外源性Rb基因对卵巢癌细胞株生长的抑制作用
作者：李叶 张毅 李红霞 唐蔚清 闫春华 黎健
单位：李叶(100730 卫生部北京医院妇产科)；张毅(100730 卫生部北京医院妇产科)；闫春华(100730 卫生部北京医院妇产科)；李红霞(卫生部老年医学研究所)；唐蔚青(卫生部老年医学研究所)；黎健(卫生部老年医学研究所)
关键词：卵巢肿癌；基因；视网膜母细胞瘤；细胞系
中华妇产科杂志000210
摘 要：目的 探讨外源性 Rb基因对卵巢癌细胞生长的抑制作用，为卵巢癌的基因治疗提供实验依据。方法 通过腺病毒介导的 Rb基因，于体外转染卵巢癌细胞株CAOV3。应用免疫组织化学、DNA琼脂糖电泳等方法，检测外源性 Rb基因的导入及其表达。通过四甲基偶氮唑蓝比色法及流式细胞术等，观察转染 Rb基因的CAOV3细胞的生长情况。结果 重组腺病毒载体可有效于体外转染卵巢癌细胞株CAOV3；转染外源性Rb基因后， CAOV3细胞内可检测到Rb基因及其蛋白表达；CAOV3细胞生长受到抑制，约68%的细胞生长停滞于G0期及G1期。结论 外源性Rb基因可通过腺病毒载体有效转染卵巢癌细胞株CAOV3，抑制CAOV3细胞的生长。
, 百拇医药
Inhibition of Recombinant Rb Gene Adenovirus Vector on the Growth of Ovarian Cancer Cell Line
LI Ye ZHANG Yi LI Hongxia et al
(Department of Obstetrics and Gynecology, Beijing Hospital, Ministry of Public Health Beijing 100730, China)
Abstract：Objective To test and study the effect of inhibition on the growth of ovarian cancer cell line CAOV3 transfected by the recombinant Rb gene adenovirus vector. Methods The recombinant Rb gene and the LacZ gene in adenovirus vector were constructed and transfected into the CAOV3 cell line separately. The Rb gene expression was detected by immunohistochemical assay and agarose gel electrophoresis,etc. The inhibition on the growth of CAOV3 was tested by flow cytometry and methyl thiazolyl tetrazolium assay, etc. Results The constructed recombinant Rb gene adenovirus vector could infect cells with high level expression of Rb protein, and Rb cDNA could be found in the transfected cells. The proliferation of transfected CAOV3 cells was inhibited evidently. Sixty-eight per cent of cells were arrested at G0、G1 phases of cell cycle. Conclusions The recombinant Rb gene adenovirus vector could transform CAOV3 cells efficiently and inhibit CAOV3 cell growth. It might be a new approach of gene therapy for ovarian cancer.
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Key words；Ovarian neoplasms; Genes, retinoblastoma; Cell line▲
