体外受精-胚胎移植过程中多原核孕卵生成的影响因素
作者：金帆 石一复 周馥贞 黄荷凤
单位：310006 杭州， 浙江大学医学院附属妇产科医院
关键词：受精；体外；胚胎移植；年龄因素；受精
中华妇产科杂志/991104 【摘要】 目的 探讨体外受精-胚胎移植(IVF-ET)过程中多原核孕卵生成的影响因素及降低该类异常受精的方法。方法 应用多因素Logistic回归方法，分析145个IVF-ET周期、1 168个卵细胞的资料，研究多原核孕卵生成率与夫妇年龄、促超排卵方案、穿刺卵泡数、获取卵细胞数、授精前孵育时间、精液精子与授精精子质量和数量以及卵细胞受精率的关系。 结果 成熟卵多原核孕卵生成率与女方年龄和可穿刺卵泡数呈显著性负相关，未成熟卵多原核孕卵生成率与精液精子密度及卵细胞受精率呈显著性正相关。结论 女方年龄和可穿刺卵泡数影响成熟卵多原核孕卵生成率，男方精液高活动力精子和卵细胞受精率是未成熟卵多原核孕卵生成的重要因素。选择合适剂量，提高个体对促排卵药物的反应，可能有助于减少多原核孕卵的生成。
, 百拇医药
Analyses of the Factors Affecting the Occurrence of Polypronuclear
Embryos in In-vitro Fertilization and Embryo Transfer
JIN Fan, SHI Yifu, ZHOU Fuzhen, et al.
Affiliated Obstetrics and Gynecology Hospital,Faculty of Medicine Zhejiang University, Hangzhou 310006
【Abstract】 Objective To investigate the factors affecting the occurrences of the polypronuclear embryos in in-vitro fertilization and embryo transfer ( IVF-ET ). Methods The data from 145 IVF-ET cycles and 1 168 oocytes were analyzed by logistic regression for multiple factors. The influences of the couple's age, the superovulation stimulation protocols, the number of the follicles punctured and the oocytes obtained, the preinseminational interval, the quality and quantity of seminal and inseminational sperms, and the oocyte fertilization ratio on the incidences of the polypronuclear embryos from the matured, and immature oocytes were examined respectively. Results The incidence of the polypronuclear embryos from matured oocytes was significantly negatively correlated with the woman age and the number of the follicles punctured, and the incidence from immature oocytes was significantly positively correlated with the density of sperms at grade a and b and the oocyte fertilization ratio. Conclusions The woman′s age and the number of follicles are the main factors which influence the occurrence of polypronclear embryos from matured oocytes, while the density of the seminal sperm with high motility and the fertilization ratio play important roles in the occurrence of polypronuclear embryos in immature oocytes. Stimulating greater number of follicles might be benefit for the reduction of occurrence of polypronuclear embryos.
