bcl-2反义基因调控用于人子宫颈癌体外治疗的研究
作者：糜若然 王慧 瞿全新 郑德先 岳天孚 赵钧铭
单位：糜若然(300052 天津医科大学总医院妇产科)；王慧(300052 天津医科大学总医院妇产科)；瞿全新(300052 天津医科大学总医院妇产科)；岳天孚(300052 天津医科大学总医院妇产科)；郑德先(中国医学科学院血液病学研究所)；赵钧铭(中国医学科学院血液病学研究所)
关键词：宫颈肿瘤；寡核苷酸类；反义；原致癌基因蛋白质类；转染；基因；bcl-2
中华妇产科杂志000212 摘 要：目的 探讨bcl-2反义脱氧寡核苷酸(ODN)及反义RNA对人宫颈癌体外治疗的效果。方法 应用反义技术进行人宫颈癌Hela细胞生长抑制及凋亡诱导。结果 Hela细胞中bcl-2 mRNA及蛋白均呈高表达。bcl-2反义ODN可有效抑制Hela细胞生长及降低其内源性bcl-2蛋白的表达，同时诱导其凋亡；bcl-2反义ODN 浓度为10 μmol/L时抑制效果最明显，抑制作用在转染后24 h效果最明显，持续至96 h后逐渐减弱，细胞凋亡程度与ODN用量呈区域性正相关；重组逆转录病毒载体(pDOR-AB)能有效将bcl-2反义RNA导入Hela细胞实现稳定整合，同时降低bcl-2 mRNA及蛋白表达，抑制Hela细胞生长并诱导其凋亡。结论 应用反义技术于体外治疗宫颈癌有一定效果，bcl-2基因作为优选靶向基因具有可行性，为进一步于体内治疗研究提供了理论基础和实验依据。
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The Inhibitory Effect of bcl-2 Antisense Oligodeoxynucleotide/RNA on the Growth of Cervical Carcinoma in vitro
MI Ruoran WANG Hui， QU Quanxin et al
(Department of Obstetrics and Gynecology, General Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China)
Abstract：Objective To study the therapeutic effect of bcl-2 antisense oligodeoxynucleotide(ODN)/RNA human cervical carcinoma in vitro. Methods To transfect bcl-2 antisense ODN/RNA into Hela cells with antisense technology and observe the growth and apoptotic modulation of Hela cells. Results The expression of bcl-2 protein and mRNA was higher in Hela cells； the bcl-2 specific antisense ODN significantly decreased bcl-2 protein expression and inhibit the growth of Hela cells. The strongest inhibitory effect was at 24 hours after transfection, the optimal concentration of antisense ODN was 10 μmol/L. The results indicated that the inhibitory effect of bcl-2 antisense ODN on cell growth and survival rate is dose dependent； the recombinant retroviral vector pDOR-AB can transfer antisense bcl-2 gene into the genome of Hela cells, bcl-2 protein and mRNA expressions were significantly decreased after transfected，it demonstrated bcl-2 antisense RNA can significantly inhibit the growth of Hela cells and induce their apoptosis. Conclusion The results demonstrate the feasibility of bcl-2 gene as a target for antisense gene therapy of human cervical carcinoma and provide the theoretical foundation and experimental evidence for further study in vivo.
