显微注射受精的卵母细胞质膜穿破类型与受精和卵裂的关系
作者：李蓉 庄广伦 周灿权 张敏芳
单位：510080 广州，中山医科大学附属第一医院生殖医学研究中心
关键词：
中华妇产科杂志/991115
自1995年12月,我院生殖医学研究中心开始采用卵母细胞单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI) 治疗严重男性因素及不明原因不育患者，至1998年1月16日，我中心已采用ICSI技术共治疗了156个周期的不育患者[1]。目前对影响ICSI结果的因素了解不多， ICSI的关键是将一条制动精子通过穿破的卵膜置于卵母细胞胞浆内,但卵膜的穿破形式因人而异,甚至因不同的卵母细胞而异,这通常取决于操作技术环节和卵母细胞自身的特性。为此,我们就不同卵膜穿破形式对卵子的受精、卵裂情况的影响进行分析。
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一、资料与方法
1.研究对象：为1995年12月至1998年1月,在本中心接受ICSI治疗的156个周期的不育患者(152例)，女方平均年龄为(31.2±3.8)岁(23～42岁),男方平均年龄为(33.9±4.8)岁(26～54岁),平均不育时间为(6.3±2.8)年(2～15年)。适应证为严重少、弱、畸精症或前次体外受精(IVF)周期的受精率低(<20%)、阻塞性无精症患者[2]。
2.方法：(1)卵母细胞及精液处理：控制性促排卵采用本中心常规体外受精-胚胎移植(IVF-ET)方案[3]，注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)36小时后，B超指导下经阴道取卵。取卵4～6小时，将卵母细胞置于透明质酸酶溶液中，进行去卵丘结构处理，选择成熟的卵母细胞进行ICSI受精，精液采用 Peroll梯度离心法。根据显微注射过程中卵膜穿破的不同,将注射的成熟卵母细胞分为3组,A组：共307个卵，显微注射针穿刺卵母细胞膜过程中,注射针直接进入胞浆内,无需回吸胞浆；B组：共769个卵，注射针穿刺到胞浆深部时,轻微回吸少许胞浆,卵膜即穿破；C组：共405个卵，注射针穿刺到胞浆深部时,用力回吸一定量胞浆,卵膜才穿破。(2)观察项目：应用英国RI公司的显微操作仪及显微注射仪，注射15～18小时后，检查有无原核，40～60小时后观察卵裂，将胚胎分为两级，a级为无核碎片<50%，b级为无核碎片>50%。经阴道宫腔内移植质量优良的胚胎4个。移植后2周进行妊娠试验，7周后B超检查有无胎心搏动。
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3.统计学处理：采用χ2检验。
二、结果
3组卵子存活率差异有显著性(P<0.05)。操作过程中，A组的卵子存活率最低(72.6%)，B、C组卵子存活率分别为91.7%及90.6%(P>0.05)，总卵子存活率为87.4%。
以存活卵子计算受精率，3组分别为 66.8%、68.5%及66.2%(P>0.05)，总受精率为67.6%(见表1)。
表1 卵膜穿破不同类型与受精和卵裂的关系 组别
卵子数
(个)
存活卵子
, http://www.100md.com 正常受精
卵裂数
个数
百分比
(%)
个数
百分比
(%)
a 级(%)
b级 (%)
A组
307
223*
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72.6
149
66.8
56**(42.0)
77**(58.0)
B组
769
705
91.7
483
68.5
339(77.9)
, 百拇医药
96(22.1)
C组
405
367
90.6
243
66.2
161(73.5)
58(26.9)
合计
1481
1295
87.4
, http://www.100md.com
875
67.6
556(70.6)
231(29.4)
与B、C两组比较，* P<0.05 ** P<0.01
A组的a级卵裂球数量最少，只有42.0%，B组最高，为77.9%，C组为73.5%，A组与另两组的a级卵裂球数量比较，差异有极显著性(P<0.01)。
三、讨论
在注射精子的技术和卵的质量均等的前提下，影响卵膜穿破的两个重要因素是卵膜的张力(或弹性)以及显微注射针的质量，另外透明带的硬度也会影响卵膜的穿破形式[4]。如果透明带较硬或注射针相对较粗而钝，将会在卵膜被刺破之前，透明带被注射针压迫成深陷入胞浆的八字型，当透明带最终被刺破时，注射针在瞬间“跃入”胞浆，从而出现A组的卵膜穿破类型，由于卵母细胞被压迫成八字型，再加上注射针突然刺入胞浆，细胞的显微结构被破坏，可能是A组卵子存活率低下的原因之一。但在多数的情况下，透明带的穿破是不成问题的，故卵膜的穿破形式主要取决于卵膜的张力。卵膜的脆性越大就越容易导致A组的穿破类型。如果注射针一接触到卵膜，无需压迫，卵母细胞的卵膜就被穿破，这些卵母细胞多数立即变黑以致死亡，即使存活也不受精，这是A组卵子存活率低下的另一个主要原因。