外源性 Rb基因是与肿瘤发病相关的抑癌基因之一。许多肿瘤存在 Rb基因的缺失及失活。目前，国外已在不同癌细胞中进行了Rb基因的检测[1-4]，但尚未见Rb基因对卵巢癌细胞株作用的报道。本研究通过 Rb基因体外转染卵巢癌细胞株CAOV3，进行病毒转染及细胞生长的检测，以证实外源性 Rb基因对卵巢癌细胞生长的抑制作用。
材料与方法
一、 Rb基因重组腺病毒载体的构建
构建Rb cDNA片段的生长缺陷型重组腺病毒载体。即将含有Rb cDNA 的片段插入腺病毒质粒载体pXCJL-1的 BamH 1位点，转入人胚肾细胞株，筛选扩增阳性克隆，收集纯化并测定病毒滴度。以同样方法构建LacZ基因重组腺病毒载体，作为对照。
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二、卵巢癌细胞株CAOV3的培养
将卵巢癌细胞株CAOV3(美国肿瘤研究所提供)置于含15%胎牛血清的L15培养基，于37℃，5%二氧化碳条件下培养。
三、外源性Rb基因体外转染及表达的检测
1. LacZ基因表达的检测：将细胞株CAOV3接种到有盖玻片(2 cm×2 cm)的6孔培养板中，24 h后换液(细胞达80%汇合)，加入含LacZ基因的病毒，继续培养 48 h，以x-gal染色LacZ基因表达的β半乳糖(β-gal)，从而检测腺病毒作为基因载体的转染率。
2.细胞株CAOV3内Rb蛋白的检测：将细胞株CAOV3接种到6孔培养板中，加入不同滴度含Rb基因的病毒，培养48 h，采用免疫组织化学法检测 Rb蛋白(抗Rb单克隆抗体由美国Triton Bioscience公司提供)。苏木素染色，细胞核呈棕色为 Rb蛋白阳性表达，光镜下摄片(×400倍)。
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3.外源性Rb cDNA的检测：(1)细胞DNA的提取：收集已转染及未转染Rb基因的CAOV3细胞，常规破膜，加入提取液， 50℃消化过夜，用酚、氯仿、异戊醇(比例为25∶24∶1)抽提DNA，乙醇沉淀，三羟甲基氨基甲烷-乙酸缓冲液溶解DNA。(2)聚合酶链反应(PCR)扩增Rb cDNA：采用特异Rb cDNA第7个外显子核苷酸序列引物，经94℃ 1 min，50℃ 30 s，72℃ 1 min, 共30个循环。反应体积为30 μl。(3)琼脂糖电泳：取10 μg PCR产物，经1.4%的琼脂糖电泳，行溴乙锭染色分析。
四、外源性 Rb基因作用下CAOV3细胞生长的检测
1.细胞生长曲线：CAOV3细胞接种于24孔培养板中， 24 h后换培养液，加入含Rb基因的病毒继续培养。分别于24、 48、 96 h，经0.5%萘酚蓝黑染色，于波长570 nm测定吸光度(A)值，计算每样本 6孔的平均值[5]。对照组包括不加含Rb基因病毒者及加腺病毒β-gal者。
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2.四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测：CAOV3细胞接种于96孔培养板中，接种 24 h后加入含 Rb基因的病毒，继续培养72 h。未转染病毒及转染LacZ基因病毒者为对照组。应用MTT试剂盒(德国Boehringer公司产品)，按说明书操作，于波长570 nm检测A值。
3.流式细胞仪分析细胞生长周期：收集Rb基因、LacZ基因转染72 h的细胞及未转染病毒的细胞，以70%乙醇固定后加入1 ml 磷酸缓冲液(PBS)及RNA 酶(10 mg/ml)5 μl，37℃下水浴30 min，4℃下经碘化乙丙锭避光染色30 min。采用流式细胞仪检测细胞生长周期。
结果
一、重组腺病毒载体对CAOV3细胞的转染及外源性 Rb基因的表达
1.转染率： LacZ基因重组腺病毒载体转染CAOV3细胞后 24 h，经β-gal染色，90%为阳性，表明重组腺病毒载体可以有效转染CAOV3细胞。含 Rb基因的腺病毒体外转染CAOV3细胞48 h，80%细胞中有Rb蛋白表达，而未转染腺病毒的CAOV3细胞中无 Rb蛋白的表达。见图1。
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图1 转染CAOV3细胞内Rb蛋白的表达.β-gal染色×400