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Key words：Cervix neoplsms; Oligonucleotides, antisense; Proto-oncogene proteins； Transfection; Genes, bcl-2▲
宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，发病机理涉及原癌基因活化及抑癌基因失活导致的细胞凋亡与细胞增殖过程失衡。在此基础上，从基因水平寻求新的有效治疗方法，成为目前宫颈癌研究的热点之一。近年来，用反义脱氧寡核苷酸(oligodeoxynucleotide，ODN)及反义RNA分子作为基因治疗试剂，已成为临床应用研究的主要发展方向。鉴于bcl-2基因与宫颈癌发生、发展关系密切，本研究应用反义技术，进行bcl-2反义ODN/RNA对Hela细胞系的体外抑制实验，以探讨bcl-2作为基因治疗宫颈癌的优选靶向基因的可行性。
材料与方法
一、材料及来源
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主要材料为人宫颈癌Hela细胞系(天津医科大学微生物教研室提供)；PA317包装细胞系及逆转录病毒载体 pDOR-neo (中国医学科学院血液病学研究所病理室及生化室提供)；转染剂脂质体Lipofe- ctamine及限制性内切酶BamHI、EcoRI(美国GIBCO公司提供)。bcl-2脱氧寡核苷酸(上海生物工程有限公司提供)，共3条链，即反义链(antisense ODN, AODN)、正义链(sense ODN, SODN)、无义链(nonsense ODN, NODN)，序列设计参考文献[1]。每条链两端由硫代磷酸修饰，经微机检索证明，与bcl-2以外的人类基因序列无同源性。含反义bcl-2 cDNA部分序列(622bp)的质粒重组逆转录病毒载体(pDOR-AB 7.12kb)，由第四军医大学王成济教授惠赠。
二、细胞培养
Hela细胞系及PA317包装细胞系常规培养于10%胎牛血清的RPMI-1640培养基(谷氨酰胺2 mmol/L，青、链霉素各100 μg/ml)中，置于37℃、5%二氧化碳饱和湿度培养箱内隔日传代。用AODN、SODN、NODN分别转染Hela细胞系，浓度为3 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L，转染后终止时间分别为12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h。
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三、质粒DNA制备、基因转染、细胞包装及阳性克隆筛选
1.质粒DNA制备：宿主菌JM109感受态细胞的制备及转化、质粒的小量提取和大量制备、质粒DNA纯化、限制性内酶酶切及鉴定，参照《分子克隆指南》(第2版)[2]。
2.基因转染、细胞包装及阳性克隆筛选：取纯化质粒pDOR-AB与pDOR-neo(作为空白对照)各6.0μg，经脂质体Lipofectamine包裹后分别转染PA317包装细胞系，3 d后加入G 418(800 μg/ml)筛选，14 d后获抗G 418阳性克隆，取病毒上清液浓缩后脂质体包裹转染Hela细胞，命名为H-pAB、H-p，未转染的Hela细胞命名为H。
四、转染前后细胞动力学与细胞存活率检测
Hela细胞接种于96孔板，实验组共分24组，每个实验组及对照组各设12个重复孔。其中6孔用台盼蓝染色计数活细胞，每组重复测定3次，取平均值绘制细胞动力学曲线；另6孔应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞存活率[波长570 nm时吸光度(A)值]。细胞存活率＝(实验孔A值/对照孔A值)×100%。
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五、转染前后bcl-2蛋白及mRNA检测
采用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联(alkaline phosphatase antialkaline phospatase，APAAP)免疫酶标法及地高辛标记bcl-2脱氧寡核苷酸探针进行细胞原位mRNA杂交。检测结果评定标准为：细胞浆内有玫瑰红色颗粒为阳性细胞，未着色细胞为阴性细胞。原位杂交结果评定标准为，细胞浆内有蓝色颗粒为阳性细胞，未着色细胞为阴性细胞。
六、流式细胞仪定量分析DNA及bcl-2蛋白
1.碘化丙锭(PI)单染色法：收获细胞5.0×106/ml；70%乙醇固定18h以上；经0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)清洗；PI染色30 min后进行检测。空白对照不加PI染色剂。
2.bcl-2蛋白定量检测：收获细胞5.0×106/ml；4%多聚甲醛(pH7.0)于室温固定30 min，PBS清洗；10%山羊血清封闭30 min；加入抗bcl-2单克隆抗体(1∶20)于室温孵育60 min；再经PBS清洗；加入第二抗体IgG∶异硫氰酸荧光黄(fluorescien isothiocyanate，FITC)(1∶50)，于室温孵育30 min；PBS清洗；细胞悬浮于0.01 mol/L PBS液中进行检测。对照设立同前。
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七、细胞凋亡的超微结构观察
