活化蛋白C抵抗与复发性流产关系的研究
作者：董卫红 魏文宁 林美华
单位：董卫红(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院妇产科)；林美华(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院妇产科)；魏文宁(血液研究所)
关键词：流产；蛋白质C；抗药性
中华妇产科杂志000206 摘 要：目的 探讨活化蛋白 C抵抗(APC-R)与复发性流产的关系。方法 用以活化部分凝血活酶时间(APTT)为基础的APC-R方法，检测40例已产非孕妇女(对照组)、55例原因不明复发性流产患者(实验组)APC-R的阳性率。结果 对照组APC-R阳性率为5%，实验组为26%，两者比较，差异有极显著性(P<0.01)。仅有两次流产者和有 3次以上流产者的APC-R阳性率分别为23%和29%，两者比较，差异无显著性(P>0.05)；晚期流产者的APC-R阳性率为38%，明显高于早期流产的12%(P<0.05)。结论 APC-R与复发性流产有一定联系，与晚期流产关系更密切，而与流产次数无关。
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Study on Relationship of Activated Protein C Resistance and Recurrent Spontaneous Abortion
DONG Weihong WEI Wenning LIN Meihua
(Department of Obstetrics and Gynecology,Union Hospital, Tongji Medical University,Wuhan 430022, China)
Abstract：Objective To investigate whether activated protein C resistance (APC-R) is associated with recurrent spontaneous abortion. Methods APC-R was detected by activated partial thromboplastin time (APTT) in the presence and absence of APC. Subjects included 40 nonpregnant parous women (control group) and 55 patients with recurrent spontaneous abortion. Results There was signficant difference for APC-R between controls and the patients (P<0.01). Among the study group,the prevalence of APC-R positive rate had no relation to the numbers of abortion. The positive rate of APC-R in patients with late abortion was significantly higher than those with only early abortion (38% and 12% respectively). Conclusion APC-R is partly associated with recurrent spontaneous abortion, especially late abortion.It has no relation to the numbers of abortion.
, 百拇医药
Key words；Abortion; Protein C; Drug resistance▲
活化蛋白C抵抗(activated protein C resistance, APC-R) 为引起静脉血栓形成的一种重要原因，国内外学者对此进行了较深入的研究。研究中发现，女性APC-R患者在血栓形成的同时常伴有妊娠丢失如复发性流产、死胎、早产等。为此，我们对APC-R与复发性流产的关系进行了初步探讨，以期在流产病因上有所突破。
资料与方法
一、研究对象
实验组：随机收集1997年9月至1998年4月在我院就诊的原因不明复发性流产患者55例(连续流产2次以上)，年龄22～37岁，平均年龄28岁，其中流产两次者31例，3次及以上者24例；早期流产者26例，晚期流产者29例。对照组：选择同期就诊于门诊已产非孕妇女，共40例，年龄25～42岁，平均年龄31岁。两组采血时间均距最后1次妊娠3个月以上，均无血栓性疾病、糖尿病及肾脏疾病病史，近2个月内未使用抗凝及促纤维蛋白溶解药物。
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二、方法
1.标本处理：采集静脉血4.5 ml与0.129 mol/L的枸橼酸钠 0.5 ml按1∶9混合，采血30 min内在12℃条件下2 800 r/min离心15 min，取贫血小板血浆(离心前后的血浆进行血小板计数，保证离心后的血小板数低于离心前的1% )，每份1 ml,分装后储存于-70℃的冰箱中。
2.抗APC-R敏感比值 (APC-SR)的检测：以活化部分凝血活酶时间 (APTT)为基础[1]检测APC-R。用DIAGNOSTICS STAGO APC-R试剂盒(法国Assieres公司产品)在ACL-200全自动血液凝固仪上测定。具体实验方法如下：分别在试管1和试管2中加入100 μl APTT试剂与100 μl待测血浆，混合，37℃孵育30 min，试管 1中加入0.025 mol CaCl2缓冲液100 μl，测得APTT1，然后在试管2中加入含有0.025 mol CaCl2的活化蛋白C(APC)试剂，浓度为1 μg/ml，测得APTT2，并计算加入APC试剂前后的APC-SR， APC-SR=APTT2/APTT1。结果判断：APC-SR低于正常值的2 s以上为APC-R阳性。