, 百拇医药
【Key words】 Fertilization in vitro Embryo transfer Age factors Fertilization
体外受精-胚胎移植(in-vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET) 过程中产生的多原核孕卵，既减少了正常可移植胚胎的数量，又增加部分性葡萄胎和多倍体异常儿发生的风险[1,2]。关于其生成的影响因素，争议较多，且研究多采用单因素分析[2, 3]，旨在消除各因素间的交互作用，更确切了解IVF-ET过程中多原核孕卵生成的影响因素，本研究应用多因素Logistic回归分析，对145个IVF-ET周期、1 168个卵细胞的多原核孕卵生成率与夫妇双方年龄、促超排卵方案、穿刺卵泡数量、获取卵细胞数、授精前孵育时间、精液精子与授精精子数量和质量以及卵细胞受精率等因素的关系进行了研究，现报道如下。
资料与方法
, 百拇医药
一、 资料来源
选择1995年10月～1997年7月间，我院辅助生殖科患者的145个IVF-ET周期。
二、 方法
采用单纯促性腺激素和促性腺激素加促性腺激素释放激素激动剂方案[4]诱导促超排卵。按我院常规[5]行卵泡穿刺、卵子-放射冠-卵丘复合物(OCCs)孵育、精液分析、精液处理和体外受精。
三、 判断标准
OCCs按Davis的标准[4]分级，I、II级为成熟卵，III级为未成熟卵，IV级为过熟或闭锁卵。授精后15～20小时，去除卵细胞外包颗粒细胞，镜检卵细胞，原核数<2为未受精卵，原核数≥2为受精卵，其中>2的为多原核孕卵。
, 百拇医药
四、 统计方法
应用SPSS软件包，选择向后逐步回归分析(blackword-LR)法，以P<0.05和P>0.10分别为进出方程的标准，进行Logistic回归分析。考虑到成熟和未成熟卵体外受精能力的明显差别[4，5]，对成熟卵和未成熟卵的多原核孕卵生成率分别进行观察。
结果
一、 多原核孕卵生成率
共计145个IVF-ET周期，去除4个过熟卵，有1 168个OCCs。其中成熟卵702 个，未成熟卵466个。受精和多原核孕卵生成情况见表1，成熟卵受精率显著高于未成熟卵(P<0.01)，但两类卵多原核孕卵生成率比较，差异无显著性(P>0.05)。
表1 成熟和未成熟卵的受精及多原核孕卵生成情况 类别
, http://www.100md.com
OCCs
(个)
受精卵
多原核孕卵
个数
受精率(%)
个数
生成率(%)
成熟卵
702
537
76.5
29
, 百拇医药
5.4
未成熟卵
466
269
57.7
20
7.4
合计
1168
806
69.0
49
6.1
, 百拇医药
二、各周期不同观察因素情况
采用单纯促性腺激素方案促超排卵33个周期，促性腺激素加促性腺激素释放激素激动剂方案112个周期。其余各周期不同观察因素的中位数和范围见表2。
三、 Logistic回归分析结果
女方年龄和穿刺卵泡数与成熟卵多原核孕卵生成率存在显著性负相关，精液精子密度和卵细胞受精率与未成熟卵的多原核孕卵生成率呈显著性正相关。见表3。而男方年龄、促超排卵方案、获取卵细胞数、卵细胞成熟度、授精前卵细胞孵育时间、处理后授精精子以及处理前精液精子的其他指标等因素，与两类卵细胞的多原核孕卵生成率均无显著相关性(P>0.10)。表2 IVF-ET周期观察指标的中位数和范围 观察指标
中位数
范围
, 百拇医药
女方年龄
29.0
24.0～42.0
男方年龄
33.0
26.0～55.0
穿刺卵泡数
12.0
1.0～50.0
获取卵细胞数
8.0
1.0～34.0
, http://www.100md.com 授精前孵育时间(小时)
5.0
0.5～22.0
精液精子密度(×109/L)
58.7
1.3～181.0
精液精子活动率(%)
60.8
9.9～95.0
精液a*+b**级精子密度(×109/L)
30.1
, http://www.100md.com
0.5～95.0
授精精子密度(×108/L)
1.2
0.3～5.6
授精精子活动率(%)
96.0
75.0～100.0
成熟卵受精率(%)
85.7
0.0～100.0
未成熟卵受精率(%)
66.7
, 百拇医药
0.0～100.0
* 快速直线运动 ** 快速非直线或慢速直线运动
表3 成熟卵与未成熟卵Logistic回归分析结果 类别
估计
参数
标准误
估计
危险度
P值
成熟卵
女方年龄
, 百拇医药 -0.1097
0.0280
0.8961
0.0001
穿刺卵泡数
-0.0780
0.0310
0.9250
0.01
未成熟卵
精液a+b级精子密度*
0.0389
, 百拇医药
0.0125
1.0397
0.001
受精率