2. Rb cDNA检测：转染Rb基因的CAOV3细胞提取的DNA，经 PCR扩增，琼脂糖电泳检测出Rb cDNA条带，与含Rb cDNA质粒电泳条带位置一致，见图2。而对照组CAOV3细胞中未检测出Rb cDNA条带。
1： PBR322/MspI相对分子质量标准 2： Rb cDNA 质粒
3： PCR扩增转染Rb基因细胞DNA 的产物
4： PCR扩增未转染Rb基因细胞DNA的产物
图2 转染Rb基因后细胞内PCR扩增Rb cDNA产物的表达
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二、CAOV3细胞生长情况的检测
1.细胞生长：A值检测结果显示，外源性Rb基因可抑制CAOV3细胞生长。而未转染Rb基因的对照组，CAOV3细胞数目呈增长趋势。 见图3。
图3 外源性Rb基因作用下的细胞生长曲线
2.不同滴度的Rb基因重组腺病毒载体对CAOV3细胞生长的影响：CAOV3细胞转染不同滴度的 Rb基因重组腺病毒载体后，MTT比色法检测结果显示，随转染滴度的增高， A值逐渐降低。即Rb基因可以抑制CAOV3细胞生长，且随转染滴度的增高，抑制作用也增强。见图4。
图4 不同滴度Rb基因作用下的细胞生长曲线
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3.CAOV3细胞生长周期及生长状态的检测：流式细胞仪分析，经Rb基因转染的CAOV3细胞，出现生长停滞现象，68%的细胞生长停滞于G0期及G1期。同时可见M期及S期细胞明显减少，23%的细胞出现细胞体积缩小及DNA染色降低。
讨论 一、 Rb基因的特征
Rb基因是目前最常检测的抑癌基因。其染色体DNA长约100 kb，编码蛋白为P110。在细胞核中含有 Rb蛋白，它与许多重要转录调控因子结合，调控细胞生长。Rb基因的缺失或失活是肿瘤发生的重要机理之一。选择合适的载体、安全有效的转染方式和保证外源性基因的有效表达，是基因治疗的关键。本研究证实，腺病毒载体能有效的将外源性 Rb基因导入卵巢癌CAOV3细胞中，并高效表达 Rb蛋白。
二、 Rb基因对癌细胞生长的抑制作用
, http://www.100md.com Rb基因的产物—— Rb蛋白存在于整个细胞周期中，但只有非磷酸化状态的 Rb蛋白才有抑制细胞增殖的活性。在G0、G1早期及 M期， Rb蛋白呈非磷酸化状态。正常细胞中，Rb基因仅需维持较低水平的表达，而一旦细胞受到损伤或发生癌变，则 Rb蛋白的表达迅速增加，以发挥其调节细胞生长的功能，即抑制细胞增殖，诱导细胞衰老[6，7]。肿瘤细胞中Rb基因缺失或失活，则出现细胞增生异常。本研究中，细胞生长及MTT比色法检测显示，外源性Rb基因转染CAOV3细胞，对CAOV3细胞生长有抑制作用；流式细胞分析细胞生长周期显示，转染Rb基因的CAOV3细胞生长状态的改变，即多数细胞停滞于有丝分裂前期；同时，外源性 Rb基因可进一步引起部分CAOV3细胞衰老。从而揭示了癌细胞生长数目减少及最终死亡的机理，证实了外源性 Rb基因对肿瘤细胞异常增生的抑制作用。如果抑癌基因的失活是肿瘤的发病机理，通过正常抑癌基因对失活基因进行基因替换及基因修复，无疑是治疗肿瘤的新途径，且不存在传统治疗杀伤正常细胞及细胞毒性等副作用。 Rb基因如何进行DNA修复，如何协同免疫系统促使恶变细胞正常转归等问题，需进一步探讨[7]。
, 百拇医药
有效的目的基因，安全的转染方式是肿瘤基因治疗的研究热点。腺病毒载体介导下，外源性 Rb基因可有效的转染卵巢癌细胞。 Rb基因作为抑癌基因之一，因具有调控细胞生长，抑制癌细胞进入增殖期的功能，故为今后临床治疗卵巢癌提供了新的实验依据。
参考文献：
[1]Sasano H, Cornerford H, Silverberg SD, et al. Analysis of abnormalities of retinoblastoma gene in human ovarian and endometrial carcinoma. Cancer, 1990,66:2150-2153.
[2]Li SF, Shioawa T, Nakayama K, et al. Stepwise abnormality of sex steroid hormone receptors, tumor suppressor gene products (p53 and Rb), and cyclin E in uterine endometrioid carcinoma. Cancer, 1996,77:321-324.