将收获细胞经6%戊二醛磷酸缓冲液固定24h，1%S4O4固定24h，丙酮脱水，EPON-821包埋，超薄切片，经醋酸钠枸橼酸盐染色，于H 600透视电镜下观察。
八、统计学处理
本研究结果经SPSS统计软件分析，行方差分析、t检验及q检验。
结果
一、Hela细胞生长曲线
接种初始细胞数为1.0×104/ml，24h内生长缓慢，此后细胞生长速度倍增，3～4 d为增殖能力最强时期；至第6天，细胞数达到1.2×106/ml；之后继续培养，细胞生长曲线趋于平坦。
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二、bcl-2反义ODN对Hela细胞的抑制作用
bcl-2反义ODN可明显抑制Hela细胞生长，Hela细胞凋亡程度与ODN用量呈区域性正相关。bcl-2反义ODN为10 μmol/L，抑制Hela细胞作用在转染24h时效果最明显，抑制率为64.36%，持续至96h后逐渐减弱。原位杂交及APAAP免疫酶标结果，Hela细胞中bcl-2 mRNA及蛋白均呈高表达；bcl-2反义ODN为10 μmol/L，转染24h后bcl-2 mRNA表达与其他浓度比较，差异无显著性(P>0.05)，但bcl-2 蛋白表达明显低于其他浓度。空白对照组bcl-2蛋白表达率为91.58%，bcl-2反义ODN 作用后降至37.82%(P<0.05)(图1～4)。DNA含量(细胞周期)分析图可见明显细胞凋亡峰，涂片荧光显微镜下可见凋亡小体(图5，6)。电镜下可见典型的细胞凋亡形态(图7，8)。结果表明，bcl-2反义ODN能有效抑制Hela细胞生长及bcl-2蛋白表达，同时可诱导Hela细胞凋亡。
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图1 空白对昭组转染ODN(10mol/L，24h)后，Hela细胞中bcl-2蛋白表达.APAAP免疫酶标染色×200
图2 AODN转染ODN(10mol/L，24h)后，Hela细胞中bcl-2蛋白表达.APAAP免疫酶标染色×200
图3 NODN转达染ODN(10mol/L，24h)后，Hela细胞中bcl-2蛋白表达.APAAP免疫酶标染色×200
图4 SODN转染ODN(10mol/L，24h)后，Hela细胞中bcl-2蛋白表达.APAAP免疫酶标染色×200
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图5 AODN转达染前Hela细胞.PI×200
图6 AODN转染后，Hela细胞出现凋亡小体.PI×200
图7电镜观察Hela正常细胞.醋酸钠枸橼酸盐染色×8000
图8电镜观察凋亡后Hela细胞.醋酸钠枸橼酸盐染色×8000
三、bcl-2反义RNA对Hela细胞的抑制作用
1.重组质粒的酶切鉴定：含反义bcl-2 cDNA部分序列的质粒pDOR-AB，经EcoRⅠ、BamHⅠ酶切后电泳显示，与重组质粒预期结果一致(图9)。
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A: pBR 322/HinfⅠ B： pDOR-AB/EcoRⅠ,BamHⅠ
C： pDOR-AB D：λ DNA/HindⅢ
图9 pDOR-AB(7.12kb) 重组质粒的酶切鉴定
2.bcl-2反义RNA的抑制作用：本研究采用重组DNA技术获得含反义bcl-2的逆转录病毒载体，在体外转染包装细胞系，筛选出稳定高效的分泌重组逆转录病毒的细胞。重组逆转录病毒载体pDOR-AB能有效将bcl-2反义RNA导入Hela细胞实现稳定整合，同时封闭其内源bcl-2 mRNA及其蛋白表达。MTT比色法测定结果，H-pAB细胞存活率明显低于H-p及H细胞(P<0.05)，而且随培时间的延长，H-pAB细胞的存活率下降明显。H、H-p细胞存活率比较，无明显差异。(表1)。原位杂交显示，经bcl-2反义作用后的H-pAB细胞阳性着色率明显降低，染色强度减弱。APAAP染色可见H-pAB细胞较H-p及H细胞阳性率明显下降。流式细胞荧光计数定量bcl-2蛋白表达率，H细胞为91.32%，经bcl-2反义作用的H-pAB细胞bcl-2蛋白表达率下降为54.09%，两者间差异有极显著性(P<0.01)。DNA含量(细胞周期)可见明显细胞凋亡峰，涂片荧光显微镜下可见凋亡小体。电镜下可见大量凋亡细胞。结果表明，bcl-2反义RNA对Hela细胞生长与增殖有明显的抑制作用并可诱导其凋亡。
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表1 不同培养时间H、H-p、H-pAB细胞的
存活率(%，
±s) 培养
时间
(d)
实
验
孔
H
H-p
H-pAB
F值
1
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6
90.69±1.72
90.43±1.22
82.56±2.27*▲
40.10
2
6
94.74±1.39
90.82±2.62*△
69.36±3.48*▲
160.87
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3
6
97.16±0.78
91.44±1.74*△
63.39±2.62*▲
559.53
4
6
98.10±2.00
92.12±2.23*△
51.00±3.09*▲
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639.79
5
6
100.35±2.72
96.74±3.78
44.80±2.24*▲
651.39
