non-immunological cells of decidua can inhibit the immunological function of T cells, natural killer cells and B cells to different extents, their maximum inhibiting ratio were 22.7%, 52.3% and 14.8% respectively, but there is no significant effect on the IL-2 secretion by lymphocytes. Conclusions The non-immunological cells of decidua in normal early pregnancy have immunological inhibiting function, which might contribute to prevent fetus from being expelled by maternal immunological system.
, 百拇医药
【Key words】 Pregnancy trimester, first Decidua Immunocompetence Lymphoceyte tran- sformation
蜕膜由免疫细胞和非免疫细胞组成。在正常妊娠状态下，蜕膜中的免疫细胞的免疫学活性受到了抑制，其中，占蜕膜绝大部分的蜕膜非免疫细胞有可能对蜕膜免疫细胞具有免疫调节的作用。本课题通过放射免疫学方法对这一假说进行研究。
材料及方法
一、材料来源
蜕膜取自 1996年12月至 1997年 4月在北京市海淀医院行人工流产的妇女, 共26例，孕期为6～8周，均无生殖道感染及其他全身性疾病。人外周静脉血由北京市中心血站提供，每次实验用血20 ml； K562细胞株由中国医学科学院北京肿瘤研究所提供；昆明白小鼠由中国科学院动物研究所饲养场提供，共20只。
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二、方法
1.蜕膜细胞培养：将蜕膜组织洗涤、剪碎，用0.1%胶原酶于37℃水浴中振荡消化后，通过静置沉淀法获取单个分离的蜕膜细胞。将蜕膜细胞置于含10%胎牛血清(FCS)的RPMI-1640完全培养液中，于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养6～7天直至细胞汇合。弃去旧的培养液及悬浮于其中的蜕膜淋巴细胞，换入新鲜的培养液。于继续培养后12、24、48小时收集蜕膜细胞培养的上清夜，冻干备用。
2.人外周血淋巴细胞(hPBL)分离：无菌采集正常献血员肘静脉血，经肝素抗凝，加在比重为1.077±0.002的淋巴细胞分离液液面之上，1 000 r/min离心20分钟，取交界面hPBL。将于培养12、24、48小时采集的蜕膜细胞培养上清液与hPBL放于96孔板内，37℃、5%二氧化碳培养箱中培养48小时作为实验组，不加上清液者为空白对照组。
3.T淋巴细胞转化：在两组中加入0.04%的植物血凝素(PHA)，继续培养72小时，在最后4小时于96孔板中加入0.5 μCi氚-胸苷(3H-TdR)。培养结束后收集淋巴细胞，液闪仪测定每孔的脉冲指数(cents per minute, CPM)，按公式计算抑制率：抑制率(%)=[(空白对照组CPM值-实验组CPM值)/空白对照组CPM值]× 100%。
, 百拇医药
4.自然杀伤(NK)细胞活性测定：在两组的每孔中滴加1×105个 51铬酸钠(Na251CrO4)标记后的K562细胞，使靶细胞与效应细胞之比达到1∶25。实验同时设置自发释放组(K562细胞悬液100 μl+培养液100 μl)及最大释放组[K562细胞悬液100 μl+0.05%乙酰基苯基聚乙二醇(NP-40)]。效、靶细胞于继续培养4小时后，取其上清液，γ-闪烁仪测定各孔CPM值，按公式计算杀伤率及抑制率：杀伤率(%)=[(实验组CPM值-自发释放组CPM值)/(空白对照组CPM值-自发释放组CPM值)]× 100%。
5.淋巴细胞释放白细胞介素2(IL-2)的测定：采用活化的淋巴细胞母细胞法。取小鼠脾淋巴细胞，用5 μg/ml刀豆素A(ConA)在37℃、5%二氧化碳条件下培养48小时后，配成1～10×106个/ml浓度，加入两组的96孔板里，继续培养24小时，收集小鼠脾淋巴细胞，液闪仪测定每孔的CPM值。
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6.B淋巴细胞分泌IgG的测定：采用一步温育双抗加聚二乙醇法。将25 μg/ml葡萄球菌A蛋白(SPA)加入上述两组的96孔板内，培养6天后取上清液。用γ-计数仪测定各孔CPM值，并计算其抑制率。