, http://www.100md.com
[3]Tallor RR, Ilona L, Joseph G, et al. Abnormal expression of the retinoblastoma gene in ovarian neoplasma and correlation to p53 and K-ras mutation. Gynecol Oncol, 1995,58:307-311.
[4]Yaginuma Y,Hideto K,Kitirou K, et al. Analysis of retinoblastoma gene in human endometrial carcinoma. Obstet Gynecol, 1996,87:755-758.
[5]翁进，朱雪静，林勇，等. 苷糖酯对血小板与内皮细胞功能的影响. 中国医学科学院学报，1997，19：414-417.
[6]沈羽非，方福德. 真核基因表达调控. 第2版. 北京：高等教育出版社，1996. 145-146，164-165.
[7]成军，黄海长. 程序性细胞死亡与疾病. 第2版. 北京：北京医科大学协和医科大学联合出版社，1997. 75-79.
收稿日期：1999-04-05, 百拇医药
单位：李叶(100730 卫生部北京医院妇产科)；张毅(100730 卫生部北京医院妇产科)；闫春华(100730 卫生部北京医院妇产科)；李红霞(卫生部老年医学研究所)；唐蔚青(卫生部老年医学研究所)；黎健(卫生部老年医学研究所)
关键词：卵巢肿癌；基因；视网膜母细胞瘤；细胞系
中华妇产科杂志000210
摘 要：目的 探讨外源性 Rb基因对卵巢癌细胞生长的抑制作用，为卵巢癌的基因治疗提供实验依据。方法 通过腺病毒介导的 Rb基因，于体外转染卵巢癌细胞株CAOV3。应用免疫组织化学、DNA琼脂糖电泳等方法，检测外源性 Rb基因的导入及其表达。通过四甲基偶氮唑蓝比色法及流式细胞术等，观察转染 Rb基因的CAOV3细胞的生长情况。结果 重组腺病毒载体可有效于体外转染卵巢癌细胞株CAOV3；转染外源性Rb基因后， CAOV3细胞内可检测到Rb基因及其蛋白表达；CAOV3细胞生长受到抑制，约68%的细胞生长停滞于G0期及G1期。结论 外源性Rb基因可通过腺病毒载体有效转染卵巢癌细胞株CAOV3，抑制CAOV3细胞的生长。
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Inhibition of Recombinant Rb Gene Adenovirus Vector on the Growth of Ovarian Cancer Cell Line
LI Ye ZHANG Yi LI Hongxia et al
(Department of Obstetrics and Gynecology, Beijing Hospital, Ministry of Public Health Beijing 100730, China)
Abstract：Objective To test and study the effect of inhibition on the growth of ovarian cancer cell line CAOV3 transfected by the recombinant Rb gene adenovirus vector. Methods The recombinant Rb gene and the LacZ gene in adenovirus vector were constructed and transfected into the CAOV3 cell line separately. The Rb gene expression was detected by immunohistochemical assay and agarose gel electrophoresis,etc. The inhibition on the growth of CAOV3 was tested by flow cytometry and methyl thiazolyl tetrazolium assay, etc. Results The constructed recombinant Rb gene adenovirus vector could infect cells with high level expression of Rb protein, and Rb cDNA could be found in the transfected cells. The proliferation of transfected CAOV3 cells was inhibited evidently. Sixty-eight per cent of cells were arrested at G0、G1 phases of cell cycle. Conclusions The recombinant Rb gene adenovirus vector could transform CAOV3 cells efficiently and inhibit CAOV3 cell growth. It might be a new approach of gene therapy for ovarian cancer.