6
6
99.14±0.79
99.18±2.22
35.42±2.50*▲
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2 065.37
注：*与H细胞比较，▲与H-p细胞比较，△与H-pAB细胞比较，P均<0.01。培养1～6 d，H-pAB细胞与H、H-p细胞比较， P<0.01；H-p细胞与H细胞比较，P>0.05
讨论
基因异常改变是肿瘤细胞恶性表型及生物学行为的基础，肿瘤基因治疗正是对这些异常基因进行有效的封闭及修饰，以纠正或逆转其恶性表型[3]。反义技术已被公认为是目前最具潜力和前途的基因治疗手段。
一、bcl-2反义ODN对Hela细胞的抑制作用
反义ODN主要通过抑制蛋白质的翻译过程而发挥作用。bcl-2为细胞存活基因，其高表达能增加细胞对大量化疗药物和射线的抵抗性，这使bcl-2极可能成为反义治疗的靶向基因[4-6]。1990年，Reed[7，8]首次应用bcl-2反义ODN有效抑制了白血病细胞的生长，为以后利用反义bcl-2基因体外及体内治疗多种肿瘤提供了可行性。Webb等[9]已将反义bcl-2基因应用于临床并取得疗效。本研究结果显示，bcl-2反义ODN可诱导Hela细胞凋亡，且具有浓度和时间依赖性。其可能机理是寡核苷酸链转入细胞与靶mRNA特异结合，影响bcl-2蛋白合成，作用持续24～48h后，ODN不断代谢失活，对癌细胞的抑制作用逐渐减弱到消失。免疫酶标及流式细胞仪定量分析也证实了Hela细胞大量凋亡，同时bcl-2蛋白表达率由91.58%下降至37.82%；而原位杂交结果则发现，bcl-2反义ODN作用后对Hela细胞bcl-2 mRNA影响不大，说明ODN发生效应的环节主要在翻译过程。
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二、bcl-2反义RNA对Hela细胞的抑制作用
本研究观察到，治疗后的Hela细胞内源性bcl-2 mRNA与蛋白表达均下降，说明进入细胞内的bcl-2反义RNA稳定整合后具有封闭原有bcl-2基因表达的作用，调控主要发生在细胞核内。与反义ODN表达的瞬时性相比，反义RNA的作用是持久的。pDOR-AB缺失反式效应序列，需经PA317细胞株包装后才能分泌完整的病毒颗粒。该构建质粒的选择标记为NeoR (新霉素磷酸转移酶Ⅱ)，对氨基糖甙类抗生素G418具有抗性，故本研究选用 G418(800 μg/ml)进行筛选。
总之，反义ODN和反义RNA的作用机理有本质的不同。ODN特异性高，毒性小，已在临床试验中取得重大突破。而反义RNA技术，因其操作要求高，转染效率低及安全性等问题，进入人体试验尚需慎重。本研究应用反义技术对Hela细胞系进行了bcl-2反义ODN和反义RNA的体外抑制实验，发现两种途径均可诱导癌细胞凋亡而达到治疗目的，确立了bcl-2成为反义基因治疗宫颈癌优选靶向的可行性，为进行体内治疗研究，提供了理论基础和实验依据。
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参考文献：
[1]Weber-Nordt RM, Henschler R, Schott E, et al. Interleukin-10 increases bcl-2 expression and survival in primary human CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood, 1996, 88: 2549-2558.
[2]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, 主编. 分子克隆实验指南. 金冬雁， 黎孟枫，译. 第2版. 北京： 科学出版社, 1995. 16-65, 237-298.
[3]Dalgleish AG. Why: gene therapy? Gene Therapy, 1997, 4: 629-630.
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[4]Abastado JP. Apoptosis: function and regulation of cell death. Res Immunol, 1996, 147: 443-456.
[5]White E. Life, death and the pursuit of apoptosis. Genes Dev, 1996, 10: 1-15.
[6]Park JR, Hockenbery DM. Bcl-2, a novel regulator of apoptosis. J Cellular Biochemistry, 1996, 60: 12-17.
[7]Reed JC. Regulation of apoptosis by bcl-2 family protein and its role in cancer and chemoresistance. Curr Opin Oncol, 1995, 7: 541-546.
[8]Reed JC. Promise and problems of bcl-2 antisense therapy. J Natl Cancer Inst, 1997, 89: 988-990.
[9]Webb A, Cunningham D, Cotter F, et al. Bcl-2 antisense therapy in patients with non-nodgkin lymphoma. Lancet, 1997, 349: 1137-1141.
