原发上皮性卵巢癌组织中多药耐药及其相关蛋白基因表达的研究
作者：刘东光 戴淑真 罗兵 王言奎
单位：刘东光 266003 青岛医学院附属医院妇产科；戴淑真，王言奎 现在济宁市第一人民医院妇产科；罗兵 微生物教研室
关键词：
中华妇产科杂志/991121 迄今，在mRNA水平上同时检测多药耐药(MDR)基因和多药耐药相关蛋白(MRP)基因在卵巢癌组织中表达的研究，国内尚未见报道。我们应用半定量、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，检测了37例原发上皮性卵巢癌(卵巢癌)组织中MDR1和MRP基因表达情况，并对其与癌细胞体外药物敏感(药敏)实验结果、患者临床病理特征及预后的关系进行初步探讨。
一、资料和方法
(一)研究对象
1.卵巢癌患者：1995年3月至1997年7月，在青岛医学院附属医院妇产科住院接受手术，经病理检查证实的卵巢癌患者37例(其中浆液性癌26例，非浆液性癌11例)。患者临床病理特征按FIGO标准。术前未经MDR相关药物治疗，术后均给予顺铂为主的化学治疗(化疗)。37例中，随访了32例，随访率为86%(32/37)。至1998年3月，最长随访33个月，最短8个月。
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2.正常卵巢组织：供者为同期接受手术的子宫肌瘤患者，在其手术时切除的卵巢，经病理学检查，证实为正常卵巢组织，共10例。
3.正常外周血：供者为自愿献血的正常女性20例。
(二)方法
1.标本制备：(1)标本采集：标本离体后即刻无菌取材，尽快送检。(2)组织单细胞制备：用机械法分离单细胞。(3)外周血单核细胞制备：用Ficoll液常规分离出单核细胞。
2.四甲基偶氮蓝比色法体外药敏实验：按文献报道的方法进行化疗[1]。化疗药物为：长春新碱、阿霉素、表阿霉素、丝裂霉素、平阳霉素、更生霉素、鬼臼乙叉甙、氟尿嘧啶、卡铂、顺铂、噻替哌。
3.RT-PCR检测：(1)RNA的制备：按文献[2]报道的方法进行。(2)PCR引物：MDR1、MRP和β2微球蛋白(β2-MG)基因引物，分别参照文献[2，3]设计，由美国赛百盛生物工程公司合成。扩增片段长度分别为157bp、326bp、114bp。(3)cDNA的合成，应用逆转录试剂盒(美国Promega公司产品)要求的条件进行RNA逆转录。(4)PCR反应：参考Beck等[3]的方法，反应体系为30 μ1，含MgCl21.5 mmol/L，10×PCR反应缓冲液3 μ1，dNTP 0.2 μmol/L，TaqDNA聚合酶1U,引物0.5 μmol/L，逆转录产物3 μ1,加水至30 μ1。热循环参数为：94℃变性15秒，55℃复性30秒，72℃延伸60秒;扩增33个循环,最后72℃延伸5分钟。(5)PCR产物定量：取12 μ1扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并摄相。经U1troscan XL型激光密度扫描仪(瑞典LKB公司产品)扫描底片，用MRP峰面积与β2-MG峰面积的比值表示MRP基因的表达水平，如比值大于或等于全部肿瘤该比值均数者为基因高表达，否则为低表达。如出现157 bp扩增条带者，为MDR1基因阳性表达，不出现则为阴性。
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4.统计学分析：结果分析采用t检验，确切概率法检验和Kandall等级相关分析；用COX回归模型评价MDR1和MRP基因表达与生存期的关系。
二、结果
1.MDR1和MRP基因在卵巢癌和正常卵巢组织中表达情况：37例卵巢癌组织中，11例MDR1基因阳性表达(30%)，正常卵巢组织和外周血MDR1基因则阴性表达。而全部被检标本均有MRP基因表达。卵巢癌、正常卵巢组织和外周血MRP基因表达水平均数分别为1.239±0.687、0.312±0.029和1.023±0.018。卵巢癌与正常卵巢组织比较，差异有显著性(P<0.05)；与正常外周血比较，差异无显著性(P>0.05)。
2.MDR1和MRP基因表达与临床病理特征的关系：37例卵巢癌患者中，各临床期别间MDR1基因阳性表达比较，差异无显著性(P>0.05)；MRP基因高表达率比较，差异无显著性(P>0.05)。 26例浆液性癌和11例非浆液性癌MDR1基因阳性表达率分别为27%和36%,两者比较，差异无显著性(P>0.05)；MRP基因高表达率分别为38%和36%,两者比较，差异无显著性(P>0.05)。37例卵巢癌患者中，各组织学级别间MDR1基因阳性表达率比较，差异有显著性(P<0.05),且阴性率有随级别升高而升高的趋势;MRP基因高表达率比较，差异也有显著性(P<0.05),且高表达率也有随级别升高而升高的趋势。