2.6188
1.0054
13.7199
0.01
* 密度单位×109/L
讨论
一、女方年龄和穿刺卵泡数与成熟卵多原核孕卵生成
IVF-ET过程中多原核孕卵主要起源于多精子受精，生成率约3%～10%[1-4]。IVF-ET 过程涉及众多因素[5，6]，其多数也可能影响多原核孕卵的生成，因此应用多因素Logistic回归分析法进行分析。结果未显示受精前，卵细胞孵育时间和两类促超排卵方案对成熟或未成熟卵细胞多原核孕卵生成的显著性影响，却发现女方年龄和穿刺卵泡数与成熟卵的多原核孕卵生成率呈显著性负相关。年轻妇女卵细胞生长力旺盛，其成熟卵在IVF-ET培养系统中发育较快，可能易至受精相对延迟。受精延迟被认为是多精子受精的原因之一[2，3]。较多的可穿刺卵泡数和发育成熟的OCCs，常常是个体对促排卵药物反应良好的表现。穿刺卵泡数增加，成熟卵多原核孕卵生成率下降，是否意味着对促排卵药物反应良好的个体，其成熟卵透明带结构较为完整，抗多精子受精能力较强，值得研究。
, 百拇医药
除考虑女方高龄对IVF-ET的不利影响[6，7]外，还应考虑较年轻妇女多倍体胚胎生成可能性增加。对不同个体选择合适的促超排卵剂量，提高其反应性，可能有助于减少多原核孕卵的生成率。
二、 精液高活动力精子和受精率与未成熟卵多原核孕卵生成
卵细胞抗多精子受精机理，包括卵细胞透明带下间隙皮质颗粒释放和透明带内表面致密化[1]。授精精子数量的增多可导致卵细胞皮质颗粒释放迟缓，招致较高频率的多精子受精[4]。未成熟卵多原核孕卵生成率与精液a+b 级精子密度存在显著性正相关，表明未成熟卵抗多精子受精机制易受高活力精子的干扰。不过，本资料并未发现经上游法处理的授精精子密度及活动率与多原核孕卵生成率的联系。精子上游主要改善活动率而非活动力，不能消除导致精液变化的精子内在因素，加之用于授精的各周期精子密度及活动率经调整差距较小，是上述结果的原因。对精液高活动力精子密度较高，卵细胞成熟较低者，需加强多原核孕卵的确认和剔除，对精液高活动力精子密度较低者，适度调高授精精子密度，增加多精子受精的风险不大。
, http://www.100md.com
精卵细胞受精融合是生成受精卵或孕卵的前提条件，受精过程中抗多精子受精机制障碍产生多原核孕卵。本研究结果显示，未成熟卵多原核孕卵生成率与其受精率呈显著性正相关，而与成熟卵的同项指标无显著相关性，提示未成熟卵的抗多精子受精的能力随其受精能力和机会的增加而削弱，成熟卵该两项机制相对独立，可能是它们透明带发育程度差异的反映。结合年龄、穿刺卵泡数、高活动力精子对两类卵多原核孕卵生成率影响的不同，推测成熟和未成熟卵的抗多精子受精机制可能存在差异。当然，最终的结论可能需要更大的样本数证实。
参考文献
1 Trounson A， Bongso A. Fertilization and development in humans. Cur Top Dev Bio, 1996, 32: 59-62.
2 Ho PC, Yeung WSB, Chan YF, et al. Factors affecting the incidence of polyploidy in a human in vitro fertilization program. Int Fertil, 1994, 39: 14-19.
, http://www.100md.com
3 Sengoku K, Ishikawa M, Tamate K, et al. Polynuclear fertilization in various stimulation protocols in in-vitro fertilization. Int Fertil, 1994, 39: 45-51.
4 Davis OK， Rosenwaks Z. In-vitro fertilization. In: Adashi EY, Rock JA, Rosenwaks Z, eds. Reproductive endocrinology, surgery and technology. Philadelphia: Lippincott, 1995. 2320-2333.
5 金帆, 石一复, 周馥贞, 等. 精子质量和数量对体外受精率、卵裂率和卵裂胚胎的影响. 中华妇产科杂志, 1998, 33: 28-30.
6 张丽珠， 魏克新， 刘平, 等. 体外受精-胚胎移植中影响临床妊娠的因素: 附559个周期分析. 中华妇产科杂志, 1998, 33: 727-730.
7 Yie SM, Collins JA, Daya S, et al. Polyploidy and fertilization in in-vitro fertilization are related to patient′s age and gamete quality. Hum Reprod, 1996, 11: 614-617.