收稿日期：1999-01-07, 百拇医药
单位：糜若然(300052 天津医科大学总医院妇产科)；王慧(300052 天津医科大学总医院妇产科)；瞿全新(300052 天津医科大学总医院妇产科)；岳天孚(300052 天津医科大学总医院妇产科)；郑德先(中国医学科学院血液病学研究所)；赵钧铭(中国医学科学院血液病学研究所)
关键词：宫颈肿瘤；寡核苷酸类；反义；原致癌基因蛋白质类；转染；基因；bcl-2
中华妇产科杂志000212 摘 要：目的 探讨bcl-2反义脱氧寡核苷酸(ODN)及反义RNA对人宫颈癌体外治疗的效果。方法 应用反义技术进行人宫颈癌Hela细胞生长抑制及凋亡诱导。结果 Hela细胞中bcl-2 mRNA及蛋白均呈高表达。bcl-2反义ODN可有效抑制Hela细胞生长及降低其内源性bcl-2蛋白的表达，同时诱导其凋亡；bcl-2反义ODN 浓度为10 μmol/L时抑制效果最明显，抑制作用在转染后24 h效果最明显，持续至96 h后逐渐减弱，细胞凋亡程度与ODN用量呈区域性正相关；重组逆转录病毒载体(pDOR-AB)能有效将bcl-2反义RNA导入Hela细胞实现稳定整合，同时降低bcl-2 mRNA及蛋白表达，抑制Hela细胞生长并诱导其凋亡。结论 应用反义技术于体外治疗宫颈癌有一定效果，bcl-2基因作为优选靶向基因具有可行性，为进一步于体内治疗研究提供了理论基础和实验依据。
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The Inhibitory Effect of bcl-2 Antisense Oligodeoxynucleotide/RNA on the Growth of Cervical Carcinoma in vitro
MI Ruoran WANG Hui， QU Quanxin et al
(Department of Obstetrics and Gynecology, General Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China)
Abstract：Objective To study the therapeutic effect of bcl-2 antisense oligodeoxynucleotide(ODN)/RNA human cervical carcinoma in vitro. Methods To transfect bcl-2 antisense ODN/RNA into Hela cells with antisense technology and observe the growth and apoptotic modulation of Hela cells. Results The expression of bcl-2 protein and mRNA was higher in Hela cells； the bcl-2 specific antisense ODN significantly decreased bcl-2 protein expression and inhibit the growth of Hela cells. The strongest inhibitory effect was at 24 hours after transfection, the optimal concentration of antisense ODN was 10 μmol/L. The results indicated that the inhibitory effect of bcl-2 antisense ODN on cell growth and survival rate is dose dependent； the recombinant retroviral vector pDOR-AB can transfer antisense bcl-2 gene into the genome of Hela cells, bcl-2 protein and mRNA expressions were significantly decreased after transfected，it demonstrated bcl-2 antisense RNA can significantly inhibit the growth of Hela cells and induce their apoptosis. Conclusion The results demonstrate the feasibility of bcl-2 gene as a target for antisense gene therapy of human cervical carcinoma and provide the theoretical foundation and experimental evidence for further study in vivo.
