雌激素与孕激素对卵巢癌耐药细胞系OVCAR-3生长及耐药的影响
作者：孟君艳 尤宗兵 郭燕燕
单位：孟君艳 100034 北京医科大学第一医院妇产科；尤宗兵，郭燕燕 现在航天部七一一医院妇产科
关键词：雌激素类；甲羟孕酮卵巢肿瘤；肿瘤细胞；培养的；抗药性；肿瘤
中华妇产科杂志/991109 【摘要】 目的 研究雌、孕激素对卵巢癌耐药细胞系OVCAR-3生长及对阿霉素(ADM)耐药的影响。方法 用四甲基偶氮唑蓝(MTT)快速比色法， 计算细胞生存率，以比较不同浓度雌、孕激素对细胞生长的影响，及雌、孕激素与异搏定对卵巢癌耐药细胞系OVCAR-3耐药性的影响。结果 高浓度的苯甲酸雌二醇(E2，10.00～100.00 μmol/L)和安宫黄体酮(MPA，100.00 μmol/L)可抑制OVCAR-3细胞的生长，且二者联合抑制作用增强；而较低浓度的E2(0.01～1.00 μmol/L)和MPA(0.01～10.00 μmol/L)对该细胞的生长无明显影响；异搏定可增加ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，即逆转该细胞对ADM 的耐药；E2或MPA均可增加ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，即逆转该细胞对ADM的耐药，且其作用强于异搏定。 结论 超生理浓度的雌、孕激素可抑制OVCAR-3细胞的生长，而较低浓度的雌、孕激素对其生长无影响；雌、孕激素可逆转OVCAR-3细胞对ADM的耐药，且作用强于异搏定，可望成为临床化疗的辅助用药。
, 百拇医药
Effects of Estradiol and Medroxyprogesterone on the Growth and Doxorubin-resistance of Drug-resistant
Human Epithelial Ovarian Cancer Cell Line OVCAR-3
MENG Junyan*, YOU Zongbing, GUO Yanyan. *
711 Hospital of China Areospace Corporation, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To study the effects of estradiol (E2) and medroxyprogesterone acetate (MPA) on the growth of drug resistant human epithelial ovarian cancer cell line. Methods OVCAR-3 cells, treated by different concentrations of E2, MPA and verapamil, were examined for their growth inhibitions with methyl thiazolyl tetrazolium (MTT, a tetrazolium dye) rapid photocolorimetric assay. Results OVCAR-3 cell growth was inhibited by E2 at high concentrations (10.00～100.00 μmol/L)and by MPA at 100.00 μmol/L, while lower concentrations of E2(0.01～1.00 μmol/L) and MPA(0.01～10.00 μmol/L) had no effect on OVCAR-3 cell growth, neither stimulation nor inhibition. The effect of E2 combined with MPA was more obvious than either one used separately. E2 and MPA in combination with doxorubin showed a synergistic inhibition effect on OVCAR-3 cell growth, which suggested that both of them could reverse the doxorubin resistance of OVCAR-3 cell line. The inhibition effect of Verapamil combined with doxorubin was obviously weaker than that of E2 and MPA. Conclusions E2 and MPA could reverse the doxorubin resistance of OVCAR-3 cell line and their inhibition were more obvious than that of verapamil, which suggested that E2 and MPA may be used clinically for adjuvant chemotherapy.