(收稿：1998-12-22 修回：1999-08-10), 百拇医药
单位：310006 杭州， 浙江大学医学院附属妇产科医院
关键词：受精；体外；胚胎移植；年龄因素；受精
中华妇产科杂志/991104 【摘要】 目的 探讨体外受精-胚胎移植(IVF-ET)过程中多原核孕卵生成的影响因素及降低该类异常受精的方法。方法 应用多因素Logistic回归方法，分析145个IVF-ET周期、1 168个卵细胞的资料，研究多原核孕卵生成率与夫妇年龄、促超排卵方案、穿刺卵泡数、获取卵细胞数、授精前孵育时间、精液精子与授精精子质量和数量以及卵细胞受精率的关系。 结果 成熟卵多原核孕卵生成率与女方年龄和可穿刺卵泡数呈显著性负相关，未成熟卵多原核孕卵生成率与精液精子密度及卵细胞受精率呈显著性正相关。结论 女方年龄和可穿刺卵泡数影响成熟卵多原核孕卵生成率，男方精液高活动力精子和卵细胞受精率是未成熟卵多原核孕卵生成的重要因素。选择合适剂量，提高个体对促排卵药物的反应，可能有助于减少多原核孕卵的生成。
, 百拇医药
Analyses of the Factors Affecting the Occurrence of Polypronuclear
Embryos in In-vitro Fertilization and Embryo Transfer
JIN Fan, SHI Yifu, ZHOU Fuzhen, et al.
Affiliated Obstetrics and Gynecology Hospital,Faculty of Medicine Zhejiang University, Hangzhou 310006
【Abstract】 Objective To investigate the factors affecting the occurrences of the polypronuclear embryos in in-vitro fertilization and embryo transfer ( IVF-ET ). Methods The data from 145 IVF-ET cycles and 1 168 oocytes were analyzed by logistic regression for multiple factors. The influences of the couple's age, the superovulation stimulation protocols, the number of the follicles punctured and the oocytes obtained, the preinseminational interval, the quality and quantity of seminal and inseminational sperms, and the oocyte fertilization ratio on the incidences of the polypronuclear embryos from the matured, and immature oocytes were examined respectively. Results The incidence of the polypronuclear embryos from matured oocytes was significantly negatively correlated with the woman age and the number of the follicles punctured, and the incidence from immature oocytes was significantly positively correlated with the density of sperms at grade a and b and the oocyte fertilization ratio. Conclusions The woman′s age and the number of follicles are the main factors which influence the occurrence of polypronclear embryos from matured oocytes, while the density of the seminal sperm with high motility and the fertilization ratio play important roles in the occurrence of polypronuclear embryos in immature oocytes. Stimulating greater number of follicles might be benefit for the reduction of occurrence of polypronuclear embryos.