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三、统计学处理
APC-SR测定结果采用
±s表示，组间均数用t检测，APC-R阳性率比较采用χ2检验。
结果
一、两组APC-SR均值及APC-R阳性率的比较
对照组的APC-SR均值为2.17±0.25(1.92～2.42)，按上述标准APC-SR低于1.67为APC-R阳性。对照组有2例APC-R阳性，阳性率为5%。实验组APC-SR均值为1.92±0.49(1.43～2.41),有14例为APC-R阳性，阳性率为26%。两组间APC-SR均值比较，差异有显著性(P<0.05)；两组间APC-R阳性率比较，差异有极显著性(P<0.01)。
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二、不同流产次数者之间 APC-R阳性率的比较
有2次流产者的APC-SR均值为 2.01±0.48 (1.53～2.49)，7例为APC-R阳性，阳性率为23%。有 3次或 3次以上流产者的APC-SR均值为1.89±0.49(1.40～2.38)，7例为APC-R阳性，阳性率为 29%。两者阳性率比较，差异无显著性(P>0.05)。
三、不同流产时间APC-R阳性率的比较
早期流产者APC-SR均值为 2.07±0.42(1.65～2.49)，3例为APC-R阳性，阳性率为12%；晚期流产者APC-SR均值为1.89±0.51(1.36～2.38)，11例为APC-R阳性，阳性率为38%。两者之间阳性率比较，差异有显著性(P<0.05)。
讨论
, http://www.100md.com 人体正常抗凝系统中，APC通过水解活化凝血因子Ⅴ和凝血因子Ⅷ使之灭活而发挥抗凝作用，其体外抗凝活性表现为加入APC后，受检者APTT显著延长。Dahlback等[1]报道，在一些血栓病患者中，加入纯化的APC并未使APTT延长，这种现象被称为APC-R现象。APC-R是由于凝血因子Ⅴ基因上1 691位的鸟嘌呤被腺嘌呤代替，引起凝血因子Ⅴ氨基酸序列506位精氨酸被谷氨酸置换[2]，使活化凝血因子Ⅴ对APC反应降低。除了遗传性APC-R外，现在还发现存在获得性APC-R，抗磷脂抗体的产生是获得性PAC-R的重要原因[3]。
APC-R在流产中的作用，在国外已受到关注。 在一些原因不明的妊娠丢失患者中，APC-R阳性患者与APC-R阴性患者相比，晚期流产发生率明显增高，活产率明显下降，而早期流产发生无明显差异[4]。 Rai等[5]则发现，发生于第2孕期流产者APC-R阳性率为20%，仅有第1孕期流产者APC-R阳性率为5.7%，正常对照组为4.3%。本研究中，复发性流产与对照组之间APGR阳性率有明显差异，其中晚期流产者明显高于早期流产者。提示， APC-R与复发性流产特别是晚期流产有一定联系。
, 百拇医药
胎盘部位的血栓形成是APC-R引起流产特别是晚期流产的重要原因。APC-R患者常存在高凝状态，妊娠后可获得暂时性APC-R，增加血检形成危险。 Cumming等[6]动态观察正常妊娠APC-SR变化发现，从孕14周开始APC-SR逐渐下降，至36周降至最低点，产后8周恢复到正常水平。孕期雌、孕激素的增加改变机体蛋白C抗凝系统的功能，加重APC-R患者血栓形成的危险。
APC-R形成的主要原因为凝血因子Ⅴ突变。在与APC-R有关的流产患者中，凝血因子Ⅴ突变发生率为48.8%[4]。在中国凝血因子Ⅴ突变不是引起APC-R的主要原因[7]。抗磷脂抗体综合征与血栓形成、流产关系密切。有学者推测，抗磷脂抗体中和了血小板磷脂表面，阻止了APC降解活化凝血因子Ⅴ的过程。这也许是APC-R形成的又一原因，需我们进一步探讨。
参考文献：
, http://www.100md.com [1]Dahlback B, Carlesson M, Svensson PJ, et al. Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. Proc Natl Acad Sci USA,1993,90: 1004-1008.
[2]Bertina RM,Koeleman BP, Koster T,et al. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C. Nature,1994,369:64-67.
[3]Bokarewa MI, Bremme K, Falk G,et al.Studies on phospholipid antibodies,APC-resistance and associated mutation in the coagulation factor V gene.Thrombosis Research,1995, 78:193-200.
, http://www.100md.com
[4]Brenner B, Mandel H, Lanir N, et al. Activated protein C resistance can be associated with recurrent fetal loss. Br J Haematol, 1997,97:551-554.
[5]Rai R, Regan L, Hadley E, et al. Second-trimester pregnancy loss is associated with activated C resistance. Br J Haematol, 1996,92:489-490.