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3.MDR1和MRP基因表达与体外药敏实验结果：MDR1基因阳性表达11例与阴性表达26例比较，更生霉素、阿霉素、表阿霉素、长春新碱和鬼臼乙叉甙，对卵巢癌细胞抑制率分别为(23.56±19.72)%，(41.31±21.51)%；(43.13±17.72)%，(56.78±18.63)%;(36.15±12.30)%，(49.67±15.61)%;(26.23±19.15)%,(42.26±17.41)%;(32.41±17.18)%，(49.11±15.77)%，差异有显著性(P<0.05)，其余差异则无显著性(P>0.05)。MRP基因高表达14例与低表达23例比较，丝裂霉素、阿霉素、表阿霉素、长春新碱、鬼臼乙叉甙和顺铂对卵巢癌细胞的抑制率分别为(41.28±15.66)%，(62.82±19.26)%；(41.14±16.51)%，(56.79±17.44)%;(32.11±13.24)%,(50.66±14.73)%;(25.72±18.17)%,(43.24±16.11)%;(30.06±20.01)%,(56.64±16.37)%;(59.64±13.14)%,(75.16±14.53)%，差异有显著性(P<0.05),其余差异则无显著性(P>0.05)。
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4.MDR1和MRP基因表达与生存期的关系:经COX回归模型分析发现，MDR1和MRP基因表达均与无进展生存期[手术后行常规妇科检查，盆腔B超检查和(或)CT检查，血清CA125检查，判断病情无进展或无变化的时间]显著相关(P均<0.01)，而与总体生存期(从手术之日起到死亡日期或随访日期)无关。7例(8例中1例失访)MDR1基因阳性表达且同时MRP基因高表达者，平均无进展生存期6.75个月(5～13个月)。18例MDR1基因阴性表达且同时MRP基因低表达者，平均无进展生存期14.39个月(4～33个月)。其中MRP基因表达水平最高的2例，同时MDR1基因表达阳性，总体生存期分别为15个月和8个月。
5.MDR1和MRP基因间的关系：经Kandall等级相关分析，两基因表达水平呈正相关(P<0.01，r=0.213)。
三、讨论
有关研究表明，MDR1和MRP基因表达的量与肿瘤细胞耐药程度呈正比，但其在实体肿瘤中表达的临床意义尚不清楚[4]。
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1.卵巢癌 MDR1和MRP基因表达：本研究结果与Kavallaris等[5]报道的相似。提示MDR1基因不仅与卵巢癌患者的获得性耐药有关，也与部分卵巢癌患者的固有耐药有关。本研究证实了MRP基因的广泛表达模式。提示MRP基因对各种细胞均产生同样的作用，可能与肿瘤细胞的生物学行为有关，且可能与肿瘤细胞的固有耐药有关。
有意义的是11例MDR1基因表达阳性的卵巢癌组织中，有8例同时MRP 基因高水平表达，占卵巢癌标本总数的22%(8/37)，高于Kavallaris等[5]报道的11%(6/53)的复合表达率。推测这种复合表达可能与手术后很快复发有关，值得进一步研究。
2.卵巢癌 MDR1和MRP基因表达与临床病理特征的关系：本研究结果显示，卵巢癌不同临床期别间及组织学类型间MDR1及MRP 基因表达水平比较，差异无显著性。因此，对卵巢癌无论何种临床期别或病理组织学类型，对MDR相关药物的选择均无参考价值。本研究还发现，不同组织学级别间两基因表达水平比较，差异均有显著性，且级别愈高，其表达水平愈高。进一步说明了两基因表达与肿瘤细胞的生物学行为有关。
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3.卵巢癌MDR1和MRP基因表达与体外药敏结果的关系：本研究结果显示，两基因有相似的耐药谱，与文献报道一致[4]。对于MDR相关药物，本研究发现，MDR1基因表达与否及MRP基因表达水平高低与体外药敏结果有关。MDR1基因表达阳性和(或)MRP基因高表达者，MDR相关药物对其抑制率低，相反MDR1基因阴性表达和(或)MRP基因低表达者，MDR相关药物对其抑制率高。提示，MDR1基因阴性表达和(或)MRP基因低表达患者，应用MDR相关药物是有效的，至少早期应用是可行的；相反，MDR1基因表达阳性和(或)MRP基因高表达者，则预示临床耐药，应避免应用MDR相关药物。但本研究也发现，MDR1基因阳性表达或MRP基因高表达的卵巢癌体外抗药性并非均高于阴性表达或低表达者。说明卵巢癌即使对MDR相关药物耐药，存在其他耐药机理。