, 百拇医药
【Key words】 Fertilization in vitro Embryo transfer Age factors Fertilization
体外受精-胚胎移植(in-vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET) 过程中产生的多原核孕卵，既减少了正常可移植胚胎的数量，又增加部分性葡萄胎和多倍体异常儿发生的风险[1,2]。关于其生成的影响因素，争议较多，且研究多采用单因素分析[2, 3]，旨在消除各因素间的交互作用，更确切了解IVF-ET过程中多原核孕卵生成的影响因素，本研究应用多因素Logistic回归分析，对145个IVF-ET周期、1 168个卵细胞的多原核孕卵生成率与夫妇双方年龄、促超排卵方案、穿刺卵泡数量、获取卵细胞数、授精前孵育时间、精液精子与授精精子数量和质量以及卵细胞受精率等因素的关系进行了研究，现报道如下。
资料与方法
, 百拇医药
一、 资料来源
选择1995年10月～1997年7月间，我院辅助生殖科患者的145个IVF-ET周期。
二、 方法
采用单纯促性腺激素和促性腺激素加促性腺激素释放激素激动剂方案[4]诱导促超排卵。按我院常规[5]行卵泡穿刺、卵子-放射冠-卵丘复合物(OCCs)孵育、精液分析、精液处理和体外受精。
三、 判断标准
OCCs按Davis的标准[4]分级，I、II级为成熟卵，III级为未成熟卵，IV级为过熟或闭锁卵。授精后15～20小时，去除卵细胞外包颗粒细胞，镜检卵细胞，原核数<2为未受精卵，原核数≥2为受精卵，其中>2的为多原核孕卵。
, 百拇医药
四、 统计方法
应用SPSS软件包，选择向后逐步回归分析(blackword-LR)法，以P<0.05和P>0.10分别为进出方程的标准，进行Logistic回归分析。考虑到成熟和未成熟卵体外受精能力的明显差别[4，5]，对成熟卵和未成熟卵的多原核孕卵生成率分别进行观察。
结果
一、 多原核孕卵生成率
共计145个IVF-ET周期，去除4个过熟卵，有1 168个OCCs。其中成熟卵702 个，未成熟卵466个。受精和多原核孕卵生成情况见表1，成熟卵受精率显著高于未成熟卵(P<0.01)，但两类卵多原核孕卵生成率比较，差异无显著性(P>0.05)。
表1 成熟和未成熟卵的受精及多原核孕卵生成情况 类别
, http://www.100md.com
OCCs
(个)
受精卵
多原核孕卵
个数
受精率(%)
个数
生成率(%)
成熟卵
702
537
76.5
29
, 百拇医药
5.4
未成熟卵
466
269
57.7
20
7.4
合计
1168
806
69.0
49
6.1
, 百拇医药
二、各周期不同观察因素情况
采用单纯促性腺激素方案促超排卵33个周期，促性腺激素加促性腺激素释放激素激动剂方案112个周期。其余各周期不同观察因素的中位数和范围见表2。
三、 Logistic回归分析结果
女方年龄和穿刺卵泡数与成熟卵多原核孕卵生成率存在显著性负相关，精液精子密度和卵细胞受精率与未成熟卵的多原核孕卵生成率呈显著性正相关。见表3。而男方年龄、促超排卵方案、获取卵细胞数、卵细胞成熟度、授精前卵细胞孵育时间、处理后授精精子以及处理前精液精子的其他指标等因素，与两类卵细胞的多原核孕卵生成率均无显著相关性(P>0.10)。表2 IVF-ET周期观察指标的中位数和范围 观察指标
中位数
范围
, 百拇医药
女方年龄
29.0
24.0～42.0
男方年龄
33.0
26.0～55.0
穿刺卵泡数
12.0
1.0～50.0
获取卵细胞数
8.0
1.0～34.0
, http://www.100md.com 授精前孵育时间(小时)
5.0
0.5～22.0
精液精子密度(×109/L)
58.7
1.3～181.0
精液精子活动率(%)
60.8
9.9～95.0
精液a*+b**级精子密度(×109/L)
30.1
, http://www.100md.com
0.5～95.0
授精精子密度(×108/L)
1.2
0.3～5.6
授精精子活动率(%)
96.0
75.0～100.0
成熟卵受精率(%)
85.7
0.0～100.0
未成熟卵受精率(%)
66.7
, 百拇医药
0.0～100.0
* 快速直线运动 ** 快速非直线或慢速直线运动
表3 成熟卵与未成熟卵Logistic回归分析结果 类别
估计
参数
标准误
估计
危险度
P值
成熟卵
女方年龄
, 百拇医药 -0.1097
0.0280
0.8961
0.0001
穿刺卵泡数
-0.0780
0.0310
0.9250
0.01
未成熟卵
精液a+b级精子密度*
0.0389
, 百拇医药
0.0125
1.0397
0.001
受精率
2.6188
1.0054
13.7199
0.01