三、统计学分析
数据采用计算机Slide统计软件进行分析。CPM的测定值以
±s表示，t检验确定差异的显著性。
结果
一、蜕膜细胞上清液对T淋巴细胞转化的影响
培养12、24和48小时3个时相实验组的CPM值分别为5722±561、4628±743、5287±785，与空白对照组的5986±459相比, 实验组的CPM值均降低，24小时实验组的CPM值降低最为显著(P<0.05)，其抑制率分别为3.6%、22.7%和11.7%。
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二、蜕膜细胞上清液对NK细胞活性的影响
空白对照组的CPM值为9 511±719，自发释放组的CPM值为534±40，最大释放组的CPM值为64747±893，培养12、24和48小时的实验组的CPM值分别为4836±293、6377±453和7 841±499，前两者与空白对照组相比，显著降低(P<0.05)。空白对照组的NK细胞杀伤率为14.0%，培养12、24和48小时的实验组的杀伤率分别为6.7%、9.1%和11.4%，其抑制率分别为52.3%、34.9%和18.6%。
三、蜕膜细胞上清液对淋巴细胞IL-2分泌的影响
培养12、24、48小时3个时相实验组的CPM值分别为937±87、958±84、1007±158，与空白对照组的924±85相比，差异无显著性(P>0.05)。
四、蜕膜细胞上清液对B淋巴细胞分泌IgG的影响
, 百拇医药
培养12、24、48小时3个时相的实验组的CPM值分别为10089±153、9538±282、8999±595，空白对照组的CPM值为8 593±346；培养12小时的实验组的CPM值与空白对照组比较，差异有显著性(P<0.05)。实验组的3个时相的抑制率分别为14.8%、9.9%和4.5%。
讨论
蜕膜中的免疫细胞包括大颗粒淋巴细胞(large granulated lymphocytes, LGL)、蜕膜巨噬细胞(decidual macrophages, DMs)、T淋巴细胞以及少许B淋巴细胞，占全部早孕蜕膜细胞总数的10%～15%，其中LGL的含量最为丰富，占全部蜕膜免疫细胞的70%～80%[1]。尽管蜕膜中含有如此丰富的免疫细胞，但妊娠状态下的蜕膜LGL对其靶细胞K562细胞无杀伤效应[2]；DMs缺乏抗原提呈作用[3]以及蜕膜T淋巴细胞的受体表达下降[4]等表明，蜕膜的免疫学活性在妊娠时受到了抑制。蜕膜免疫活性的受抑有来自母体的神经-内分泌-免疫系统的原因，而占蜕膜绝大部分的非免疫细胞是否对蜕膜的免疫学活性具有一定的调节作用呢？
, 百拇医药
蜕膜非免疫细胞主要为蜕膜基质细胞。本研究表明，蜕膜非免疫细胞培养上清液不同程度抑制了T淋巴细胞、NK细胞及B淋巴细胞的免疫学作用。按照最大抑制率来比较，非免疫细胞对NK细胞的抑制作用最强，T淋巴细胞次之，B淋巴细胞最弱，其结果与蜕膜中免疫细胞各成分在早孕蜕膜中的含量多少相吻合。由此可见，妊娠时蜕膜中的非免疫细胞具有免疫调节功能，它所发挥的免疫抑制作用可能是母体保护胎儿免遭免疫排斥的原因之一。
本研究未能发现蜕膜非免疫细胞对淋巴细胞IL-2的分泌有明显的作用。已知IL-2是一种强细胞免疫的激活因子，具有增强NK细胞及T淋巴细胞的功能，促进γ干扰素活性的作用，并能激活B淋巴细胞，促进抗体的产生。蜕膜中IL-2分泌的增多必将迅速激活蜕膜中骨髓源性细胞的活性，从而激活蜕膜中细胞介导的免疫反应，造成流产、早产、妊娠高血压综合征的发生。本研究结果提示，蜕膜非免疫细胞本身不产生IL-2，也无促淋巴细胞产生IL-2 的作用，这可能是蜕膜中IL-2水平极低的原因。
, 百拇医药 由于蜕膜非免疫细胞具有的免疫学活性，有学者将蜕膜中的非免疫细胞称之为免疫潜能细胞[5]。有研究指出，蜕膜基质细胞的前体细胞表达有白细胞分化抗原CD80和CD86，这说明其具有抗原提呈的功能[6]。蜕膜基质细胞中CD10、CD13抗原表达的发现，则进一步提示蜕膜基质细胞与骨髓源性细胞密切相关，是一种真正的免疫细胞[7]。
蜕膜中这些非免疫细胞的免疫调节作用有可能是通过其分泌的细胞因子来发挥的。蜕膜中免疫细胞和非免疫细胞成分都具备活跃的细胞因子的分泌能力，通过细胞因子的分泌，蜕膜各细胞间相互影响，相互制约，协同作用，共同调节着妊娠期蜕膜免疫微环境的免疫时相和免疫强度。
本课题为中国科学院动物研究所计划生育生殖生物学国家重点实验室资助项目
参考文献
1 胡冬梅，陈竹钦，曹咏清. 蜕膜细胞成分及其免疫生物学特性的研究进展. 生殖与避孕，1998, 18: 131-135.
