子宫内膜异位症患者外周血单核细胞的细胞因子测定
作者：方小玲 林秋华 陈咏健
单位：湖南医科大学附属第二医院妇产科 410011 长沙
关键词：子宫内膜异位症；白细胞介素6；白细胞介素8；肿瘤坏死因子；一氧化氮
中华妇产科杂志991010 【摘要】 目的 探讨子宫内膜异位症(内异症)患者外周血单核细胞分泌的白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和一氧化氮( NO)水平的变化及其意义。方法 从31例内异症患者(轻度组11例，为Ⅰ、Ⅱ期；重度组20例，为Ⅲ、Ⅳ期)和15例对照者(对照组，为行输卵管结扎术和吻合术患者)的外周血中分离出单核细胞，体外经脂多糖、植物血凝素诱生，培养48小时收集上清液，用酶联免疫吸附法测定IL-6、IL-8和TNF-α的水平，用镀铜镉还原法测定反映NO水平的亚硝酸基/硝酸基(NO-2/NO-3)水平。结果 轻度组和重度组IL-6、IL-8、TNF-α及NO水平明显高于对照组，差异有极显著性(P<0.01)；轻度组和重度组之间差异无显著性(P>0.05)；内异症患者IL-6与IL-8、TNF-α与NO水平呈明显正相关(P<0.01)。结论 内异症患者外周血单核细胞免疫功能紊乱，处于激活状态并产生过量的IL-6、IL- 8、TNF-α及NO，可能共同参与内异症的发病。
, 百拇医药
Study on in Vitro Cytokines Levels Induced from Peripheral Mononuclear Cells in Patients with Endometriosis
FANG Xiaoling, LIN Qiuhua, CHEN Yongjian.
The Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011
【Abstract】 Objective To study the changes and significance of interleukin-6 ( IL- 6)，interleukin-8(IL-8)，tumor necrosis factor-α ( TNF-α)and nitric oxide (NO) levels in vitro cultured system of peripheral mononuclear cells in patient with endometriosis(Em). Methods Peripheral blood mononuclear cells from 31 cases ofendometriosis, classified into mild group (stage Ⅰ and Ⅱ, n＝11), and severe group (stage Ⅲ and Ⅳ, n＝20) according to the Revised American Fertility society criteria 1985, and 15 normal controls were separated and induced by lipopolysaccharide and phytohemagglutinin, followed by 48 hour incubation in vitro, then the supernatant were collected. The levels of IL-6, IL-8 and TNF-α were measured by enzyme linked immunosorbent assays, the concentrations of NO, expressed by nitrite and nitrate (NO-2/NO-3) content were measured by Griess methods. Results The concentrations of IL-6, IL-8, TNF-α and NO were significantly higher in both mild and severe Em groups than those in controls (P<0.01). No differences between the mild and severe Em groups was seen. There were strong positive correlation between the levels of IL-6 and IL-8, TNF-α and NO in patients with endometriosis (P<0.01). Conclusions The immune function of peripheral mononuclear cell in patients with endometrosis was disordered. It may activate peripheral mononuclear cells to produce high levels of IL-6, IL-8, TNF-α and NO, which may take part in the pathogenesis of endometriosis.