4.卵巢癌 MDR1和MRP基因表达与生存期的关系：本研究结果显示，MDR1基因阳性表达者较阴性者的疾病进展时间明显缩短；MRP基因高表达者较低表达者的疾病进展时间也明显缩短；且两基因表达呈正相关。尽管由于本研究随访时间较短未能发现两基因表达与患者总体生存期之间存在相关性，但MDR1基因阴性表达，同时MRP基因低表达患者的无进展平均生存期是MDR1基因阳性表达同时MRP基因高表达患者的2倍多，而且MRP基因表达水平最高的2例患者同时MDR1基因表达阳性，其总体生存期最短。提示，如患者MRP基因高水平表达的同时，MDR1基因为阳性表达，则预后不良。
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参考文献
1 Wilson JK. In vitro sensitivity of human ovarian tumors to chemothera peuticagents. Br J Cancer, 1990,62:189-194.
2 Chomczynski P.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chlorofrom extraction. Annal Biochem, 1987, 162:156-163.
3 Beck J, Niethammer D, Gekeler V. Hight mdrl-and mrp-, but low topoisomerase Ⅱα- gene expression in B-cell chronic lymphocytic leukaemias. Cancer Lett, 1994, 86:135-142.
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4 Grant CE, Valdimarsson G, Hifner DR, et al. Overexpression of multidrug resistance-asso- ciated protein (MRP) increases resistance to natural product drugs. Cancer Res, 1994, 54:357-361.
5 Kavallaris M, Leary JA, Barrett JA, et al. MDR1 and multidrug resistance-associated protein (MRP) gene expression in epithelial ovarian tumors.Cancer Lett, 1996,102:7-16.
(收稿：1998-09-07 修回：1999-07-28), 百拇医药
单位：刘东光 266003 青岛医学院附属医院妇产科；戴淑真，王言奎 现在济宁市第一人民医院妇产科；罗兵 微生物教研室
关键词：
中华妇产科杂志/991121 迄今，在mRNA水平上同时检测多药耐药(MDR)基因和多药耐药相关蛋白(MRP)基因在卵巢癌组织中表达的研究，国内尚未见报道。我们应用半定量、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，检测了37例原发上皮性卵巢癌(卵巢癌)组织中MDR1和MRP基因表达情况，并对其与癌细胞体外药物敏感(药敏)实验结果、患者临床病理特征及预后的关系进行初步探讨。
一、资料和方法
(一)研究对象
1.卵巢癌患者：1995年3月至1997年7月，在青岛医学院附属医院妇产科住院接受手术，经病理检查证实的卵巢癌患者37例(其中浆液性癌26例，非浆液性癌11例)。患者临床病理特征按FIGO标准。术前未经MDR相关药物治疗，术后均给予顺铂为主的化学治疗(化疗)。37例中，随访了32例，随访率为86%(32/37)。至1998年3月，最长随访33个月，最短8个月。
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2.正常卵巢组织：供者为同期接受手术的子宫肌瘤患者，在其手术时切除的卵巢，经病理学检查，证实为正常卵巢组织，共10例。
3.正常外周血：供者为自愿献血的正常女性20例。
(二)方法
1.标本制备：(1)标本采集：标本离体后即刻无菌取材，尽快送检。(2)组织单细胞制备：用机械法分离单细胞。(3)外周血单核细胞制备：用Ficoll液常规分离出单核细胞。
2.四甲基偶氮蓝比色法体外药敏实验：按文献报道的方法进行化疗[1]。化疗药物为：长春新碱、阿霉素、表阿霉素、丝裂霉素、平阳霉素、更生霉素、鬼臼乙叉甙、氟尿嘧啶、卡铂、顺铂、噻替哌。