, 百拇医药
【Key words】 Estrogens Medroxyprogesterone Ovarian neoplasms Tumor cell, culturedDrug resistance neoplasm
肿瘤细胞减灭术及术后化学治疗(化疗)，是目前治疗卵巢癌的主要手段，但化疗的耐药问题严重影响了化疗的效果。近年来研究认为，多药耐药基因MDR1及其编码的P-糖蛋白介导的多药耐药，是化疗耐药的主要机理之一，并发现一些药物如异搏定、奎尼丁、环孢霉素A等，可逆转其介导的多药耐药[1] 。但这些药物的毒副作用较大，限制了临床应用。又有研究发现，孕酮可逆转P-糖蛋白介导的耐药，且其作用强于异搏定[2]。OVCAR-3卵巢癌细胞系是体外培养的对顺铂、阿霉素(ADM)、环磷酰胺等多种药物耐药的多药耐药细胞系。本研究对雌、孕激素对OVCAR-3细胞生长的影响，及能否逆转OVCAR-3细胞对ADM的耐药，进行了初步的探讨。
, http://www.100md.com 材料和方法
一、材料
苯甲酸雌二醇(E2)、安宫黄体酮(MPA)、盐酸维拉帕米(异搏定)均为化学对照品，来自中国药品生物制品检定所；ADM为汕头明治医药有限公司产品；四甲基偶氮唑蓝(MTT)为德国Serva公司产品；OVCAR-3细胞自美国标准细胞库引进。
二、 方法
1.细胞的制备：OVCAR-3细胞在培养液(含10%小牛血清的RPMI-1640培养基)中培养至对数生长期，消化、过滤制成单细胞悬液，稀释至3×105个细胞/ml，混匀后加入96孔细胞培养板，每孔100 μl，于37℃、5%二氧化碳培养箱培养18小时，吸弃上清液。
2.分组及细胞培养：将96孔培养板按列分组，每组8孔，第一组不加细胞，作为空白对照；一组为对照组，每孔加入不含药培养液200 μl。其余各组为实验组，每孔分别加入200 μl新鲜配制的不同浓度(即终浓度分别为0.01 μmol/L、 0.10 μmol/L、1.00 μmol/L、 10.00 μmol/L、50.00 μmol/L、100.00 μmol/L)的含药(E2、MPA、E2+MPA)培养液(研究对耐药的影响时，每组均加入终浓度为10.00 μmol/L的ADM，包括对照组)。继续培养48小时，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，再培养4小时；吸弃上清液，每孔加入二甲基亚砜溶液200 μl (包括空白对照孔)，混匀，使之彻底溶解，于30分钟内，以酶标仪测波长为600 nm处的吸光度值(以空白对照孔为零)。
, 百拇医药
3.细胞生存率：细胞生存率＝(实验组吸光度平均值/对照组吸光度平均值)×100%(以对照组生存率为100%)；或细胞生存率＝[实验组吸光度平均值/(对照组吸光度平均值÷50%)]×100%(研究对耐药的影响时，以对照组即只加ADM的生存率为50%，因预试验测得ADM浓度为10μmol/L时细胞生存率约50%)。
三、 统计学处理
本研究结果采用Gpis 1.12统计软件，计算各组吸光度(
±s)与对照组两两进行t检验。以Microsoft excel 97软件制图。
结果
一、 雌、孕激素对OVCAR-3细胞生长的作用
1. E2对OVCAR-3细胞生长的作用: E2浓度为0.01～1.00μmol/L时，OVCAR-3细胞生存率为101.0%～102.5%，与对照组生存率100.0%比较，差异无显著性 (P>0.05)。E2浓度10.00～100.00 μmol/L时，OVCAR-3细胞生存率为87.5%～65.9%,细胞生长受到抑制，与对照组比较，差异有显著性(P<0.05及P<0.01)。见表1。
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2. MPA对OVCAR-3细胞生长的作用:MPA浓度为0.01～10.00μmol/L时，细胞生存为98.7%～101.6%，与对照组生存率100.0%比较，差异无显著性 (P>0.05)。MPA浓度为50.00μmol/L时，细胞生存率为92.9%,细胞生长受到轻度抑制，但与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。MPA浓度为100.00μmol/L时，细胞生存率为36.5%,细胞生长受到明显抑制，与对照组比较，差异有极显著性(P<0.01)。见表1。
表1 两组E2 、MPA及E2 +MPA对OVCAR-3细胞生长的影响 组别
细胞生存率(%)
E2
MPA
E2+MPA
, http://www.100md.com
对照组(μmol/L)
100.0
100.0
100.0
0.00
实验组(μmol/L)
101.0
100.3
102.1
0.01
0.10
101.6
, 百拇医药 98.7
100.7
1.00
102.5
101.6
101.6
10.00