[6]Cumming AM, Tait RC,Fildes S, et al. Development of resistance to activated protein C during pregnancy. Br J Haematol, 1995,90:725-727.
[7]洪梅，魏文宁，宋善俊,等. 正常人和血栓性疾病患者抗活化的蛋白C 抵抗现象和FV Leiden的研究. 中华血液学杂志，1998，9：455-457.
收稿日期：1999-01-06, 百拇医药
单位：董卫红(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院妇产科)；林美华(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院妇产科)；魏文宁(血液研究所)
关键词：流产；蛋白质C；抗药性
中华妇产科杂志000206 摘 要：目的 探讨活化蛋白 C抵抗(APC-R)与复发性流产的关系。方法 用以活化部分凝血活酶时间(APTT)为基础的APC-R方法，检测40例已产非孕妇女(对照组)、55例原因不明复发性流产患者(实验组)APC-R的阳性率。结果 对照组APC-R阳性率为5%，实验组为26%，两者比较，差异有极显著性(P<0.01)。仅有两次流产者和有 3次以上流产者的APC-R阳性率分别为23%和29%，两者比较，差异无显著性(P>0.05)；晚期流产者的APC-R阳性率为38%，明显高于早期流产的12%(P<0.05)。结论 APC-R与复发性流产有一定联系，与晚期流产关系更密切，而与流产次数无关。
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Study on Relationship of Activated Protein C Resistance and Recurrent Spontaneous Abortion
DONG Weihong WEI Wenning LIN Meihua
(Department of Obstetrics and Gynecology,Union Hospital, Tongji Medical University,Wuhan 430022, China)
Abstract：Objective To investigate whether activated protein C resistance (APC-R) is associated with recurrent spontaneous abortion. Methods APC-R was detected by activated partial thromboplastin time (APTT) in the presence and absence of APC. Subjects included 40 nonpregnant parous women (control group) and 55 patients with recurrent spontaneous abortion. Results There was signficant difference for APC-R between controls and the patients (P<0.01). Among the study group,the prevalence of APC-R positive rate had no relation to the numbers of abortion. The positive rate of APC-R in patients with late abortion was significantly higher than those with only early abortion (38% and 12% respectively). Conclusion APC-R is partly associated with recurrent spontaneous abortion, especially late abortion.It has no relation to the numbers of abortion.
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Key words；Abortion; Protein C; Drug resistance▲
活化蛋白C抵抗(activated protein C resistance, APC-R) 为引起静脉血栓形成的一种重要原因，国内外学者对此进行了较深入的研究。研究中发现，女性APC-R患者在血栓形成的同时常伴有妊娠丢失如复发性流产、死胎、早产等。为此，我们对APC-R与复发性流产的关系进行了初步探讨，以期在流产病因上有所突破。
资料与方法
一、研究对象
实验组：随机收集1997年9月至1998年4月在我院就诊的原因不明复发性流产患者55例(连续流产2次以上)，年龄22～37岁，平均年龄28岁，其中流产两次者31例，3次及以上者24例；早期流产者26例，晚期流产者29例。对照组：选择同期就诊于门诊已产非孕妇女，共40例，年龄25～42岁，平均年龄31岁。两组采血时间均距最后1次妊娠3个月以上，均无血栓性疾病、糖尿病及肾脏疾病病史，近2个月内未使用抗凝及促纤维蛋白溶解药物。
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二、方法
1.标本处理：采集静脉血4.5 ml与0.129 mol/L的枸橼酸钠 0.5 ml按1∶9混合，采血30 min内在12℃条件下2 800 r/min离心15 min，取贫血小板血浆(离心前后的血浆进行血小板计数，保证离心后的血小板数低于离心前的1% )，每份1 ml,分装后储存于-70℃的冰箱中。