, 百拇医药
2 Kurahayashi Y, Uehara S, Okamura K, et al. Immunonological characterization of human ononulear cells: natural killer activity, response to interleukin-2 and distribution of interleukin-2 receptor subunites. Asia Oceania J Obstet Gynecol, 1994, 20:101-109.
3 Searle RF, Wren AM. Antigen presenting capacity of human decidual: no evidence for human decidual antigen presenting cell mediated immunoregulation. J Reprod Immunol, 1992,21:211-221.
, 百拇医药
4 Chao KH, Yang YS, Ho HN, et al. Decidual natural killer cytotoxicity decreased in normal pregnancy but not in anembryonic pregnancy and recurrent spotaneous abortion. Am J Reprod Immunol, 1995, 34:274-280.
5 林其德. 生殖免疫学进展. 中华妇产科杂志, 1998，33: 4-6.
6 Olivares EG, Montes MJ, Oliver C, et al. Cultured human decidual stromal cells express B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86) and stimulate allogeneic T cells. Biol Reprod, 1997, 57: 609-615.
7 Imaik K, Maeda M, Fujiwara H, et al. Human endometrial stromal cells and decidual cells express cluster of diferentiation (CD) 13 antigen/amninopeptidase N and CD10 antigen /neutral endopeptidase. Biol Reprod, 1992,46:328-334.
(收稿：1998-11-14 修回：1999-06-24), 百拇医药
单位：胡冬梅(现在第一军医大学珠江医院妇产科)，曹咏清，王妮 中国科学院动物研究所计划生育生殖生物学国家重点实验室 100080；陈竹钦，颜建华 第三军医大学大坪医院妇产科
关键词：妊娠初期；蜕膜；免疫活性；淋巴细胞转化
中华妇产科杂志990905 【摘要】 目的 了解蜕膜中非免疫细胞的免疫活性。方法 取蜕膜中非免疫细胞培养的上清液，用放射免疫方法(RIA)测定其对人外周血T细胞的转化、自然杀伤(NK)细胞的杀伤率、淋巴细胞分泌白细胞介素2(IL-2)及B细胞分泌IgG的影响。结果 蜕膜非免疫细胞培养的上清液可使T细胞、NK细胞、B细胞的免疫学活性不同程度地受到抑制，其最大抑制率分别为22.7%、52.3%和14.8%，但对淋巴细胞IL-2的分泌无显著改变。结论 蜕膜非免疫细胞具有免疫抑制功能，这有助于防止母体对胎儿产生免疫排斥，保证妊娠的建立与进行。
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Research on Immunological Activity of Non-immunological Cells of Decidua in Normal Early Pregnancy
HU Dongmei*, CHEN Zhuqing, YAN Jianhua, et al.
*Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282
【Abstract】 Objectives To investigate the immunological activity of non-immunological cells of decidua in normal early pregnancy. Methods Harvest the supernatant from cultured non-immunological cells of decidua. Inspect the effects of the supernatant on transforming function of T cells, killing activity of natural killer cells, the IgG secretion of B cells and the interleukin-2 (IL-2) secretion by lymphocytes of human peripheral blood by radioimmunological assay (RIA). Results The supernatant of the cultured non-immunological cells of decidua can inhibit the immunological function of T cells, natural killer cells and B cells to different extents, their maximum inhibiting ratio were 22.7%, 52.3% and 14.8% respectively, but there is no significant effect on the IL-2 secretion by lymphocytes. Conclusions The non-immunological cells of decidua in normal early pregnancy have immunological inhibiting function, which might contribute to prevent fetus from being expelled by maternal immunological system.