87.5*
101.6
89.7
50.00
86.8*
, 百拇医药
92.9
54.3**
100.00
65.9**
36.5**
28.7**
注：以上结果均为两次实验的细胞生存率的平均值， 对照组生存率为100%。*与对照组比较， P<0.05；** 与对照组比较， P<0.01
3. E2和MPA联合对OVCAR-3细胞生长的作用:E2和MPA联合应用，浓度0.01～1.00 μmol/L时，细胞生存率为100.7%～102.1%，与对照组生存率100.0%比较，差异无显著性(P>0.05)；浓度为10.00 μmol/L时，细胞生存率为89.7%，细胞生长受到轻度抑制，但与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)；浓度为50.00～100.00 μmol/L时，细胞生存率为54.3%～28.7%, 细胞生长受到明显抑制，与对照组比较, 差异有极显著性(P<0.01)。见表1。
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二、 雌、孕激素及异搏定对OVCAR-3细胞对ADM耐药的作用
1. E2对OVCAR-3细胞的ADM耐药对作用：E2浓度为0.01～10.00 μmol/L时,细胞生存率为51.7%～45.7%，与对照组即单加ADM组生存率50.0%比较,差异无显著性(P>0.05)；浓度为50.00～100.00 μmol/L时，细胞生存率为39.1%～19.3%，可增加ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，与单加ADM组比较，差异有极显著性(P<0.01)。见表2。
表2 不同浓度 E2 、MPA及异搏定对
OVCAR-3细胞对ADM耐药的影响 E2或异搏定
浓度(μmol/L)
, 百拇医药
细胞生存率 (%)
E2+ADM
MPA+ADM
异搏定+ADM
0.00
50.0
50.0
50.0
0.01
51.7
50.7
50.3
, http://www.100md.com 0.10
49.7
49.3
50.2
1.00
47.8
50.8
51.2
10.00
45.7
51.8
45.8*
50.00
, 百拇医药
39.1**
31.4**
41.1**
100.00
19.3**
11.0**
33.9**
注：以上结果均为两次实验的细胞生存率的平均值， 单加ADM组的细胞生存率为50%，ADM浓度均为10μmol/L。* 与单加ADM组比较， P<0.05；** 与单加ADM比较， P<0.01
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2. MPA对OVCAR-3细胞对ADM耐药的作用：MPA浓度为0.01～10.00μmol/L时，细胞生存率为49.3%～51.8%，与对照组即单加ADM组生存率50.0%比较，差异无显著性(P>0.05)；浓度50.00～100.00 μmol/L时，细胞生存率为31.4%～11.0%，均可增加ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，与单加ADM组相比较，差异有极显著性(P<0.001)，MPA的作用稍强于E2。见表2。
3. 异搏定对OVCAR-3细胞对ADM耐药的作用：异搏定浓度为0.01～1.00 μmol/L时细胞生存率为50.2%～51.2%，与对照组即单加ADM组生存率50.0%比较,差异无显著性(P>0.05)；浓度为10.00 μmol/L时，细胞生存率为45.8%,可轻度增加ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，与单加ADM组比较，差异有显著性(P<0.05)；浓度为50.00～100.00 μmol/L时，细胞生存率为41.1%～33.9%,可增加ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，与单加ADM组比较，差异有极显著性(P<0.01)，但作用程度低于同浓度的E2或MPA的作用。见表2，图1。
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图1 异搏定与E2及MPA对OVCAR-3细胞对ADM耐药的
作用比较， 各组ADM浓度均为10.00 μmol/L
讨论
一、 雌、孕激素对OVCAR-3细胞生长的影响