, 百拇医药
【Key words】 Endometriosis Interleukin-6 Interleukin-8 Tumor necrosis factor Nitric oxide
近年来研究发现，外周血单核细胞与子宫内膜异位症(内异症)关系密切，被激活后持续分泌一系列细胞因子及生物活性物质，调控着其他免疫细胞的功能，影响内异症的发生和发展[1]。本研究采用酶联免疫吸附法，测定内异症患者外周血单核细胞培养的上清液中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平，镀铜镉还原(Griess)法测定NO水平，并探讨其变化及意义。
资料及方法
一、研究对象
收集1996年7月至1996年12月在我院行剖腹探查术后病理检查确诊为内异症的患者31例(内异症组)，按美国生育协会修正分期标准分为轻度组(Ⅰ、Ⅱ期，11例)，重度组(Ⅲ、Ⅳ期，20例)。对照组15例，为行输卵管结扎术和吻合术患者。3组年龄相似，采血前1个月内未患感染性疾病，未接受免疫抑制剂治疗，临床表现、胸部X线摄片及生化检查示无结核、肝炎、肿瘤及其他自身免疫性疾病。
, 百拇医药
二、标本采集及处理
采取外周静脉血6～8 ml，肝素抗凝，Hank液对倍稀释，缓慢加入盛有Ficoll-Hypague淋巴细胞分离液的离心管中，水平离心(2000 r/min)20分钟。吸出单核细胞层，用Hank液洗涤两次RPMI 1640液洗涤1次，每次离心去上清液。加入1 ml RPMI-1640完全培养基混匀，细胞计数，苔盼蓝染色，确定活细胞>95%，取2×106个单核细胞加入24孔培养板，RPMI 1640完全培养液调整容量至1 ml，其中含脂多糖1 μg、植物血凝素200 μg。置于37℃、50%二氧化碳培养箱中孵育48小时。48小时后离心(1000 r/min)10分钟，收集上清液，于-70℃贮存待测。
三、测定方法
1. IL-6、IL-8及TNF-α测定：采用酶联免疫吸附法，试剂盒购自第四军医大学免疫学教研室，操作方法按药盒说明进行。
, 百拇医药
2. NO测定：NO极不稳定，在体内、体外均能很快生成亚硝酸基(NO-2)和硝酸基(NO-3)。因此，测定标本中的NO-2/NO-3作为衡量NO水平的指标，采用Griess法。
四、统计学处理
结果用
±s表示，3组间比较采用方差分析与q检验。相关分析采用直线相关与回归分析。
结果
1.外周血单核细胞培养上清液中IL-6、IL-8、TNF-α及NO水平：内异症轻度组和重度组IL-6、IL-8、TNF-α及NO水平明显高于对照组(P<0.01)，轻度组和重度组间IL-6、IL-8、TNF-α及NO水平差异无显著性(P>0.05)，见表1。
, 百拇医药
表1 3组患者IL-6、IL-8、TNF-α及
NO水平比较(±s) 组别
例数
IL-6
(×10-3
ng/L)
IL-8
(×10-3
ng/L)
TNF-α
, 百拇医药 (×10-3
ng/L)
NO-2/NO-3
(×10-3
nmol/L)
对照组
15
36±13
67±11
277±88
44±14
, 百拇医药
内异症组
轻度组
11
104±26
137±22
347±38
65±17
重度组
20
110±36
129±30
383±87
67±22
, 百拇医药
2.外周血单核细胞培养上清液中IL-6与IL-8、TNF-α与NO水平的相关分析：内异症组IL-6与IL-8水平呈正相关(P<0.01)；TNF-α与NO水平也呈正相关(P<0.01)。
讨论
一、内异症患者外周血单核细胞IL-6、IL-8及TNF-α的分泌
外周血单核细胞在血液中存留数小时到数日后，移行到全身组织器官成为巨噬细胞。腹腔中存在血液细胞碎片、子宫内膜碎片、精子、卵泡液和卵泡细胞时，血液中单核细胞游出增多，腹腔巨噬细胞增多，成为腹腔液白细胞中的优势细胞，参与免疫反应的多个环节，在免疫应答中起着重要作用。有研究发现，内异症患者外周血单核细胞百分比没有改变，但活性增强，并导致腹腔巨噬细胞活化。Brawn等[1]发现，内异症患者外周血单核细胞能促进自身子宫内膜细胞增生，而正常对照组外周血单核细胞抑制其增生。推测，可能是外周血单核细胞产生了一些生长刺激因子，刺激了子宫内膜细胞的增生，而异位内膜细胞对这种刺激也起相应的反应。由此可见，外周血单核细胞活性的改变使内异症患者免疫防御功能受到破坏。
, 百拇医药
本研究发现，内异症患者外周血单核细胞产生的IL-6、IL-8及TNF-α水平明显增高，与文献报道一致[2]。它们作为炎症介质，使局部发生炎症反应，病灶及周围组织白细胞积聚，血管通透性增加，纤维蛋白沉积，促进成纤维细胞增殖等一系列非细菌性炎症反应，加重盆腔局部粘连，改变盆腔正常解剖关系，介导内异症的发生和发展。近年来有证据表明，新生血管的形成参与了内异症的发生；异位的子宫内膜基底部毛细血管的数量和面积均显著增多，新鲜的红色病灶较陈旧的褐色病灶更具有丰富的毛细血管[3]。而IL-8和TNF-α都是新生血管生成的潜在诱导剂，通过促进异位病灶周围新生血管的形成，使异位子宫内膜得以生长、增生、分化，可能由此参与内异症的发病过程。同时，TNF-α可能通过诱导腹腔间皮细胞表达粘附分子，促进内膜基质细胞粘附在腹腔间皮细胞[4]。这是异位内膜存活、繁殖所必需的。另外，作为B淋巴细胞终末分化因子，升高的IL-6促进B淋巴细胞终未成熟为浆细胞，使内异症患者血中IgG、IgM增高并使体内产生多种自身抗体，引起抗原抗体反应，产生多种免疫复合物，造成机体免疫损害。