* 密度单位×109/L
讨论
一、女方年龄和穿刺卵泡数与成熟卵多原核孕卵生成
IVF-ET过程中多原核孕卵主要起源于多精子受精，生成率约3%～10%[1-4]。IVF-ET 过程涉及众多因素[5，6]，其多数也可能影响多原核孕卵的生成，因此应用多因素Logistic回归分析法进行分析。结果未显示受精前，卵细胞孵育时间和两类促超排卵方案对成熟或未成熟卵细胞多原核孕卵生成的显著性影响，却发现女方年龄和穿刺卵泡数与成熟卵的多原核孕卵生成率呈显著性负相关。年轻妇女卵细胞生长力旺盛，其成熟卵在IVF-ET培养系统中发育较快，可能易至受精相对延迟。受精延迟被认为是多精子受精的原因之一[2，3]。较多的可穿刺卵泡数和发育成熟的OCCs，常常是个体对促排卵药物反应良好的表现。穿刺卵泡数增加，成熟卵多原核孕卵生成率下降，是否意味着对促排卵药物反应良好的个体，其成熟卵透明带结构较为完整，抗多精子受精能力较强，值得研究。
, 百拇医药
除考虑女方高龄对IVF-ET的不利影响[6，7]外，还应考虑较年轻妇女多倍体胚胎生成可能性增加。对不同个体选择合适的促超排卵剂量，提高其反应性，可能有助于减少多原核孕卵的生成率。
二、 精液高活动力精子和受精率与未成熟卵多原核孕卵生成
卵细胞抗多精子受精机理，包括卵细胞透明带下间隙皮质颗粒释放和透明带内表面致密化[1]。授精精子数量的增多可导致卵细胞皮质颗粒释放迟缓，招致较高频率的多精子受精[4]。未成熟卵多原核孕卵生成率与精液a+b 级精子密度存在显著性正相关，表明未成熟卵抗多精子受精机制易受高活力精子的干扰。不过，本资料并未发现经上游法处理的授精精子密度及活动率与多原核孕卵生成率的联系。精子上游主要改善活动率而非活动力，不能消除导致精液变化的精子内在因素，加之用于授精的各周期精子密度及活动率经调整差距较小，是上述结果的原因。对精液高活动力精子密度较高，卵细胞成熟较低者，需加强多原核孕卵的确认和剔除，对精液高活动力精子密度较低者，适度调高授精精子密度，增加多精子受精的风险不大。
, http://www.100md.com
精卵细胞受精融合是生成受精卵或孕卵的前提条件，受精过程中抗多精子受精机制障碍产生多原核孕卵。本研究结果显示，未成熟卵多原核孕卵生成率与其受精率呈显著性正相关，而与成熟卵的同项指标无显著相关性，提示未成熟卵的抗多精子受精的能力随其受精能力和机会的增加而削弱，成熟卵该两项机制相对独立，可能是它们透明带发育程度差异的反映。结合年龄、穿刺卵泡数、高活动力精子对两类卵多原核孕卵生成率影响的不同，推测成熟和未成熟卵的抗多精子受精机制可能存在差异。当然，最终的结论可能需要更大的样本数证实。
参考文献
1 Trounson A， Bongso A. Fertilization and development in humans. Cur Top Dev Bio, 1996, 32: 59-62.
2 Ho PC, Yeung WSB, Chan YF, et al. Factors affecting the incidence of polyploidy in a human in vitro fertilization program. Int Fertil, 1994, 39: 14-19.
, http://www.100md.com
3 Sengoku K, Ishikawa M, Tamate K, et al. Polynuclear fertilization in various stimulation protocols in in-vitro fertilization. Int Fertil, 1994, 39: 45-51.
4 Davis OK， Rosenwaks Z. In-vitro fertilization. In: Adashi EY, Rock JA, Rosenwaks Z, eds. Reproductive endocrinology, surgery and technology. Philadelphia: Lippincott, 1995. 2320-2333.
5 金帆, 石一复, 周馥贞, 等. 精子质量和数量对体外受精率、卵裂率和卵裂胚胎的影响. 中华妇产科杂志, 1998, 33: 28-30.
6 张丽珠， 魏克新， 刘平, 等. 体外受精-胚胎移植中影响临床妊娠的因素: 附559个周期分析. 中华妇产科杂志, 1998, 33: 727-730.
7 Yie SM, Collins JA, Daya S, et al. Polyploidy and fertilization in in-vitro fertilization are related to patient′s age and gamete quality. Hum Reprod, 1996, 11: 614-617.
(收稿：1998-12-22 修回：1999-08-10), 百拇医药