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Key words：Cervix neoplsms; Oligonucleotides, antisense; Proto-oncogene proteins； Transfection; Genes, bcl-2▲
宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，发病机理涉及原癌基因活化及抑癌基因失活导致的细胞凋亡与细胞增殖过程失衡。在此基础上，从基因水平寻求新的有效治疗方法，成为目前宫颈癌研究的热点之一。近年来，用反义脱氧寡核苷酸(oligodeoxynucleotide，ODN)及反义RNA分子作为基因治疗试剂，已成为临床应用研究的主要发展方向。鉴于bcl-2基因与宫颈癌发生、发展关系密切，本研究应用反义技术，进行bcl-2反义ODN/RNA对Hela细胞系的体外抑制实验，以探讨bcl-2作为基因治疗宫颈癌的优选靶向基因的可行性。
材料与方法
一、材料及来源
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主要材料为人宫颈癌Hela细胞系(天津医科大学微生物教研室提供)；PA317包装细胞系及逆转录病毒载体 pDOR-neo (中国医学科学院血液病学研究所病理室及生化室提供)；转染剂脂质体Lipofe- ctamine及限制性内切酶BamHI、EcoRI(美国GIBCO公司提供)。bcl-2脱氧寡核苷酸(上海生物工程有限公司提供)，共3条链，即反义链(antisense ODN, AODN)、正义链(sense ODN, SODN)、无义链(nonsense ODN, NODN)，序列设计参考文献[1]。每条链两端由硫代磷酸修饰，经微机检索证明，与bcl-2以外的人类基因序列无同源性。含反义bcl-2 cDNA部分序列(622bp)的质粒重组逆转录病毒载体(pDOR-AB 7.12kb)，由第四军医大学王成济教授惠赠。
二、细胞培养
Hela细胞系及PA317包装细胞系常规培养于10%胎牛血清的RPMI-1640培养基(谷氨酰胺2 mmol/L，青、链霉素各100 μg/ml)中，置于37℃、5%二氧化碳饱和湿度培养箱内隔日传代。用AODN、SODN、NODN分别转染Hela细胞系，浓度为3 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L，转染后终止时间分别为12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h。
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三、质粒DNA制备、基因转染、细胞包装及阳性克隆筛选
1.质粒DNA制备：宿主菌JM109感受态细胞的制备及转化、质粒的小量提取和大量制备、质粒DNA纯化、限制性内酶酶切及鉴定，参照《分子克隆指南》(第2版)[2]。
2.基因转染、细胞包装及阳性克隆筛选：取纯化质粒pDOR-AB与pDOR-neo(作为空白对照)各6.0μg，经脂质体Lipofectamine包裹后分别转染PA317包装细胞系，3 d后加入G 418(800 μg/ml)筛选，14 d后获抗G 418阳性克隆，取病毒上清液浓缩后脂质体包裹转染Hela细胞，命名为H-pAB、H-p，未转染的Hela细胞命名为H。
四、转染前后细胞动力学与细胞存活率检测
Hela细胞接种于96孔板，实验组共分24组，每个实验组及对照组各设12个重复孔。其中6孔用台盼蓝染色计数活细胞，每组重复测定3次，取平均值绘制细胞动力学曲线；另6孔应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞存活率[波长570 nm时吸光度(A)值]。细胞存活率＝(实验孔A值/对照孔A值)×100%。
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五、转染前后bcl-2蛋白及mRNA检测
采用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联(alkaline phosphatase antialkaline phospatase，APAAP)免疫酶标法及地高辛标记bcl-2脱氧寡核苷酸探针进行细胞原位mRNA杂交。检测结果评定标准为：细胞浆内有玫瑰红色颗粒为阳性细胞，未着色细胞为阴性细胞。原位杂交结果评定标准为，细胞浆内有蓝色颗粒为阳性细胞，未着色细胞为阴性细胞。
六、流式细胞仪定量分析DNA及bcl-2蛋白
1.碘化丙锭(PI)单染色法：收获细胞5.0×106/ml；70%乙醇固定18h以上；经0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)清洗；PI染色30 min后进行检测。空白对照不加PI染色剂。
2.bcl-2蛋白定量检测：收获细胞5.0×106/ml；4%多聚甲醛(pH7.0)于室温固定30 min，PBS清洗；10%山羊血清封闭30 min；加入抗bcl-2单克隆抗体(1∶20)于室温孵育60 min；再经PBS清洗；加入第二抗体IgG∶异硫氰酸荧光黄(fluorescien isothiocyanate，FITC)(1∶50)，于室温孵育30 min；PBS清洗；细胞悬浮于0.01 mol/L PBS液中进行检测。对照设立同前。
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七、细胞凋亡的超微结构观察