本研究结果显示， E2浓度为0.01～1.00 μmol/L时，对OVCAR-3细胞生长无明显影响，这与一些研究中雌激素可促进细胞生长的结果不一致。据Langdon等[3]的研究显示，对于含较高的雌激素受体(ER)水平(112 fmol/mg胞浆蛋白)的细胞系PEO4，雌激素可促进其生长，而对未检测出ER的PEO4细胞的生长则无影响。因此，此结果可能与OVCAR-3细胞中ER含量相对较少(28fmol/mg胞浆蛋白[4])有关。本研究中E2在超生理浓度(10～100.00 μmol/L)下对OVCAR-3细胞生长有抑制作用，这与戴建瑜等[5]的结果一致，这可能是通过某种受体外机理如调节一些转化因子的分泌[5]，直接影响细胞代谢而起作用的。
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对孕激素与卵巢癌细胞生长的关系的研究结果趋于一致，即孕激素对卵巢癌细胞有剂量依赖抑制作用，其中以天然孕酮作用更为明显[6] 。本研究中，MPA浓度为0.01～50.00 μmol/L时，对OVCAR-3细胞生长无显著影响，在100.00μmol/L时才显著抑制OVCAR-3细胞生长，这可能与OVCAR-3细胞缺乏孕激素受体(PR)有关[4]。而MPA在高浓度表现的抑制作用，也可能是通过某种受体外机理起作用的。
根据Hamilton等[7]的研究，雌激素可诱导OVCAR- 3细胞的PR的表达。其他学者也证实E2有诱导PR表达的作用[8] 。这可能是本研究中E2和MPA联合应用抑制作用明显增强的原因。提示在一些缺乏PR表达卵巢癌的治疗中，可考虑应用雌激素以增加PR表达，提高孕激素的疗效。
二、雌、孕激素与异搏定对OVCAR-3细胞对ADM耐药的影响
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本研究结果显示，在50 μmol/L浓度时，MPA对细胞生长无明显影响，与ADM合用却可明显增强ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，提示MPA可逆转OVCAR-3细胞对ADM的耐药。此结果与国外一些有关研究是一致的[2]。本研究中，E2也可增强ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，提示E2也可逆转OVCAR-3细胞对ADM的耐药，并且其作用仅稍弱于MPA。
异搏定是目前公认的有效的耐药修饰剂，可逆转多药耐药基因MDR1及其编码的P-糖蛋白介导的多药耐药。本研究显示，异搏定可增强ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，即逆转OVCAR-3细胞对ADM的耐药，但其作用弱于同浓度的雌、孕激素，此结果与国外一些有关研究是一致的[2]。异搏定逆转耐药的作用弱于MPA的原因可能如下：(1)据报道，小鼠多药耐药细胞中有两种多药耐药基因，即MDR1a和MDR1b，孕酮与MDR1b基因产物的结合明显多于MDR1a，而异搏定则无此特性[9]。且据近些年的研究报道，人类MDR1基因产物Pgp也有两个不同的结合区[10]。故在此细胞MPA与异搏定调节耐药的差异可能是由于两者与Pgp结合的位点不同。(2)虽然ADM耐药机理以Pgp介导的多药耐药机理为主，但在OVCAR-3细胞，也可能同时存在其他耐药机理，MPA也可能通过影响其他耐药机理起作用。
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本研究结果显示，超生理浓度的雌、孕激素可抑制OVCAR-3细胞的生长，而稍低浓度的雌、孕激素对其生长无影响；雌、孕激素可逆转OVCAR-3细胞对ADM的耐药，且作用强于异搏定，提示E2及MPA是有效的耐药修饰剂，并且相对细胞毒性小，可望成为临床化疗的辅助用药。
本课题为卫生部基金资助项目(课题编号：96-1-280)
参考文献
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5 戴建瑜, 丰有吉，杨毅，等. 卵巢癌细胞分泌转化因子-β1的雌激素调节及其与细胞增殖的关系. 中华妇产科杂志，1996，31: 736-739.
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8 戴建瑜, 丰有吉, 朱慧庭，等. 雌激素对卵巢上皮性癌AO细胞作用的探讨. 上海医学，1995, 18: 489-491.
, 百拇医药
9 Yang CPH, Cohen D, Greenberger LM, et al. Differential transport properties of two mdr gene products are distinguished by progesterone. J Bio Chem, 1990，265: 10282-10288.
10 Gottesman MM, Pastan I. Biochemistry of multidrug resistance mediated by the multidrug transporter. Annu Rev Biochem， 1993, 62: 385-427.