3.RT-PCR检测：(1)RNA的制备：按文献[2]报道的方法进行。(2)PCR引物：MDR1、MRP和β2微球蛋白(β2-MG)基因引物，分别参照文献[2，3]设计，由美国赛百盛生物工程公司合成。扩增片段长度分别为157bp、326bp、114bp。(3)cDNA的合成，应用逆转录试剂盒(美国Promega公司产品)要求的条件进行RNA逆转录。(4)PCR反应：参考Beck等[3]的方法，反应体系为30 μ1，含MgCl21.5 mmol/L，10×PCR反应缓冲液3 μ1，dNTP 0.2 μmol/L，TaqDNA聚合酶1U,引物0.5 μmol/L，逆转录产物3 μ1,加水至30 μ1。热循环参数为：94℃变性15秒，55℃复性30秒，72℃延伸60秒;扩增33个循环,最后72℃延伸5分钟。(5)PCR产物定量：取12 μ1扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并摄相。经U1troscan XL型激光密度扫描仪(瑞典LKB公司产品)扫描底片，用MRP峰面积与β2-MG峰面积的比值表示MRP基因的表达水平，如比值大于或等于全部肿瘤该比值均数者为基因高表达，否则为低表达。如出现157 bp扩增条带者，为MDR1基因阳性表达，不出现则为阴性。
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4.统计学分析：结果分析采用t检验，确切概率法检验和Kandall等级相关分析；用COX回归模型评价MDR1和MRP基因表达与生存期的关系。
二、结果
1.MDR1和MRP基因在卵巢癌和正常卵巢组织中表达情况：37例卵巢癌组织中，11例MDR1基因阳性表达(30%)，正常卵巢组织和外周血MDR1基因则阴性表达。而全部被检标本均有MRP基因表达。卵巢癌、正常卵巢组织和外周血MRP基因表达水平均数分别为1.239±0.687、0.312±0.029和1.023±0.018。卵巢癌与正常卵巢组织比较，差异有显著性(P<0.05)；与正常外周血比较，差异无显著性(P>0.05)。
2.MDR1和MRP基因表达与临床病理特征的关系：37例卵巢癌患者中，各临床期别间MDR1基因阳性表达比较，差异无显著性(P>0.05)；MRP基因高表达率比较，差异无显著性(P>0.05)。 26例浆液性癌和11例非浆液性癌MDR1基因阳性表达率分别为27%和36%,两者比较，差异无显著性(P>0.05)；MRP基因高表达率分别为38%和36%,两者比较，差异无显著性(P>0.05)。37例卵巢癌患者中，各组织学级别间MDR1基因阳性表达率比较，差异有显著性(P<0.05),且阴性率有随级别升高而升高的趋势;MRP基因高表达率比较，差异也有显著性(P<0.05),且高表达率也有随级别升高而升高的趋势。
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3.MDR1和MRP基因表达与体外药敏实验结果：MDR1基因阳性表达11例与阴性表达26例比较，更生霉素、阿霉素、表阿霉素、长春新碱和鬼臼乙叉甙，对卵巢癌细胞抑制率分别为(23.56±19.72)%，(41.31±21.51)%；(43.13±17.72)%，(56.78±18.63)%;(36.15±12.30)%，(49.67±15.61)%;(26.23±19.15)%,(42.26±17.41)%;(32.41±17.18)%，(49.11±15.77)%，差异有显著性(P<0.05)，其余差异则无显著性(P>0.05)。MRP基因高表达14例与低表达23例比较，丝裂霉素、阿霉素、表阿霉素、长春新碱、鬼臼乙叉甙和顺铂对卵巢癌细胞的抑制率分别为(41.28±15.66)%，(62.82±19.26)%；(41.14±16.51)%，(56.79±17.44)%;(32.11±13.24)%,(50.66±14.73)%;(25.72±18.17)%,(43.24±16.11)%;(30.06±20.01)%,(56.64±16.37)%;(59.64±13.14)%,(75.16±14.53)%，差异有显著性(P<0.05),其余差异则无显著性(P>0.05)。
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4.MDR1和MRP基因表达与生存期的关系:经COX回归模型分析发现，MDR1和MRP基因表达均与无进展生存期[手术后行常规妇科检查，盆腔B超检查和(或)CT检查，血清CA125检查，判断病情无进展或无变化的时间]显著相关(P均<0.01)，而与总体生存期(从手术之日起到死亡日期或随访日期)无关。7例(8例中1例失访)MDR1基因阳性表达且同时MRP基因高表达者，平均无进展生存期6.75个月(5～13个月)。18例MDR1基因阴性表达且同时MRP基因低表达者，平均无进展生存期14.39个月(4～33个月)。其中MRP基因表达水平最高的2例，同时MDR1基因表达阳性，总体生存期分别为15个月和8个月。