将收获细胞经6%戊二醛磷酸缓冲液固定24h，1%S4O4固定24h，丙酮脱水，EPON-821包埋，超薄切片，经醋酸钠枸橼酸盐染色，于H 600透视电镜下观察。
八、统计学处理
本研究结果经SPSS统计软件分析，行方差分析、t检验及q检验。
结果
一、Hela细胞生长曲线
接种初始细胞数为1.0×104/ml，24h内生长缓慢，此后细胞生长速度倍增，3～4 d为增殖能力最强时期；至第6天，细胞数达到1.2×106/ml；之后继续培养，细胞生长曲线趋于平坦。
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二、bcl-2反义ODN对Hela细胞的抑制作用
bcl-2反义ODN可明显抑制Hela细胞生长，Hela细胞凋亡程度与ODN用量呈区域性正相关。bcl-2反义ODN为10 μmol/L，抑制Hela细胞作用在转染24h时效果最明显，抑制率为64.36%，持续至96h后逐渐减弱。原位杂交及APAAP免疫酶标结果，Hela细胞中bcl-2 mRNA及蛋白均呈高表达；bcl-2反义ODN为10 μmol/L，转染24h后bcl-2 mRNA表达与其他浓度比较，差异无显著性(P>0.05)，但bcl-2 蛋白表达明显低于其他浓度。空白对照组bcl-2蛋白表达率为91.58%，bcl-2反义ODN 作用后降至37.82%(P<0.05)(图1～4)。DNA含量(细胞周期)分析图可见明显细胞凋亡峰，涂片荧光显微镜下可见凋亡小体(图5，6)。电镜下可见典型的细胞凋亡形态(图7，8)。结果表明，bcl-2反义ODN能有效抑制Hela细胞生长及bcl-2蛋白表达，同时可诱导Hela细胞凋亡。
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图1 空白对昭组转染ODN(10mol/L，24h)后，Hela细胞中bcl-2蛋白表达.APAAP免疫酶标染色×200
图2 AODN转染ODN(10mol/L，24h)后，Hela细胞中bcl-2蛋白表达.APAAP免疫酶标染色×200
图3 NODN转达染ODN(10mol/L，24h)后，Hela细胞中bcl-2蛋白表达.APAAP免疫酶标染色×200
图4 SODN转染ODN(10mol/L，24h)后，Hela细胞中bcl-2蛋白表达.APAAP免疫酶标染色×200
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图5 AODN转达染前Hela细胞.PI×200
图6 AODN转染后，Hela细胞出现凋亡小体.PI×200
图7电镜观察Hela正常细胞.醋酸钠枸橼酸盐染色×8000
图8电镜观察凋亡后Hela细胞.醋酸钠枸橼酸盐染色×8000
三、bcl-2反义RNA对Hela细胞的抑制作用
1.重组质粒的酶切鉴定：含反义bcl-2 cDNA部分序列的质粒pDOR-AB，经EcoRⅠ、BamHⅠ酶切后电泳显示，与重组质粒预期结果一致(图9)。
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A: pBR 322/HinfⅠ B： pDOR-AB/EcoRⅠ,BamHⅠ
C： pDOR-AB D：λ DNA/HindⅢ
图9 pDOR-AB(7.12kb) 重组质粒的酶切鉴定
2.bcl-2反义RNA的抑制作用：本研究采用重组DNA技术获得含反义bcl-2的逆转录病毒载体，在体外转染包装细胞系，筛选出稳定高效的分泌重组逆转录病毒的细胞。重组逆转录病毒载体pDOR-AB能有效将bcl-2反义RNA导入Hela细胞实现稳定整合，同时封闭其内源bcl-2 mRNA及其蛋白表达。MTT比色法测定结果，H-pAB细胞存活率明显低于H-p及H细胞(P<0.05)，而且随培时间的延长，H-pAB细胞的存活率下降明显。H、H-p细胞存活率比较，无明显差异。(表1)。原位杂交显示，经bcl-2反义作用后的H-pAB细胞阳性着色率明显降低，染色强度减弱。APAAP染色可见H-pAB细胞较H-p及H细胞阳性率明显下降。流式细胞荧光计数定量bcl-2蛋白表达率，H细胞为91.32%，经bcl-2反义作用的H-pAB细胞bcl-2蛋白表达率下降为54.09%，两者间差异有极显著性(P<0.01)。DNA含量(细胞周期)可见明显细胞凋亡峰，涂片荧光显微镜下可见凋亡小体。电镜下可见大量凋亡细胞。结果表明，bcl-2反义RNA对Hela细胞生长与增殖有明显的抑制作用并可诱导其凋亡。
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表1 不同培养时间H、H-p、H-pAB细胞的
存活率(%，
±s) 培养时间
(d)
实
验
孔
H
H-p
H-pAB
F值
1
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6
90.69±1.72
90.43±1.22
82.56±2.27*▲
40.10
2
6
94.74±1.39
90.82±2.62*△
69.36±3.48*▲
160.87
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3
6
97.16±0.78
91.44±1.74*△
63.39±2.62*▲
559.53
4
6
98.10±2.00
92.12±2.23*△
51.00±3.09*▲
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639.79
5
6
100.35±2.72
96.74±3.78
44.80±2.24*▲
651.39
6
6
99.14±0.79