2.抗APC-R敏感比值 (APC-SR)的检测：以活化部分凝血活酶时间 (APTT)为基础[1]检测APC-R。用DIAGNOSTICS STAGO APC-R试剂盒(法国Assieres公司产品)在ACL-200全自动血液凝固仪上测定。具体实验方法如下：分别在试管1和试管2中加入100 μl APTT试剂与100 μl待测血浆，混合，37℃孵育30 min，试管 1中加入0.025 mol CaCl2缓冲液100 μl，测得APTT1，然后在试管2中加入含有0.025 mol CaCl2的活化蛋白C(APC)试剂，浓度为1 μg/ml，测得APTT2，并计算加入APC试剂前后的APC-SR， APC-SR=APTT2/APTT1。结果判断：APC-SR低于正常值的2 s以上为APC-R阳性。
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三、统计学处理
APC-SR测定结果采用
±s表示，组间均数用t检测，APC-R阳性率比较采用χ2检验。结果
一、两组APC-SR均值及APC-R阳性率的比较
对照组的APC-SR均值为2.17±0.25(1.92～2.42)，按上述标准APC-SR低于1.67为APC-R阳性。对照组有2例APC-R阳性，阳性率为5%。实验组APC-SR均值为1.92±0.49(1.43～2.41),有14例为APC-R阳性，阳性率为26%。两组间APC-SR均值比较，差异有显著性(P<0.05)；两组间APC-R阳性率比较，差异有极显著性(P<0.01)。
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二、不同流产次数者之间 APC-R阳性率的比较
有2次流产者的APC-SR均值为 2.01±0.48 (1.53～2.49)，7例为APC-R阳性，阳性率为23%。有 3次或 3次以上流产者的APC-SR均值为1.89±0.49(1.40～2.38)，7例为APC-R阳性，阳性率为 29%。两者阳性率比较，差异无显著性(P>0.05)。
三、不同流产时间APC-R阳性率的比较
早期流产者APC-SR均值为 2.07±0.42(1.65～2.49)，3例为APC-R阳性，阳性率为12%；晚期流产者APC-SR均值为1.89±0.51(1.36～2.38)，11例为APC-R阳性，阳性率为38%。两者之间阳性率比较，差异有显著性(P<0.05)。
讨论
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APC-R在流产中的作用，在国外已受到关注。 在一些原因不明的妊娠丢失患者中，APC-R阳性患者与APC-R阴性患者相比，晚期流产发生率明显增高，活产率明显下降，而早期流产发生无明显差异[4]。 Rai等[5]则发现，发生于第2孕期流产者APC-R阳性率为20%，仅有第1孕期流产者APC-R阳性率为5.7%，正常对照组为4.3%。本研究中，复发性流产与对照组之间APGR阳性率有明显差异，其中晚期流产者明显高于早期流产者。提示， APC-R与复发性流产特别是晚期流产有一定联系。
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胎盘部位的血栓形成是APC-R引起流产特别是晚期流产的重要原因。APC-R患者常存在高凝状态，妊娠后可获得暂时性APC-R，增加血检形成危险。 Cumming等[6]动态观察正常妊娠APC-SR变化发现，从孕14周开始APC-SR逐渐下降，至36周降至最低点，产后8周恢复到正常水平。孕期雌、孕激素的增加改变机体蛋白C抗凝系统的功能，加重APC-R患者血栓形成的危险。
APC-R形成的主要原因为凝血因子Ⅴ突变。在与APC-R有关的流产患者中，凝血因子Ⅴ突变发生率为48.8%[4]。在中国凝血因子Ⅴ突变不是引起APC-R的主要原因[7]。抗磷脂抗体综合征与血栓形成、流产关系密切。有学者推测，抗磷脂抗体中和了血小板磷脂表面，阻止了APC降解活化凝血因子Ⅴ的过程。这也许是APC-R形成的又一原因，需我们进一步探讨。
参考文献：
, http://www.100md.com [1]Dahlback B, Carlesson M, Svensson PJ, et al. Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. Proc Natl Acad Sci USA,1993,90: 1004-1008.
[2]Bertina RM,Koeleman BP, Koster T,et al. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C. Nature,1994,369:64-67.
[3]Bokarewa MI, Bremme K, Falk G,et al.Studies on phospholipid antibodies,APC-resistance and associated mutation in the coagulation factor V gene.Thrombosis Research,1995, 78:193-200.
, http://www.100md.com
[4]Brenner B, Mandel H, Lanir N, et al. Activated protein C resistance can be associated with recurrent fetal loss. Br J Haematol, 1997,97:551-554.
[5]Rai R, Regan L, Hadley E, et al. Second-trimester pregnancy loss is associated with activated C resistance. Br J Haematol, 1996,92:489-490.
[6]Cumming AM, Tait RC,Fildes S, et al. Development of resistance to activated protein C during pregnancy. Br J Haematol, 1995,90:725-727.
[7]洪梅，魏文宁，宋善俊,等. 正常人和血栓性疾病患者抗活化的蛋白C 抵抗现象和FV Leiden的研究. 中华血液学杂志，1998，9：455-457.
收稿日期：1999-01-06, 百拇医药