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Key words；Ovarian neoplasms; Genes, retinoblastoma; Cell line▲
外源性 Rb基因是与肿瘤发病相关的抑癌基因之一。许多肿瘤存在 Rb基因的缺失及失活。目前，国外已在不同癌细胞中进行了Rb基因的检测[1-4]，但尚未见Rb基因对卵巢癌细胞株作用的报道。本研究通过 Rb基因体外转染卵巢癌细胞株CAOV3，进行病毒转染及细胞生长的检测，以证实外源性 Rb基因对卵巢癌细胞生长的抑制作用。
材料与方法
一、 Rb基因重组腺病毒载体的构建
构建Rb cDNA片段的生长缺陷型重组腺病毒载体。即将含有Rb cDNA 的片段插入腺病毒质粒载体pXCJL-1的 BamH 1位点，转入人胚肾细胞株，筛选扩增阳性克隆，收集纯化并测定病毒滴度。以同样方法构建LacZ基因重组腺病毒载体，作为对照。
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二、卵巢癌细胞株CAOV3的培养
将卵巢癌细胞株CAOV3(美国肿瘤研究所提供)置于含15%胎牛血清的L15培养基，于37℃，5%二氧化碳条件下培养。
三、外源性Rb基因体外转染及表达的检测
1. LacZ基因表达的检测：将细胞株CAOV3接种到有盖玻片(2 cm×2 cm)的6孔培养板中，24 h后换液(细胞达80%汇合)，加入含LacZ基因的病毒，继续培养 48 h，以x-gal染色LacZ基因表达的β半乳糖(β-gal)，从而检测腺病毒作为基因载体的转染率。
2.细胞株CAOV3内Rb蛋白的检测：将细胞株CAOV3接种到6孔培养板中，加入不同滴度含Rb基因的病毒，培养48 h，采用免疫组织化学法检测 Rb蛋白(抗Rb单克隆抗体由美国Triton Bioscience公司提供)。苏木素染色，细胞核呈棕色为 Rb蛋白阳性表达，光镜下摄片(×400倍)。
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3.外源性Rb cDNA的检测：(1)细胞DNA的提取：收集已转染及未转染Rb基因的CAOV3细胞，常规破膜，加入提取液， 50℃消化过夜，用酚、氯仿、异戊醇(比例为25∶24∶1)抽提DNA，乙醇沉淀，三羟甲基氨基甲烷-乙酸缓冲液溶解DNA。(2)聚合酶链反应(PCR)扩增Rb cDNA：采用特异Rb cDNA第7个外显子核苷酸序列引物，经94℃ 1 min，50℃ 30 s，72℃ 1 min, 共30个循环。反应体积为30 μl。(3)琼脂糖电泳：取10 μg PCR产物，经1.4%的琼脂糖电泳，行溴乙锭染色分析。
四、外源性 Rb基因作用下CAOV3细胞生长的检测
1.细胞生长曲线：CAOV3细胞接种于24孔培养板中， 24 h后换培养液，加入含Rb基因的病毒继续培养。分别于24、 48、 96 h，经0.5%萘酚蓝黑染色，于波长570 nm测定吸光度(A)值，计算每样本 6孔的平均值[5]。对照组包括不加含Rb基因病毒者及加腺病毒β-gal者。
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2.四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测：CAOV3细胞接种于96孔培养板中，接种 24 h后加入含 Rb基因的病毒，继续培养72 h。未转染病毒及转染LacZ基因病毒者为对照组。应用MTT试剂盒(德国Boehringer公司产品)，按说明书操作，于波长570 nm检测A值。
3.流式细胞仪分析细胞生长周期：收集Rb基因、LacZ基因转染72 h的细胞及未转染病毒的细胞，以70%乙醇固定后加入1 ml 磷酸缓冲液(PBS)及RNA 酶(10 mg/ml)5 μl，37℃下水浴30 min，4℃下经碘化乙丙锭避光染色30 min。采用流式细胞仪检测细胞生长周期。
结果
一、重组腺病毒载体对CAOV3细胞的转染及外源性 Rb基因的表达
1.转染率： LacZ基因重组腺病毒载体转染CAOV3细胞后 24 h，经β-gal染色，90%为阳性，表明重组腺病毒载体可以有效转染CAOV3细胞。含 Rb基因的腺病毒体外转染CAOV3细胞48 h，80%细胞中有Rb蛋白表达，而未转染腺病毒的CAOV3细胞中无 Rb蛋白的表达。见图1。
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图1 转染CAOV3细胞内Rb蛋白的表达.β-gal染色×400