(收稿：1999-03-06 修回：1999-08-23), 百拇医药
单位：孟君艳 100034 北京医科大学第一医院妇产科；尤宗兵，郭燕燕 现在航天部七一一医院妇产科
关键词：雌激素类；甲羟孕酮卵巢肿瘤；肿瘤细胞；培养的；抗药性；肿瘤
中华妇产科杂志/991109 【摘要】 目的 研究雌、孕激素对卵巢癌耐药细胞系OVCAR-3生长及对阿霉素(ADM)耐药的影响。方法 用四甲基偶氮唑蓝(MTT)快速比色法， 计算细胞生存率，以比较不同浓度雌、孕激素对细胞生长的影响，及雌、孕激素与异搏定对卵巢癌耐药细胞系OVCAR-3耐药性的影响。结果 高浓度的苯甲酸雌二醇(E2，10.00～100.00 μmol/L)和安宫黄体酮(MPA，100.00 μmol/L)可抑制OVCAR-3细胞的生长，且二者联合抑制作用增强；而较低浓度的E2(0.01～1.00 μmol/L)和MPA(0.01～10.00 μmol/L)对该细胞的生长无明显影响；异搏定可增加ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，即逆转该细胞对ADM 的耐药；E2或MPA均可增加ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，即逆转该细胞对ADM的耐药，且其作用强于异搏定。 结论 超生理浓度的雌、孕激素可抑制OVCAR-3细胞的生长，而较低浓度的雌、孕激素对其生长无影响；雌、孕激素可逆转OVCAR-3细胞对ADM的耐药，且作用强于异搏定，可望成为临床化疗的辅助用药。
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Effects of Estradiol and Medroxyprogesterone on the Growth and Doxorubin-resistance of Drug-resistant
Human Epithelial Ovarian Cancer Cell Line OVCAR-3
MENG Junyan*, YOU Zongbing, GUO Yanyan. *
711 Hospital of China Areospace Corporation, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To study the effects of estradiol (E2) and medroxyprogesterone acetate (MPA) on the growth of drug resistant human epithelial ovarian cancer cell line. Methods OVCAR-3 cells, treated by different concentrations of E2, MPA and verapamil, were examined for their growth inhibitions with methyl thiazolyl tetrazolium (MTT, a tetrazolium dye) rapid photocolorimetric assay. Results OVCAR-3 cell growth was inhibited by E2 at high concentrations (10.00～100.00 μmol/L)and by MPA at 100.00 μmol/L, while lower concentrations of E2(0.01～1.00 μmol/L) and MPA(0.01～10.00 μmol/L) had no effect on OVCAR-3 cell growth, neither stimulation nor inhibition. The effect of E2 combined with MPA was more obvious than either one used separately. E2 and MPA in combination with doxorubin showed a synergistic inhibition effect on OVCAR-3 cell growth, which suggested that both of them could reverse the doxorubin resistance of OVCAR-3 cell line. The inhibition effect of Verapamil combined with doxorubin was obviously weaker than that of E2 and MPA. Conclusions E2 and MPA could reverse the doxorubin resistance of OVCAR-3 cell line and their inhibition were more obvious than that of verapamil, which suggested that E2 and MPA may be used clinically for adjuvant chemotherapy.