5.MDR1和MRP基因间的关系：经Kandall等级相关分析，两基因表达水平呈正相关(P<0.01，r=0.213)。
三、讨论
有关研究表明，MDR1和MRP基因表达的量与肿瘤细胞耐药程度呈正比，但其在实体肿瘤中表达的临床意义尚不清楚[4]。
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1.卵巢癌 MDR1和MRP基因表达：本研究结果与Kavallaris等[5]报道的相似。提示MDR1基因不仅与卵巢癌患者的获得性耐药有关，也与部分卵巢癌患者的固有耐药有关。本研究证实了MRP基因的广泛表达模式。提示MRP基因对各种细胞均产生同样的作用，可能与肿瘤细胞的生物学行为有关，且可能与肿瘤细胞的固有耐药有关。
有意义的是11例MDR1基因表达阳性的卵巢癌组织中，有8例同时MRP 基因高水平表达，占卵巢癌标本总数的22%(8/37)，高于Kavallaris等[5]报道的11%(6/53)的复合表达率。推测这种复合表达可能与手术后很快复发有关，值得进一步研究。
2.卵巢癌 MDR1和MRP基因表达与临床病理特征的关系：本研究结果显示，卵巢癌不同临床期别间及组织学类型间MDR1及MRP 基因表达水平比较，差异无显著性。因此，对卵巢癌无论何种临床期别或病理组织学类型，对MDR相关药物的选择均无参考价值。本研究还发现，不同组织学级别间两基因表达水平比较，差异均有显著性，且级别愈高，其表达水平愈高。进一步说明了两基因表达与肿瘤细胞的生物学行为有关。
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3.卵巢癌MDR1和MRP基因表达与体外药敏结果的关系：本研究结果显示，两基因有相似的耐药谱，与文献报道一致[4]。对于MDR相关药物，本研究发现，MDR1基因表达与否及MRP基因表达水平高低与体外药敏结果有关。MDR1基因表达阳性和(或)MRP基因高表达者，MDR相关药物对其抑制率低，相反MDR1基因阴性表达和(或)MRP基因低表达者，MDR相关药物对其抑制率高。提示，MDR1基因阴性表达和(或)MRP基因低表达患者，应用MDR相关药物是有效的，至少早期应用是可行的；相反，MDR1基因表达阳性和(或)MRP基因高表达者，则预示临床耐药，应避免应用MDR相关药物。但本研究也发现，MDR1基因阳性表达或MRP基因高表达的卵巢癌体外抗药性并非均高于阴性表达或低表达者。说明卵巢癌即使对MDR相关药物耐药，存在其他耐药机理。
4.卵巢癌 MDR1和MRP基因表达与生存期的关系：本研究结果显示，MDR1基因阳性表达者较阴性者的疾病进展时间明显缩短；MRP基因高表达者较低表达者的疾病进展时间也明显缩短；且两基因表达呈正相关。尽管由于本研究随访时间较短未能发现两基因表达与患者总体生存期之间存在相关性，但MDR1基因阴性表达，同时MRP基因低表达患者的无进展平均生存期是MDR1基因阳性表达同时MRP基因高表达患者的2倍多，而且MRP基因表达水平最高的2例患者同时MDR1基因表达阳性，其总体生存期最短。提示，如患者MRP基因高水平表达的同时，MDR1基因为阳性表达，则预后不良。
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1 Wilson JK. In vitro sensitivity of human ovarian tumors to chemothera peuticagents. Br J Cancer, 1990,62:189-194.
2 Chomczynski P.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chlorofrom extraction. Annal Biochem, 1987, 162:156-163.
3 Beck J, Niethammer D, Gekeler V. Hight mdrl-and mrp-, but low topoisomerase Ⅱα- gene expression in B-cell chronic lymphocytic leukaemias. Cancer Lett, 1994, 86:135-142.
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5 Kavallaris M, Leary JA, Barrett JA, et al. MDR1 and multidrug resistance-associated protein (MRP) gene expression in epithelial ovarian tumors.Cancer Lett, 1996,102:7-16.
(收稿：1998-09-07 修回：1999-07-28), 百拇医药