, http://www.100md.com
二、内异症患者外周血单核细胞的NO分泌
本研究发现，内异症患者外周血单核细胞分泌的NO水平明显增高。NO可能通过非特异地杀伤细菌，并破坏自身异位内膜，导致自身抗体产生，发生免疫紊乱；NO还可抑制Th1淋巴细胞的增殖，但对Th2淋巴细胞无明显影响，从而导致Th淋巴细胞功能紊乱[5]。Th2淋巴细胞还可能使内异症患者CD8细胞毒作用降低，不能协同自然杀伤(NK)细胞阻止内膜组织异位种植，从而有利于内异症的发生。
本研究提示，IL-6与IL-8、TNF-α与NO可能并不是孤立存在，而是相互作用，形成一网络结构，共同影响内异症的发生。其来源是否相近，具有共同的诱导剂及是否存在互相促进的作用，共同参与了免疫正调节等，尚待研究。
参考文献
1 Brawn DP, Rotman C, Munana A, et al. Monocyte-mediated enhancement of endometrial cell proliferation in women with endometriosis. Fertil Steril, 1994,61:78-84.
, 百拇医药
2 Braun DP, Rana N, Gebel H, et al. Spontaneous and induced synthesis of cytokines by peripheral blood monocytes in patients with endometriosis. Fertil Steril,1996,65:1125-1129.
3 Nisolle M, Mine JM, Donner J, et al. Morphometric study of the stromal vascularization in peritoneal endometriosis. Fertil Steril, 1993,59:681-684.
4 Zhang RJ, Wild RA, Ojago JM. Effect of tumor necrosis factor-alpha on adhesion of human endometrial stromal cells to peritoneal mesothelial cells: an in vitro system. Fertil Steril，1993，59:1196-1201.
5 Taylor-Robinson AW, Liew FY, Severn A, et al. Regulation of the immune ponse by nitric oxide differentially produced by T helper type 1 and T helper type 2 cells. Eur J Immunol, 1994,24:980-985.
(收稿：1998-11-03 修回：1999-05-31), http://www.100md.com
单位：湖南医科大学附属第二医院妇产科 410011 长沙
关键词：子宫内膜异位症；白细胞介素6；白细胞介素8；肿瘤坏死因子；一氧化氮
中华妇产科杂志991010 【摘要】 目的 探讨子宫内膜异位症(内异症)患者外周血单核细胞分泌的白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和一氧化氮( NO)水平的变化及其意义。方法 从31例内异症患者(轻度组11例，为Ⅰ、Ⅱ期；重度组20例，为Ⅲ、Ⅳ期)和15例对照者(对照组，为行输卵管结扎术和吻合术患者)的外周血中分离出单核细胞，体外经脂多糖、植物血凝素诱生，培养48小时收集上清液，用酶联免疫吸附法测定IL-6、IL-8和TNF-α的水平，用镀铜镉还原法测定反映NO水平的亚硝酸基/硝酸基(NO-2/NO-3)水平。结果 轻度组和重度组IL-6、IL-8、TNF-α及NO水平明显高于对照组，差异有极显著性(P<0.01)；轻度组和重度组之间差异无显著性(P>0.05)；内异症患者IL-6与IL-8、TNF-α与NO水平呈明显正相关(P<0.01)。结论 内异症患者外周血单核细胞免疫功能紊乱，处于激活状态并产生过量的IL-6、IL- 8、TNF-α及NO，可能共同参与内异症的发病。
, 百拇医药
Study on in Vitro Cytokines Levels Induced from Peripheral Mononuclear Cells in Patients with Endometriosis
FANG Xiaoling, LIN Qiuhua, CHEN Yongjian.