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【Key words】 Estrogens Medroxyprogesterone Ovarian neoplasms Tumor cell, culturedDrug resistance neoplasm
肿瘤细胞减灭术及术后化学治疗(化疗)，是目前治疗卵巢癌的主要手段，但化疗的耐药问题严重影响了化疗的效果。近年来研究认为，多药耐药基因MDR1及其编码的P-糖蛋白介导的多药耐药，是化疗耐药的主要机理之一，并发现一些药物如异搏定、奎尼丁、环孢霉素A等，可逆转其介导的多药耐药[1] 。但这些药物的毒副作用较大，限制了临床应用。又有研究发现，孕酮可逆转P-糖蛋白介导的耐药，且其作用强于异搏定[2]。OVCAR-3卵巢癌细胞系是体外培养的对顺铂、阿霉素(ADM)、环磷酰胺等多种药物耐药的多药耐药细胞系。本研究对雌、孕激素对OVCAR-3细胞生长的影响，及能否逆转OVCAR-3细胞对ADM的耐药，进行了初步的探讨。
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一、材料
苯甲酸雌二醇(E2)、安宫黄体酮(MPA)、盐酸维拉帕米(异搏定)均为化学对照品，来自中国药品生物制品检定所；ADM为汕头明治医药有限公司产品；四甲基偶氮唑蓝(MTT)为德国Serva公司产品；OVCAR-3细胞自美国标准细胞库引进。
二、 方法
1.细胞的制备：OVCAR-3细胞在培养液(含10%小牛血清的RPMI-1640培养基)中培养至对数生长期，消化、过滤制成单细胞悬液，稀释至3×105个细胞/ml，混匀后加入96孔细胞培养板，每孔100 μl，于37℃、5%二氧化碳培养箱培养18小时，吸弃上清液。
2.分组及细胞培养：将96孔培养板按列分组，每组8孔，第一组不加细胞，作为空白对照；一组为对照组，每孔加入不含药培养液200 μl。其余各组为实验组，每孔分别加入200 μl新鲜配制的不同浓度(即终浓度分别为0.01 μmol/L、 0.10 μmol/L、1.00 μmol/L、 10.00 μmol/L、50.00 μmol/L、100.00 μmol/L)的含药(E2、MPA、E2+MPA)培养液(研究对耐药的影响时，每组均加入终浓度为10.00 μmol/L的ADM，包括对照组)。继续培养48小时，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，再培养4小时；吸弃上清液，每孔加入二甲基亚砜溶液200 μl (包括空白对照孔)，混匀，使之彻底溶解，于30分钟内，以酶标仪测波长为600 nm处的吸光度值(以空白对照孔为零)。
, 百拇医药
3.细胞生存率：细胞生存率＝(实验组吸光度平均值/对照组吸光度平均值)×100%(以对照组生存率为100%)；或细胞生存率＝[实验组吸光度平均值/(对照组吸光度平均值÷50%)]×100%(研究对耐药的影响时，以对照组即只加ADM的生存率为50%，因预试验测得ADM浓度为10μmol/L时细胞生存率约50%)。
三、 统计学处理
本研究结果采用Gpis 1.12统计软件，计算各组吸光度(
±s)与对照组两两进行t检验。以Microsoft excel 97软件制图。结果
一、 雌、孕激素对OVCAR-3细胞生长的作用
1. E2对OVCAR-3细胞生长的作用: E2浓度为0.01～1.00μmol/L时，OVCAR-3细胞生存率为101.0%～102.5%，与对照组生存率100.0%比较，差异无显著性 (P>0.05)。E2浓度10.00～100.00 μmol/L时，OVCAR-3细胞生存率为87.5%～65.9%,细胞生长受到抑制，与对照组比较，差异有显著性(P<0.05及P<0.01)。见表1。
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2. MPA对OVCAR-3细胞生长的作用:MPA浓度为0.01～10.00μmol/L时，细胞生存为98.7%～101.6%，与对照组生存率100.0%比较，差异无显著性 (P>0.05)。MPA浓度为50.00μmol/L时，细胞生存率为92.9%,细胞生长受到轻度抑制，但与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。MPA浓度为100.00μmol/L时，细胞生存率为36.5%,细胞生长受到明显抑制，与对照组比较，差异有极显著性(P<0.01)。见表1。
表1 两组E2 、MPA及E2 +MPA对OVCAR-3细胞生长的影响 组别
细胞生存率(%)
E2
MPA
E2+MPA
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对照组(μmol/L)
100.0
100.0
100.0
0.00
实验组(μmol/L)
101.0
100.3
102.1
0.01
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10.00
87.5*
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54.3**
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65.9**
36.5**
28.7**
注：以上结果均为两次实验的细胞生存率的平均值， 对照组生存率为100%。*与对照组比较， P<0.05；** 与对照组比较， P<0.01
