滋养细胞肿瘤组织中端粒酶RNA基因的表达及其意义
作者：郑伟 石一复 谢幸
单位：310006 杭州， 浙江大学医学院附属妇产科医院
关键词：
中华妇产科杂志/991126 端粒是真核生物细胞染色体末端的一种特殊结构，含有许多简单重复的DNA序列及相关蛋白质。端粒缩短被认为是正常细胞分裂与老化的分子信号。端粒酶是一种核糖核蛋白，主要由RNA和蛋白质组成, 它阻止端粒的丢失,使细胞发展成为永生化细胞或无限增殖的癌细胞[1]。本研究采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测了43例正常胎盘组织和35例滋养细胞肿瘤组织中人端粒酶RNA(hTR)基因的表达并探讨其意义。现报道如下。
一、 资料与方法
1. 研究对象：43例人胎盘绒毛组织和35例滋养细胞肿瘤组织均取自浙江大学医学院附属妇产科医院，其中早孕绒毛21例，取自早孕(孕8～12周)行人工流产终止妊娠者；足月妊娠胎盘组织22例；葡萄胎组织12例，取自葡萄胎住院患者首次刮宫术时；侵蚀性葡萄胎14例及绒癌组织9例，均取材于手术切除的子宫病灶。所有标本均经组织病理学检查确诊。
, 百拇医药
2. PCR引物: hTR基因上游引物5′-GGGAGGGGTGGTGGCCATTT-3′和下游引物5′-GTTTGCTCTAGAATGAACGG-3′ 由中国科学院上海细胞生物学研究所合成。
3. hTR基因的RT-PCR扩增：常规方法提取组织和细胞中的RNA，并采用BECKMAN DU-6000紫外分光光度仪测定其含量。在提取的RNA中吸取液体4 μl，依次加入逆转录酶及DNA聚合酶混合液0.5 μl、PCR缓冲液10 μl和RT-PCR反应液16 μl、上游引物2 μl、下游引物2 μl 和内参照引物4 μl，42℃保温30分钟。逆转录产物按下列条件进行PCR扩增，变性94℃ 30秒；退火58℃ 30秒；延伸72℃30秒,循环40次。RT-PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳。经凝胶成像分析系统拍照并采用Phosphor An/PC软件进行半定量分析。
4.统计学分析：采用t检验。
, 百拇医药 二、结果
采用hTR组分的特异性引物, 对人胎盘和滋养细胞肿瘤组织中的hTR基因进行RT-PCR扩增，结果显示，正常早孕绒毛hTR基因呈阳性，足月胎盘绒毛hTR基因呈阴性或弱阳性，葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒癌组织均呈强阳性。 早孕绒毛组织hTR基因/β-肌动蛋白(β-actin)显著高于足月妊娠绒毛组织hTR基因/β-actin(P<0.05), 滋养细胞肿瘤组织hTR基因/β-actin显著高于早孕绒毛(P <0.01)和足月胎盘绒毛组织(P<0.001)。见表1。
表1 人胎盘和滋养细胞肿瘤
的hTR基因/β-actin相对水平(
±s) 类 别
例数
hTR基因/β-actin
, 百拇医药
早孕绒毛
21
0.6±0.24*
足月胎盘绒毛
22
0.08±0.05
滋养细胞肿瘤
35
1.75±0.15**
* 与足月妊娠胎盘绒毛比较， P<0.05
** 与正常早孕绒毛、足月胎盘绒毛比
, 百拇医药
较，P<0.01
三、讨论
滋养细胞肿瘤绝大多数继发于正常或不正常妊娠，除具有一般肿瘤的特点外，尚具有其本身的特点，即来源于胚胎滋养层，具有向母体子宫内膜侵入的特征，但也有许多不同于恶性肿瘤的特点。近年来的研究表明，在正常早期妊娠的滋养细胞中，也发现某些癌基因如myc、ras和p53 基因的表达，但在足月妊娠的胎盘中则无表达，早期妊娠滋养细胞中的原癌基因和抑癌基因的过度表达，可能与其细胞增殖生长的需要有关。随着妊娠的进展，胎盘滋养层的生长和发育，许多癌基因表达均有下降[2，3]。本研究中发现，在人正常早孕绒毛组织中也存在hTR基因的表达，但在足月妊娠的胎盘中，hTR基因呈低水平表达或不表达。由于正常细胞与恶性肿瘤细胞的生物学特性截然不同，前者呈寿命有限的自控生长，而后者则呈寿命无限的失控生长，故在正常早孕绒毛组织中hTR基因的表达与恶性滋养细胞肿瘤hTR基因的表达之间存在一定的内在差异。hTR基因的表达可能参与滋养细胞的分化与增殖，但其作用机理仍不清楚，尚待进一步研究。
, http://www.100md.com