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【Key words】 Pregnancy trimester, first Decidua Immunocompetence Lymphoceyte tran- sformation
蜕膜由免疫细胞和非免疫细胞组成。在正常妊娠状态下，蜕膜中的免疫细胞的免疫学活性受到了抑制，其中，占蜕膜绝大部分的蜕膜非免疫细胞有可能对蜕膜免疫细胞具有免疫调节的作用。本课题通过放射免疫学方法对这一假说进行研究。
材料及方法
一、材料来源
蜕膜取自 1996年12月至 1997年 4月在北京市海淀医院行人工流产的妇女, 共26例，孕期为6～8周，均无生殖道感染及其他全身性疾病。人外周静脉血由北京市中心血站提供，每次实验用血20 ml； K562细胞株由中国医学科学院北京肿瘤研究所提供；昆明白小鼠由中国科学院动物研究所饲养场提供，共20只。
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二、方法
1.蜕膜细胞培养：将蜕膜组织洗涤、剪碎，用0.1%胶原酶于37℃水浴中振荡消化后，通过静置沉淀法获取单个分离的蜕膜细胞。将蜕膜细胞置于含10%胎牛血清(FCS)的RPMI-1640完全培养液中，于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养6～7天直至细胞汇合。弃去旧的培养液及悬浮于其中的蜕膜淋巴细胞，换入新鲜的培养液。于继续培养后12、24、48小时收集蜕膜细胞培养的上清夜，冻干备用。
2.人外周血淋巴细胞(hPBL)分离：无菌采集正常献血员肘静脉血，经肝素抗凝，加在比重为1.077±0.002的淋巴细胞分离液液面之上，1 000 r/min离心20分钟，取交界面hPBL。将于培养12、24、48小时采集的蜕膜细胞培养上清液与hPBL放于96孔板内，37℃、5%二氧化碳培养箱中培养48小时作为实验组，不加上清液者为空白对照组。
3.T淋巴细胞转化：在两组中加入0.04%的植物血凝素(PHA)，继续培养72小时，在最后4小时于96孔板中加入0.5 μCi氚-胸苷(3H-TdR)。培养结束后收集淋巴细胞，液闪仪测定每孔的脉冲指数(cents per minute, CPM)，按公式计算抑制率：抑制率(%)=[(空白对照组CPM值-实验组CPM值)/空白对照组CPM值]× 100%。
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4.自然杀伤(NK)细胞活性测定：在两组的每孔中滴加1×105个 51铬酸钠(Na251CrO4)标记后的K562细胞，使靶细胞与效应细胞之比达到1∶25。实验同时设置自发释放组(K562细胞悬液100 μl+培养液100 μl)及最大释放组[K562细胞悬液100 μl+0.05%乙酰基苯基聚乙二醇(NP-40)]。效、靶细胞于继续培养4小时后，取其上清液，γ-闪烁仪测定各孔CPM值，按公式计算杀伤率及抑制率：杀伤率(%)=[(实验组CPM值-自发释放组CPM值)/(空白对照组CPM值-自发释放组CPM值)]× 100%。
5.淋巴细胞释放白细胞介素2(IL-2)的测定：采用活化的淋巴细胞母细胞法。取小鼠脾淋巴细胞，用5 μg/ml刀豆素A(ConA)在37℃、5%二氧化碳条件下培养48小时后，配成1～10×106个/ml浓度，加入两组的96孔板里，继续培养24小时，收集小鼠脾淋巴细胞，液闪仪测定每孔的CPM值。
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6.B淋巴细胞分泌IgG的测定：采用一步温育双抗加聚二乙醇法。将25 μg/ml葡萄球菌A蛋白(SPA)加入上述两组的96孔板内，培养6天后取上清液。用γ-计数仪测定各孔CPM值，并计算其抑制率。
三、统计学分析
数据采用计算机Slide统计软件进行分析。CPM的测定值以
±s表示，t检验确定差异的显著性。结果
一、蜕膜细胞上清液对T淋巴细胞转化的影响
培养12、24和48小时3个时相实验组的CPM值分别为5722±561、4628±743、5287±785，与空白对照组的5986±459相比, 实验组的CPM值均降低，24小时实验组的CPM值降低最为显著(P<0.05)，其抑制率分别为3.6%、22.7%和11.7%。
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二、蜕膜细胞上清液对NK细胞活性的影响
空白对照组的CPM值为9 511±719，自发释放组的CPM值为534±40，最大释放组的CPM值为64747±893，培养12、24和48小时的实验组的CPM值分别为4836±293、6377±453和7 841±499，前两者与空白对照组相比，显著降低(P<0.05)。空白对照组的NK细胞杀伤率为14.0%，培养12、24和48小时的实验组的杀伤率分别为6.7%、9.1%和11.4%，其抑制率分别为52.3%、34.9%和18.6%。
三、蜕膜细胞上清液对淋巴细胞IL-2分泌的影响
培养12、24、48小时3个时相实验组的CPM值分别为937±87、958±84、1007±158，与空白对照组的924±85相比，差异无显著性(P>0.05)。
四、蜕膜细胞上清液对B淋巴细胞分泌IgG的影响
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培养12、24、48小时3个时相的实验组的CPM值分别为10089±153、9538±282、8999±595，空白对照组的CPM值为8 593±346；培养12小时的实验组的CPM值与空白对照组比较，差异有显著性(P<0.05)。实验组的3个时相的抑制率分别为14.8%、9.9%和4.5%。