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机械性去卵丘过程也是决定卵膜穿破类型的因素之一。洗卵针的口径太小，对卵母细胞的压迫太强，将损伤细胞的骨架结构，也是导致A组类型穿破的原因之一。
B、C组穿破的卵母细胞，卵子存活率明显高于A组，提示对卵膜的适当压迫后再进入胞浆的操作过程，有利于注射针回抽后卵膜的闭合，因为在这种情况下，卵膜的破口是在近胞浆的内侧，当注射针回抽时，被压迫的部分在缓慢回弹过程中，有更多的时间让卵膜回复其完整性。在C组穿破类型中，若注射针穿刺太深或针尖的“鹰嘴”太长，都有可能穿到对侧的卵膜，导致细胞死亡。
本研究结果提示，受精是一个不依赖于卵膜穿破类型的过程，主要取决于存活卵子的激活与否，以及精子是否成功注射到胞浆内。卵裂球的质量则以B组类型穿破形式为最好，A组类型最差，提示不同的卵膜穿破形式将影响受精卵的进一步发育，其中一个原因可能是B组类型穿破形式的操作过程比较柔和，而另两种类型的损伤较大，影响了细胞的骨架结构，导致一些不规则的分裂。
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总之，卵膜穿破不同类型将影响卵子的存活以及受精卵的进一步发育，但对存活卵子的受精率影响不大。
参考文献
1 李蓉，庄广伦，张敏芳. 卵母细胞单精子显微注射治疗男性因素及不明原因不育. 中华妇产科杂志，1997,32:211-213.
2 李满，庄广伦，李蓉，等.卵浆内单精子注射术治疗阻塞性无精症不育症.中山医科大学学报，1998，19：131-132.
3 庄广伦，周灿权，张秀俊，等. 体外受精与胚胎移植34例报告. 生殖医学杂志， 1992,1:24-25.
4 Nagy ZP, Liu J, Joris H, et al. The influence of the site of sperm deposition and mode of oolemma breakage at intracytoplasmic sperm injection on fertilization and embryo deve- liopment rates. Hum Reprod,1995,12:3171-3177.
(收稿：1998-12-09 修回：1999-08-18), http://www.100md.com
单位：510080 广州，中山医科大学附属第一医院生殖医学研究中心
关键词：
中华妇产科杂志/991115
自1995年12月,我院生殖医学研究中心开始采用卵母细胞单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI) 治疗严重男性因素及不明原因不育患者，至1998年1月16日，我中心已采用ICSI技术共治疗了156个周期的不育患者[1]。目前对影响ICSI结果的因素了解不多， ICSI的关键是将一条制动精子通过穿破的卵膜置于卵母细胞胞浆内,但卵膜的穿破形式因人而异,甚至因不同的卵母细胞而异,这通常取决于操作技术环节和卵母细胞自身的特性。为此,我们就不同卵膜穿破形式对卵子的受精、卵裂情况的影响进行分析。
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一、资料与方法
1.研究对象：为1995年12月至1998年1月,在本中心接受ICSI治疗的156个周期的不育患者(152例)，女方平均年龄为(31.2±3.8)岁(23～42岁),男方平均年龄为(33.9±4.8)岁(26～54岁),平均不育时间为(6.3±2.8)年(2～15年)。适应证为严重少、弱、畸精症或前次体外受精(IVF)周期的受精率低(<20%)、阻塞性无精症患者[2]。
2.方法：(1)卵母细胞及精液处理：控制性促排卵采用本中心常规体外受精-胚胎移植(IVF-ET)方案[3]，注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)36小时后，B超指导下经阴道取卵。取卵4～6小时，将卵母细胞置于透明质酸酶溶液中，进行去卵丘结构处理，选择成熟的卵母细胞进行ICSI受精，精液采用 Peroll梯度离心法。根据显微注射过程中卵膜穿破的不同,将注射的成熟卵母细胞分为3组,A组：共307个卵，显微注射针穿刺卵母细胞膜过程中,注射针直接进入胞浆内,无需回吸胞浆；B组：共769个卵，注射针穿刺到胞浆深部时,轻微回吸少许胞浆,卵膜即穿破；C组：共405个卵，注射针穿刺到胞浆深部时,用力回吸一定量胞浆,卵膜才穿破。(2)观察项目：应用英国RI公司的显微操作仪及显微注射仪，注射15～18小时后，检查有无原核，40～60小时后观察卵裂，将胚胎分为两级，a级为无核碎片<50%，b级为无核碎片>50%。经阴道宫腔内移植质量优良的胚胎4个。移植后2周进行妊娠试验，7周后B超检查有无胎心搏动。