本研究结果显示，在滋养细胞肿瘤中存在端粒酶的活性，尤其在恶性滋养细胞肿瘤组织中，hTR基因具有高水平的表达。有研究表明，hTR基因在一些端粒酶阴性组织中已有表达，与肿瘤端粒酶活性的表达存在一定的相关性，并与滋养细胞的增殖有关。故hTR基因可能是参与调节端粒酶活性的因素之一，端粒酶是在肿瘤进展的晚期被激活，而hTR基因的上调是在较早期时发生[4] 。
在肿瘤的形成和发展过程中，端粒酶的激活或许是一个必须的关键性步骤，它参与了人体细胞的永生性转化及肿瘤的形成。端粒酶在肿瘤细胞中合成端粒DNA, 阻止端粒的丢失， 所以是肿瘤细胞获得永生的必要条件[5]。hTR基因检测对于判断恶性滋养细胞肿瘤细胞的增殖程度具有一定的临床价值，可能成为早期诊断、治疗和监测恶性滋养细胞肿瘤又一重要的肿瘤标记物。
本课题受国家自然科学基金资助(基金编号：39670753)
, 百拇医药 参考文献
1 Greider CW, Blackburn EH. Telomeres telomerase and cancer. Science American, 1996, 274：92-98.
2 Haidacher S, Blaschitz A,Desoye G, et al. Immunohistochemical evidence of p53 protein in human placenta and choriocarcinoma cell lines. Hum Reprod, 1995, 10: 983-988.
3 Wolf NG, Lage JM. Genetic analysis of gestational trophoblastic disease. Sem Oncol, 1995, 22: 113-119.
, 百拇医药
4 Kuniyasu H, Domeu T, Hamamofo T, et al. Expression of human telomerase RNA is an early event of stomach carcinogenesis. Jpn J Cancer Res, 1997, 88: 103-109.
5 Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer Science， 1994，266: 2011-2015.
(收稿：1999-02-11 修回：1999-07-02), 百拇医药
单位：310006 杭州， 浙江大学医学院附属妇产科医院
关键词：
中华妇产科杂志/991126 端粒是真核生物细胞染色体末端的一种特殊结构，含有许多简单重复的DNA序列及相关蛋白质。端粒缩短被认为是正常细胞分裂与老化的分子信号。端粒酶是一种核糖核蛋白，主要由RNA和蛋白质组成, 它阻止端粒的丢失,使细胞发展成为永生化细胞或无限增殖的癌细胞[1]。本研究采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测了43例正常胎盘组织和35例滋养细胞肿瘤组织中人端粒酶RNA(hTR)基因的表达并探讨其意义。现报道如下。
一、 资料与方法
1. 研究对象：43例人胎盘绒毛组织和35例滋养细胞肿瘤组织均取自浙江大学医学院附属妇产科医院，其中早孕绒毛21例，取自早孕(孕8～12周)行人工流产终止妊娠者；足月妊娠胎盘组织22例；葡萄胎组织12例，取自葡萄胎住院患者首次刮宫术时；侵蚀性葡萄胎14例及绒癌组织9例，均取材于手术切除的子宫病灶。所有标本均经组织病理学检查确诊。
, 百拇医药
2. PCR引物: hTR基因上游引物5′-GGGAGGGGTGGTGGCCATTT-3′和下游引物5′-GTTTGCTCTAGAATGAACGG-3′ 由中国科学院上海细胞生物学研究所合成。
3. hTR基因的RT-PCR扩增：常规方法提取组织和细胞中的RNA，并采用BECKMAN DU-6000紫外分光光度仪测定其含量。在提取的RNA中吸取液体4 μl，依次加入逆转录酶及DNA聚合酶混合液0.5 μl、PCR缓冲液10 μl和RT-PCR反应液16 μl、上游引物2 μl、下游引物2 μl 和内参照引物4 μl，42℃保温30分钟。逆转录产物按下列条件进行PCR扩增，变性94℃ 30秒；退火58℃ 30秒；延伸72℃30秒,循环40次。RT-PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳。经凝胶成像分析系统拍照并采用Phosphor An/PC软件进行半定量分析。
4.统计学分析：采用t检验。
, 百拇医药 二、结果