The Second Affiliated Hospital, Hunan Medical University, Changsha 410011
【Abstract】 Objective To study the changes and significance of interleukin-6 ( IL- 6)，interleukin-8(IL-8)，tumor necrosis factor-α ( TNF-α)and nitric oxide (NO) levels in vitro cultured system of peripheral mononuclear cells in patient with endometriosis(Em). Methods Peripheral blood mononuclear cells from 31 cases ofendometriosis, classified into mild group (stage Ⅰ and Ⅱ, n＝11), and severe group (stage Ⅲ and Ⅳ, n＝20) according to the Revised American Fertility society criteria 1985, and 15 normal controls were separated and induced by lipopolysaccharide and phytohemagglutinin, followed by 48 hour incubation in vitro, then the supernatant were collected. The levels of IL-6, IL-8 and TNF-α were measured by enzyme linked immunosorbent assays, the concentrations of NO, expressed by nitrite and nitrate (NO-2/NO-3) content were measured by Griess methods. Results The concentrations of IL-6, IL-8, TNF-α and NO were significantly higher in both mild and severe Em groups than those in controls (P<0.01). No differences between the mild and severe Em groups was seen. There were strong positive correlation between the levels of IL-6 and IL-8, TNF-α and NO in patients with endometriosis (P<0.01). Conclusions The immune function of peripheral mononuclear cell in patients with endometrosis was disordered. It may activate peripheral mononuclear cells to produce high levels of IL-6, IL-8, TNF-α and NO, which may take part in the pathogenesis of endometriosis.
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【Key words】 Endometriosis Interleukin-6 Interleukin-8 Tumor necrosis factor Nitric oxide
近年来研究发现，外周血单核细胞与子宫内膜异位症(内异症)关系密切，被激活后持续分泌一系列细胞因子及生物活性物质，调控着其他免疫细胞的功能，影响内异症的发生和发展[1]。本研究采用酶联免疫吸附法，测定内异症患者外周血单核细胞培养的上清液中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平，镀铜镉还原(Griess)法测定NO水平，并探讨其变化及意义。
资料及方法
一、研究对象
收集1996年7月至1996年12月在我院行剖腹探查术后病理检查确诊为内异症的患者31例(内异症组)，按美国生育协会修正分期标准分为轻度组(Ⅰ、Ⅱ期，11例)，重度组(Ⅲ、Ⅳ期，20例)。对照组15例，为行输卵管结扎术和吻合术患者。3组年龄相似，采血前1个月内未患感染性疾病，未接受免疫抑制剂治疗，临床表现、胸部X线摄片及生化检查示无结核、肝炎、肿瘤及其他自身免疫性疾病。
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二、标本采集及处理
采取外周静脉血6～8 ml，肝素抗凝，Hank液对倍稀释，缓慢加入盛有Ficoll-Hypague淋巴细胞分离液的离心管中，水平离心(2000 r/min)20分钟。吸出单核细胞层，用Hank液洗涤两次RPMI 1640液洗涤1次，每次离心去上清液。加入1 ml RPMI-1640完全培养基混匀，细胞计数，苔盼蓝染色，确定活细胞>95%，取2×106个单核细胞加入24孔培养板，RPMI 1640完全培养液调整容量至1 ml，其中含脂多糖1 μg、植物血凝素200 μg。置于37℃、50%二氧化碳培养箱中孵育48小时。48小时后离心(1000 r/min)10分钟，收集上清液，于-70℃贮存待测。
三、测定方法
1. IL-6、IL-8及TNF-α测定：采用酶联免疫吸附法，试剂盒购自第四军医大学免疫学教研室，操作方法按药盒说明进行。
, 百拇医药
2. NO测定：NO极不稳定，在体内、体外均能很快生成亚硝酸基(NO-2)和硝酸基(NO-3)。因此，测定标本中的NO-2/NO-3作为衡量NO水平的指标，采用Griess法。
四、统计学处理
结果用