3. E2和MPA联合对OVCAR-3细胞生长的作用:E2和MPA联合应用，浓度0.01～1.00 μmol/L时，细胞生存率为100.7%～102.1%，与对照组生存率100.0%比较，差异无显著性(P>0.05)；浓度为10.00 μmol/L时，细胞生存率为89.7%，细胞生长受到轻度抑制，但与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)；浓度为50.00～100.00 μmol/L时，细胞生存率为54.3%～28.7%, 细胞生长受到明显抑制，与对照组比较, 差异有极显著性(P<0.01)。见表1。
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二、 雌、孕激素及异搏定对OVCAR-3细胞对ADM耐药的作用
1. E2对OVCAR-3细胞的ADM耐药对作用：E2浓度为0.01～10.00 μmol/L时,细胞生存率为51.7%～45.7%，与对照组即单加ADM组生存率50.0%比较,差异无显著性(P>0.05)；浓度为50.00～100.00 μmol/L时，细胞生存率为39.1%～19.3%，可增加ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，与单加ADM组比较，差异有极显著性(P<0.01)。见表2。
表2 不同浓度 E2 、MPA及异搏定对
OVCAR-3细胞对ADM耐药的影响 E2或异搏定
浓度(μmol/L)
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细胞生存率 (%)
E2+ADM
MPA+ADM
异搏定+ADM
0.00
50.0
50.0
50.0
0.01
51.7
50.7
50.3
, http://www.100md.com 0.10
49.7
49.3
50.2
1.00
47.8
50.8
51.2
10.00
45.7
51.8
45.8*
50.00
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39.1**
31.4**
41.1**
100.00
19.3**
11.0**
33.9**
注：以上结果均为两次实验的细胞生存率的平均值， 单加ADM组的细胞生存率为50%，ADM浓度均为10μmol/L。* 与单加ADM组比较， P<0.05；** 与单加ADM比较， P<0.01
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2. MPA对OVCAR-3细胞对ADM耐药的作用：MPA浓度为0.01～10.00μmol/L时，细胞生存率为49.3%～51.8%，与对照组即单加ADM组生存率50.0%比较，差异无显著性(P>0.05)；浓度50.00～100.00 μmol/L时，细胞生存率为31.4%～11.0%，均可增加ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，与单加ADM组相比较，差异有极显著性(P<0.001)，MPA的作用稍强于E2。见表2。
3. 异搏定对OVCAR-3细胞对ADM耐药的作用：异搏定浓度为0.01～1.00 μmol/L时细胞生存率为50.2%～51.2%，与对照组即单加ADM组生存率50.0%比较,差异无显著性(P>0.05)；浓度为10.00 μmol/L时，细胞生存率为45.8%,可轻度增加ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，与单加ADM组比较，差异有显著性(P<0.05)；浓度为50.00～100.00 μmol/L时，细胞生存率为41.1%～33.9%,可增加ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，与单加ADM组比较，差异有极显著性(P<0.01)，但作用程度低于同浓度的E2或MPA的作用。见表2，图1。
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图1 异搏定与E2及MPA对OVCAR-3细胞对ADM耐药的
作用比较， 各组ADM浓度均为10.00 μmol/L
讨论
一、 雌、孕激素对OVCAR-3细胞生长的影响
本研究结果显示， E2浓度为0.01～1.00 μmol/L时，对OVCAR-3细胞生长无明显影响，这与一些研究中雌激素可促进细胞生长的结果不一致。据Langdon等[3]的研究显示，对于含较高的雌激素受体(ER)水平(112 fmol/mg胞浆蛋白)的细胞系PEO4，雌激素可促进其生长，而对未检测出ER的PEO4细胞的生长则无影响。因此，此结果可能与OVCAR-3细胞中ER含量相对较少(28fmol/mg胞浆蛋白[4])有关。本研究中E2在超生理浓度(10～100.00 μmol/L)下对OVCAR-3细胞生长有抑制作用，这与戴建瑜等[5]的结果一致，这可能是通过某种受体外机理如调节一些转化因子的分泌[5]，直接影响细胞代谢而起作用的。
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对孕激素与卵巢癌细胞生长的关系的研究结果趋于一致，即孕激素对卵巢癌细胞有剂量依赖抑制作用，其中以天然孕酮作用更为明显[6] 。本研究中，MPA浓度为0.01～50.00 μmol/L时，对OVCAR-3细胞生长无显著影响，在100.00μmol/L时才显著抑制OVCAR-3细胞生长，这可能与OVCAR-3细胞缺乏孕激素受体(PR)有关[4]。而MPA在高浓度表现的抑制作用，也可能是通过某种受体外机理起作用的。