99.18±2.22
35.42±2.50*▲
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2 065.37
注：*与H细胞比较，▲与H-p细胞比较，△与H-pAB细胞比较，P均<0.01。培养1～6 d，H-pAB细胞与H、H-p细胞比较， P<0.01；H-p细胞与H细胞比较，P>0.05
讨论
基因异常改变是肿瘤细胞恶性表型及生物学行为的基础，肿瘤基因治疗正是对这些异常基因进行有效的封闭及修饰，以纠正或逆转其恶性表型[3]。反义技术已被公认为是目前最具潜力和前途的基因治疗手段。
一、bcl-2反义ODN对Hela细胞的抑制作用
反义ODN主要通过抑制蛋白质的翻译过程而发挥作用。bcl-2为细胞存活基因，其高表达能增加细胞对大量化疗药物和射线的抵抗性，这使bcl-2极可能成为反义治疗的靶向基因[4-6]。1990年，Reed[7，8]首次应用bcl-2反义ODN有效抑制了白血病细胞的生长，为以后利用反义bcl-2基因体外及体内治疗多种肿瘤提供了可行性。Webb等[9]已将反义bcl-2基因应用于临床并取得疗效。本研究结果显示，bcl-2反义ODN可诱导Hela细胞凋亡，且具有浓度和时间依赖性。其可能机理是寡核苷酸链转入细胞与靶mRNA特异结合，影响bcl-2蛋白合成，作用持续24～48h后，ODN不断代谢失活，对癌细胞的抑制作用逐渐减弱到消失。免疫酶标及流式细胞仪定量分析也证实了Hela细胞大量凋亡，同时bcl-2蛋白表达率由91.58%下降至37.82%；而原位杂交结果则发现，bcl-2反义ODN作用后对Hela细胞bcl-2 mRNA影响不大，说明ODN发生效应的环节主要在翻译过程。
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二、bcl-2反义RNA对Hela细胞的抑制作用
本研究观察到，治疗后的Hela细胞内源性bcl-2 mRNA与蛋白表达均下降，说明进入细胞内的bcl-2反义RNA稳定整合后具有封闭原有bcl-2基因表达的作用，调控主要发生在细胞核内。与反义ODN表达的瞬时性相比，反义RNA的作用是持久的。pDOR-AB缺失反式效应序列，需经PA317细胞株包装后才能分泌完整的病毒颗粒。该构建质粒的选择标记为NeoR (新霉素磷酸转移酶Ⅱ)，对氨基糖甙类抗生素G418具有抗性，故本研究选用 G418(800 μg/ml)进行筛选。
总之，反义ODN和反义RNA的作用机理有本质的不同。ODN特异性高，毒性小，已在临床试验中取得重大突破。而反义RNA技术，因其操作要求高，转染效率低及安全性等问题，进入人体试验尚需慎重。本研究应用反义技术对Hela细胞系进行了bcl-2反义ODN和反义RNA的体外抑制实验，发现两种途径均可诱导癌细胞凋亡而达到治疗目的，确立了bcl-2成为反义基因治疗宫颈癌优选靶向的可行性，为进行体内治疗研究，提供了理论基础和实验依据。
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参考文献：
[1]Weber-Nordt RM, Henschler R, Schott E, et al. Interleukin-10 increases bcl-2 expression and survival in primary human CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood, 1996, 88: 2549-2558.
[2]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, 主编. 分子克隆实验指南. 金冬雁， 黎孟枫，译. 第2版. 北京： 科学出版社, 1995. 16-65, 237-298.
[3]Dalgleish AG. Why: gene therapy? Gene Therapy, 1997, 4: 629-630.
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[4]Abastado JP. Apoptosis: function and regulation of cell death. Res Immunol, 1996, 147: 443-456.
[5]White E. Life, death and the pursuit of apoptosis. Genes Dev, 1996, 10: 1-15.
[6]Park JR, Hockenbery DM. Bcl-2, a novel regulator of apoptosis. J Cellular Biochemistry, 1996, 60: 12-17.
[7]Reed JC. Regulation of apoptosis by bcl-2 family protein and its role in cancer and chemoresistance. Curr Opin Oncol, 1995, 7: 541-546.
[8]Reed JC. Promise and problems of bcl-2 antisense therapy. J Natl Cancer Inst, 1997, 89: 988-990.
[9]Webb A, Cunningham D, Cotter F, et al. Bcl-2 antisense therapy in patients with non-nodgkin lymphoma. Lancet, 1997, 349: 1137-1141.
收稿日期：1999-01-07, 百拇医药