2. Rb cDNA检测：转染Rb基因的CAOV3细胞提取的DNA，经 PCR扩增，琼脂糖电泳检测出Rb cDNA条带，与含Rb cDNA质粒电泳条带位置一致，见图2。而对照组CAOV3细胞中未检测出Rb cDNA条带。
1： PBR322/MspI相对分子质量标准 2： Rb cDNA 质粒
3： PCR扩增转染Rb基因细胞DNA 的产物
4： PCR扩增未转染Rb基因细胞DNA的产物
图2 转染Rb基因后细胞内PCR扩增Rb cDNA产物的表达
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二、CAOV3细胞生长情况的检测
1.细胞生长：A值检测结果显示，外源性Rb基因可抑制CAOV3细胞生长。而未转染Rb基因的对照组，CAOV3细胞数目呈增长趋势。 见图3。
图3 外源性Rb基因作用下的细胞生长曲线
2.不同滴度的Rb基因重组腺病毒载体对CAOV3细胞生长的影响：CAOV3细胞转染不同滴度的 Rb基因重组腺病毒载体后，MTT比色法检测结果显示，随转染滴度的增高， A值逐渐降低。即Rb基因可以抑制CAOV3细胞生长，且随转染滴度的增高，抑制作用也增强。见图4。
图4 不同滴度Rb基因作用下的细胞生长曲线
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3.CAOV3细胞生长周期及生长状态的检测：流式细胞仪分析，经Rb基因转染的CAOV3细胞，出现生长停滞现象，68%的细胞生长停滞于G0期及G1期。同时可见M期及S期细胞明显减少，23%的细胞出现细胞体积缩小及DNA染色降低。
讨论 一、 Rb基因的特征
Rb基因是目前最常检测的抑癌基因。其染色体DNA长约100 kb，编码蛋白为P110。在细胞核中含有 Rb蛋白，它与许多重要转录调控因子结合，调控细胞生长。Rb基因的缺失或失活是肿瘤发生的重要机理之一。选择合适的载体、安全有效的转染方式和保证外源性基因的有效表达，是基因治疗的关键。本研究证实，腺病毒载体能有效的将外源性 Rb基因导入卵巢癌CAOV3细胞中，并高效表达 Rb蛋白。
二、 Rb基因对癌细胞生长的抑制作用
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有效的目的基因，安全的转染方式是肿瘤基因治疗的研究热点。腺病毒载体介导下，外源性 Rb基因可有效的转染卵巢癌细胞。 Rb基因作为抑癌基因之一，因具有调控细胞生长，抑制癌细胞进入增殖期的功能，故为今后临床治疗卵巢癌提供了新的实验依据。
参考文献：
[1]Sasano H, Cornerford H, Silverberg SD, et al. Analysis of abnormalities of retinoblastoma gene in human ovarian and endometrial carcinoma. Cancer, 1990,66:2150-2153.
[2]Li SF, Shioawa T, Nakayama K, et al. Stepwise abnormality of sex steroid hormone receptors, tumor suppressor gene products (p53 and Rb), and cyclin E in uterine endometrioid carcinoma. Cancer, 1996,77:321-324.
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[3]Tallor RR, Ilona L, Joseph G, et al. Abnormal expression of the retinoblastoma gene in ovarian neoplasma and correlation to p53 and K-ras mutation. Gynecol Oncol, 1995,58:307-311.
[4]Yaginuma Y,Hideto K,Kitirou K, et al. Analysis of retinoblastoma gene in human endometrial carcinoma. Obstet Gynecol, 1996,87:755-758.
[5]翁进，朱雪静，林勇，等. 苷糖酯对血小板与内皮细胞功能的影响. 中国医学科学院学报，1997，19：414-417.
[6]沈羽非，方福德. 真核基因表达调控. 第2版. 北京：高等教育出版社，1996. 145-146，164-165.
[7]成军，黄海长. 程序性细胞死亡与疾病. 第2版. 北京：北京医科大学协和医科大学联合出版社，1997. 75-79.
收稿日期：1999-04-05, 百拇医药