根据Hamilton等[7]的研究，雌激素可诱导OVCAR- 3细胞的PR的表达。其他学者也证实E2有诱导PR表达的作用[8] 。这可能是本研究中E2和MPA联合应用抑制作用明显增强的原因。提示在一些缺乏PR表达卵巢癌的治疗中，可考虑应用雌激素以增加PR表达，提高孕激素的疗效。
二、雌、孕激素与异搏定对OVCAR-3细胞对ADM耐药的影响
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本研究结果显示，在50 μmol/L浓度时，MPA对细胞生长无明显影响，与ADM合用却可明显增强ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，提示MPA可逆转OVCAR-3细胞对ADM的耐药。此结果与国外一些有关研究是一致的[2]。本研究中，E2也可增强ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，提示E2也可逆转OVCAR-3细胞对ADM的耐药，并且其作用仅稍弱于MPA。
异搏定是目前公认的有效的耐药修饰剂，可逆转多药耐药基因MDR1及其编码的P-糖蛋白介导的多药耐药。本研究显示，异搏定可增强ADM对OVCAR-3细胞的抑制作用，即逆转OVCAR-3细胞对ADM的耐药，但其作用弱于同浓度的雌、孕激素，此结果与国外一些有关研究是一致的[2]。异搏定逆转耐药的作用弱于MPA的原因可能如下：(1)据报道，小鼠多药耐药细胞中有两种多药耐药基因，即MDR1a和MDR1b，孕酮与MDR1b基因产物的结合明显多于MDR1a，而异搏定则无此特性[9]。且据近些年的研究报道，人类MDR1基因产物Pgp也有两个不同的结合区[10]。故在此细胞MPA与异搏定调节耐药的差异可能是由于两者与Pgp结合的位点不同。(2)虽然ADM耐药机理以Pgp介导的多药耐药机理为主，但在OVCAR-3细胞，也可能同时存在其他耐药机理，MPA也可能通过影响其他耐药机理起作用。
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本研究结果显示，超生理浓度的雌、孕激素可抑制OVCAR-3细胞的生长，而稍低浓度的雌、孕激素对其生长无影响；雌、孕激素可逆转OVCAR-3细胞对ADM的耐药，且作用强于异搏定，提示E2及MPA是有效的耐药修饰剂，并且相对细胞毒性小，可望成为临床化疗的辅助用药。
本课题为卫生部基金资助项目(课题编号：96-1-280)
参考文献
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3 Langdon SP, Hawkes MM, Lawrie SS, et al. Oestrogen receptor expression and the effects of oestrogen and tamoxifen on the growth of human ovarian carcinoma cell lines. Br J Cancer, 1990, 62: 213-216.
4 Hamilton TC, Young RC, McKoy WM, et al. Characterization of a human ovarian carcinoma cell line (NIH:OVCAR-3) with androgen and estrogen receptors. Cancer Res, 1983, 43: 5379-5389.
5 戴建瑜, 丰有吉，杨毅，等. 卵巢癌细胞分泌转化因子-β1的雌激素调节及其与细胞增殖的关系. 中华妇产科杂志，1996，31: 736-739.
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6 Yano T, Pinski J, Radulovic S, et al. Inhibition of human epithelial ovarian cancer cell growth in vitro by agonistic and antagonistic analogues of luteinizing hormone-releasing hormone. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 1701-1705.
7 Hamilton TC, Behrens BC, Louie KG, et al. Induction of progesterone receptor with 17-β-estradiol in human ovarian cancer. J Clin Endocrin Metab, 1984, 591: 561-563.
8 戴建瑜, 丰有吉, 朱慧庭，等. 雌激素对卵巢上皮性癌AO细胞作用的探讨. 上海医学，1995, 18: 489-491.
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9 Yang CPH, Cohen D, Greenberger LM, et al. Differential transport properties of two mdr gene products are distinguished by progesterone. J Bio Chem, 1990，265: 10282-10288.
10 Gottesman MM, Pastan I. Biochemistry of multidrug resistance mediated by the multidrug transporter. Annu Rev Biochem， 1993, 62: 385-427.
(收稿：1999-03-06 修回：1999-08-23), 百拇医药