讨论
蜕膜中的免疫细胞包括大颗粒淋巴细胞(large granulated lymphocytes, LGL)、蜕膜巨噬细胞(decidual macrophages, DMs)、T淋巴细胞以及少许B淋巴细胞，占全部早孕蜕膜细胞总数的10%～15%，其中LGL的含量最为丰富，占全部蜕膜免疫细胞的70%～80%[1]。尽管蜕膜中含有如此丰富的免疫细胞，但妊娠状态下的蜕膜LGL对其靶细胞K562细胞无杀伤效应[2]；DMs缺乏抗原提呈作用[3]以及蜕膜T淋巴细胞的受体表达下降[4]等表明，蜕膜的免疫学活性在妊娠时受到了抑制。蜕膜免疫活性的受抑有来自母体的神经-内分泌-免疫系统的原因，而占蜕膜绝大部分的非免疫细胞是否对蜕膜的免疫学活性具有一定的调节作用呢？
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蜕膜非免疫细胞主要为蜕膜基质细胞。本研究表明，蜕膜非免疫细胞培养上清液不同程度抑制了T淋巴细胞、NK细胞及B淋巴细胞的免疫学作用。按照最大抑制率来比较，非免疫细胞对NK细胞的抑制作用最强，T淋巴细胞次之，B淋巴细胞最弱，其结果与蜕膜中免疫细胞各成分在早孕蜕膜中的含量多少相吻合。由此可见，妊娠时蜕膜中的非免疫细胞具有免疫调节功能，它所发挥的免疫抑制作用可能是母体保护胎儿免遭免疫排斥的原因之一。
本研究未能发现蜕膜非免疫细胞对淋巴细胞IL-2的分泌有明显的作用。已知IL-2是一种强细胞免疫的激活因子，具有增强NK细胞及T淋巴细胞的功能，促进γ干扰素活性的作用，并能激活B淋巴细胞，促进抗体的产生。蜕膜中IL-2分泌的增多必将迅速激活蜕膜中骨髓源性细胞的活性，从而激活蜕膜中细胞介导的免疫反应，造成流产、早产、妊娠高血压综合征的发生。本研究结果提示，蜕膜非免疫细胞本身不产生IL-2，也无促淋巴细胞产生IL-2 的作用，这可能是蜕膜中IL-2水平极低的原因。
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蜕膜中这些非免疫细胞的免疫调节作用有可能是通过其分泌的细胞因子来发挥的。蜕膜中免疫细胞和非免疫细胞成分都具备活跃的细胞因子的分泌能力，通过细胞因子的分泌，蜕膜各细胞间相互影响，相互制约，协同作用，共同调节着妊娠期蜕膜免疫微环境的免疫时相和免疫强度。
本课题为中国科学院动物研究所计划生育生殖生物学国家重点实验室资助项目
参考文献
1 胡冬梅，陈竹钦，曹咏清. 蜕膜细胞成分及其免疫生物学特性的研究进展. 生殖与避孕，1998, 18: 131-135.
, 百拇医药
2 Kurahayashi Y, Uehara S, Okamura K, et al. Immunonological characterization of human ononulear cells: natural killer activity, response to interleukin-2 and distribution of interleukin-2 receptor subunites. Asia Oceania J Obstet Gynecol, 1994, 20:101-109.
3 Searle RF, Wren AM. Antigen presenting capacity of human decidual: no evidence for human decidual antigen presenting cell mediated immunoregulation. J Reprod Immunol, 1992,21:211-221.
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4 Chao KH, Yang YS, Ho HN, et al. Decidual natural killer cytotoxicity decreased in normal pregnancy but not in anembryonic pregnancy and recurrent spotaneous abortion. Am J Reprod Immunol, 1995, 34:274-280.
5 林其德. 生殖免疫学进展. 中华妇产科杂志, 1998，33: 4-6.
6 Olivares EG, Montes MJ, Oliver C, et al. Cultured human decidual stromal cells express B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86) and stimulate allogeneic T cells. Biol Reprod, 1997, 57: 609-615.
7 Imaik K, Maeda M, Fujiwara H, et al. Human endometrial stromal cells and decidual cells express cluster of diferentiation (CD) 13 antigen/amninopeptidase N and CD10 antigen /neutral endopeptidase. Biol Reprod, 1992,46:328-334.
(收稿：1998-11-14 修回：1999-06-24), 百拇医药