采用hTR组分的特异性引物, 对人胎盘和滋养细胞肿瘤组织中的hTR基因进行RT-PCR扩增，结果显示，正常早孕绒毛hTR基因呈阳性，足月胎盘绒毛hTR基因呈阴性或弱阳性，葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒癌组织均呈强阳性。 早孕绒毛组织hTR基因/β-肌动蛋白(β-actin)显著高于足月妊娠绒毛组织hTR基因/β-actin(P<0.05), 滋养细胞肿瘤组织hTR基因/β-actin显著高于早孕绒毛(P <0.01)和足月胎盘绒毛组织(P<0.001)。见表1。
表1 人胎盘和滋养细胞肿瘤
的hTR基因/β-actin相对水平(
±s) 类 别例数
hTR基因/β-actin
, 百拇医药
早孕绒毛
21
0.6±0.24*
足月胎盘绒毛
22
0.08±0.05
滋养细胞肿瘤
35
1.75±0.15**
* 与足月妊娠胎盘绒毛比较， P<0.05
** 与正常早孕绒毛、足月胎盘绒毛比
, 百拇医药
较，P<0.01
三、讨论
滋养细胞肿瘤绝大多数继发于正常或不正常妊娠，除具有一般肿瘤的特点外，尚具有其本身的特点，即来源于胚胎滋养层，具有向母体子宫内膜侵入的特征，但也有许多不同于恶性肿瘤的特点。近年来的研究表明，在正常早期妊娠的滋养细胞中，也发现某些癌基因如myc、ras和p53 基因的表达，但在足月妊娠的胎盘中则无表达，早期妊娠滋养细胞中的原癌基因和抑癌基因的过度表达，可能与其细胞增殖生长的需要有关。随着妊娠的进展，胎盘滋养层的生长和发育，许多癌基因表达均有下降[2，3]。本研究中发现，在人正常早孕绒毛组织中也存在hTR基因的表达，但在足月妊娠的胎盘中，hTR基因呈低水平表达或不表达。由于正常细胞与恶性肿瘤细胞的生物学特性截然不同，前者呈寿命有限的自控生长，而后者则呈寿命无限的失控生长，故在正常早孕绒毛组织中hTR基因的表达与恶性滋养细胞肿瘤hTR基因的表达之间存在一定的内在差异。hTR基因的表达可能参与滋养细胞的分化与增殖，但其作用机理仍不清楚，尚待进一步研究。
, http://www.100md.com
本研究结果显示，在滋养细胞肿瘤中存在端粒酶的活性，尤其在恶性滋养细胞肿瘤组织中，hTR基因具有高水平的表达。有研究表明，hTR基因在一些端粒酶阴性组织中已有表达，与肿瘤端粒酶活性的表达存在一定的相关性，并与滋养细胞的增殖有关。故hTR基因可能是参与调节端粒酶活性的因素之一，端粒酶是在肿瘤进展的晚期被激活，而hTR基因的上调是在较早期时发生[4] 。
在肿瘤的形成和发展过程中，端粒酶的激活或许是一个必须的关键性步骤，它参与了人体细胞的永生性转化及肿瘤的形成。端粒酶在肿瘤细胞中合成端粒DNA, 阻止端粒的丢失， 所以是肿瘤细胞获得永生的必要条件[5]。hTR基因检测对于判断恶性滋养细胞肿瘤细胞的增殖程度具有一定的临床价值，可能成为早期诊断、治疗和监测恶性滋养细胞肿瘤又一重要的肿瘤标记物。
本课题受国家自然科学基金资助(基金编号：39670753)
, 百拇医药 参考文献
1 Greider CW, Blackburn EH. Telomeres telomerase and cancer. Science American, 1996, 274：92-98.
2 Haidacher S, Blaschitz A,Desoye G, et al. Immunohistochemical evidence of p53 protein in human placenta and choriocarcinoma cell lines. Hum Reprod, 1995, 10: 983-988.
3 Wolf NG, Lage JM. Genetic analysis of gestational trophoblastic disease. Sem Oncol, 1995, 22: 113-119.
, 百拇医药
4 Kuniyasu H, Domeu T, Hamamofo T, et al. Expression of human telomerase RNA is an early event of stomach carcinogenesis. Jpn J Cancer Res, 1997, 88: 103-109.
5 Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer Science， 1994，266: 2011-2015.
(收稿：1999-02-11 修回：1999-07-02), 百拇医药