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3.统计学处理：采用χ2检验。
二、结果
3组卵子存活率差异有显著性(P<0.05)。操作过程中，A组的卵子存活率最低(72.6%)，B、C组卵子存活率分别为91.7%及90.6%(P>0.05)，总卵子存活率为87.4%。
以存活卵子计算受精率，3组分别为 66.8%、68.5%及66.2%(P>0.05)，总受精率为67.6%(见表1)。
表1 卵膜穿破不同类型与受精和卵裂的关系 组别
卵子数
(个)
存活卵子
, http://www.100md.com 正常受精
卵裂数
个数
百分比
(%)
个数
百分比
(%)
a 级(%)
b级 (%)
A组
307
223*
, 百拇医药
72.6
149
66.8
56**(42.0)
77**(58.0)
B组
769
705
91.7
483
68.5
339(77.9)
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96(22.1)
C组
405
367
90.6
243
66.2
161(73.5)
58(26.9)
合计
1481
1295
87.4
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875
67.6
556(70.6)
231(29.4)
与B、C两组比较，* P<0.05 ** P<0.01
A组的a级卵裂球数量最少，只有42.0%，B组最高，为77.9%，C组为73.5%，A组与另两组的a级卵裂球数量比较，差异有极显著性(P<0.01)。
三、讨论
在注射精子的技术和卵的质量均等的前提下，影响卵膜穿破的两个重要因素是卵膜的张力(或弹性)以及显微注射针的质量，另外透明带的硬度也会影响卵膜的穿破形式[4]。如果透明带较硬或注射针相对较粗而钝，将会在卵膜被刺破之前，透明带被注射针压迫成深陷入胞浆的八字型，当透明带最终被刺破时，注射针在瞬间“跃入”胞浆，从而出现A组的卵膜穿破类型，由于卵母细胞被压迫成八字型，再加上注射针突然刺入胞浆，细胞的显微结构被破坏，可能是A组卵子存活率低下的原因之一。但在多数的情况下，透明带的穿破是不成问题的，故卵膜的穿破形式主要取决于卵膜的张力。卵膜的脆性越大就越容易导致A组的穿破类型。如果注射针一接触到卵膜，无需压迫，卵母细胞的卵膜就被穿破，这些卵母细胞多数立即变黑以致死亡，即使存活也不受精，这是A组卵子存活率低下的另一个主要原因。
, http://www.100md.com
机械性去卵丘过程也是决定卵膜穿破类型的因素之一。洗卵针的口径太小，对卵母细胞的压迫太强，将损伤细胞的骨架结构，也是导致A组类型穿破的原因之一。
B、C组穿破的卵母细胞，卵子存活率明显高于A组，提示对卵膜的适当压迫后再进入胞浆的操作过程，有利于注射针回抽后卵膜的闭合，因为在这种情况下，卵膜的破口是在近胞浆的内侧，当注射针回抽时，被压迫的部分在缓慢回弹过程中，有更多的时间让卵膜回复其完整性。在C组穿破类型中，若注射针穿刺太深或针尖的“鹰嘴”太长，都有可能穿到对侧的卵膜，导致细胞死亡。
本研究结果提示，受精是一个不依赖于卵膜穿破类型的过程，主要取决于存活卵子的激活与否，以及精子是否成功注射到胞浆内。卵裂球的质量则以B组类型穿破形式为最好，A组类型最差，提示不同的卵膜穿破形式将影响受精卵的进一步发育，其中一个原因可能是B组类型穿破形式的操作过程比较柔和，而另两种类型的损伤较大，影响了细胞的骨架结构，导致一些不规则的分裂。
, http://www.100md.com
总之，卵膜穿破不同类型将影响卵子的存活以及受精卵的进一步发育，但对存活卵子的受精率影响不大。
参考文献
1 李蓉，庄广伦，张敏芳. 卵母细胞单精子显微注射治疗男性因素及不明原因不育. 中华妇产科杂志，1997,32:211-213.
2 李满，庄广伦，李蓉，等.卵浆内单精子注射术治疗阻塞性无精症不育症.中山医科大学学报，1998，19：131-132.
3 庄广伦，周灿权，张秀俊，等. 体外受精与胚胎移植34例报告. 生殖医学杂志， 1992,1:24-25.
4 Nagy ZP, Liu J, Joris H, et al. The influence of the site of sperm deposition and mode of oolemma breakage at intracytoplasmic sperm injection on fertilization and embryo deve- liopment rates. Hum Reprod,1995,12:3171-3177.
(收稿：1998-12-09 修回：1999-08-18), http://www.100md.com