±s表示，3组间比较采用方差分析与q检验。相关分析采用直线相关与回归分析。结果
1.外周血单核细胞培养上清液中IL-6、IL-8、TNF-α及NO水平：内异症轻度组和重度组IL-6、IL-8、TNF-α及NO水平明显高于对照组(P<0.01)，轻度组和重度组间IL-6、IL-8、TNF-α及NO水平差异无显著性(P>0.05)，见表1。
, 百拇医药
表1 3组患者IL-6、IL-8、TNF-α及
NO水平比较(
±s) 组别例数
IL-6
(×10-3
ng/L)
IL-8
(×10-3
ng/L)
TNF-α
, 百拇医药 (×10-3
ng/L)
NO-2/NO-3
(×10-3
nmol/L)
对照组
15
36±13
67±11
277±88
44±14
, 百拇医药
内异症组
轻度组
11
104±26
137±22
347±38
65±17
重度组
20
110±36
129±30
383±87
67±22
, 百拇医药
2.外周血单核细胞培养上清液中IL-6与IL-8、TNF-α与NO水平的相关分析：内异症组IL-6与IL-8水平呈正相关(P<0.01)；TNF-α与NO水平也呈正相关(P<0.01)。
讨论
一、内异症患者外周血单核细胞IL-6、IL-8及TNF-α的分泌
外周血单核细胞在血液中存留数小时到数日后，移行到全身组织器官成为巨噬细胞。腹腔中存在血液细胞碎片、子宫内膜碎片、精子、卵泡液和卵泡细胞时，血液中单核细胞游出增多，腹腔巨噬细胞增多，成为腹腔液白细胞中的优势细胞，参与免疫反应的多个环节，在免疫应答中起着重要作用。有研究发现，内异症患者外周血单核细胞百分比没有改变，但活性增强，并导致腹腔巨噬细胞活化。Brawn等[1]发现，内异症患者外周血单核细胞能促进自身子宫内膜细胞增生，而正常对照组外周血单核细胞抑制其增生。推测，可能是外周血单核细胞产生了一些生长刺激因子，刺激了子宫内膜细胞的增生，而异位内膜细胞对这种刺激也起相应的反应。由此可见，外周血单核细胞活性的改变使内异症患者免疫防御功能受到破坏。
, 百拇医药
本研究发现，内异症患者外周血单核细胞产生的IL-6、IL-8及TNF-α水平明显增高，与文献报道一致[2]。它们作为炎症介质，使局部发生炎症反应，病灶及周围组织白细胞积聚，血管通透性增加，纤维蛋白沉积，促进成纤维细胞增殖等一系列非细菌性炎症反应，加重盆腔局部粘连，改变盆腔正常解剖关系，介导内异症的发生和发展。近年来有证据表明，新生血管的形成参与了内异症的发生；异位的子宫内膜基底部毛细血管的数量和面积均显著增多，新鲜的红色病灶较陈旧的褐色病灶更具有丰富的毛细血管[3]。而IL-8和TNF-α都是新生血管生成的潜在诱导剂，通过促进异位病灶周围新生血管的形成，使异位子宫内膜得以生长、增生、分化，可能由此参与内异症的发病过程。同时，TNF-α可能通过诱导腹腔间皮细胞表达粘附分子，促进内膜基质细胞粘附在腹腔间皮细胞[4]。这是异位内膜存活、繁殖所必需的。另外，作为B淋巴细胞终末分化因子，升高的IL-6促进B淋巴细胞终未成熟为浆细胞，使内异症患者血中IgG、IgM增高并使体内产生多种自身抗体，引起抗原抗体反应，产生多种免疫复合物，造成机体免疫损害。
, http://www.100md.com
二、内异症患者外周血单核细胞的NO分泌
本研究发现，内异症患者外周血单核细胞分泌的NO水平明显增高。NO可能通过非特异地杀伤细菌，并破坏自身异位内膜，导致自身抗体产生，发生免疫紊乱；NO还可抑制Th1淋巴细胞的增殖，但对Th2淋巴细胞无明显影响，从而导致Th淋巴细胞功能紊乱[5]。Th2淋巴细胞还可能使内异症患者CD8细胞毒作用降低，不能协同自然杀伤(NK)细胞阻止内膜组织异位种植，从而有利于内异症的发生。
本研究提示，IL-6与IL-8、TNF-α与NO可能并不是孤立存在，而是相互作用，形成一网络结构，共同影响内异症的发生。其来源是否相近，具有共同的诱导剂及是否存在互相促进的作用，共同参与了免疫正调节等，尚待研究。
参考文献
1 Brawn DP, Rotman C, Munana A, et al. Monocyte-mediated enhancement of endometrial cell proliferation in women with endometriosis. Fertil Steril, 1994,61:78-84.
, 百拇医药
2 Braun DP, Rana N, Gebel H, et al. Spontaneous and induced synthesis of cytokines by peripheral blood monocytes in patients with endometriosis. Fertil Steril,1996,65:1125-1129.
3 Nisolle M, Mine JM, Donner J, et al. Morphometric study of the stromal vascularization in peritoneal endometriosis. Fertil Steril, 1993,59:681-684.
4 Zhang RJ, Wild RA, Ojago JM. Effect of tumor necrosis factor-alpha on adhesion of human endometrial stromal cells to peritoneal mesothelial cells: an in vitro system. Fertil Steril，1993，59:1196-1201.
5 Taylor-Robinson AW, Liew FY, Severn A, et al. Regulation of the immune ponse by nitric oxide differentially produced by T helper type 1 and T helper type 2 cells. Eur J Immunol, 1994,24:980-985.
(收稿：1998-11-03 修回：1999-05-31), http://www.100md.com