外淋巴钙离子对畸变产物耳声发射的影响
作者：李克勇 王直中 曹克利 倪道凤
单位：100730 北京协和医院耳鼻咽喉科(李克勇 现在 200080 上海市第一人民医院耳鼻咽喉科)
关键词：外淋巴；钙；耳声发射；自发性
中华耳鼻咽喉科杂志980203 【摘要】 目的 研究外毛细胞运动产生畸变产物耳声发射(DPOAE)的机理。方法 观察9只豚鼠(11耳)采用无钙和有钙的人工外淋巴灌流外淋巴腔后DPOAE的变化。结果 用无钙人工外淋巴灌流后DPOAE的均值从41.3 dB SPL降至13.7 dB SPL，再用正常钙浓度的外淋巴灌流后又可回升到36.7 dB SPL。结论 DPOAE的产生需外淋巴中正常浓度的钙离子为必要条件。提示外毛细胞在产生DPOAE中并非以毛细胞的电运动性机制起作用，而是与一般肌纤维相似的收缩机理起作用，需要钙离子的中介。
The effect of calcium ion in perilymphatic fluid on guinea pig's distortion
, 百拇医药
product otoacoustic emissions
Li Keyong*，Wang Zhizhong,Cao Keli,et al.*Shanghai First People's Hospital, Shanghai 200080
【Abstract】 Objective To study the mechanism of the production of distortion product otoacoustic emissions (DPOAE) by electromobility of out hair cell. Methods The changes of nine gninea pig's DPOAE by means of perfusion of artificial perilymphatic fluid with and without calcium ion were observed. Results The mean value of DPOAE decreased from 41.3 dB to 13.7 dB after perfusion of fluid devoid of calcium ion, it revived to 36.7 dB after reperfusion with normal perilymphatic fluid. The result supports Pickle's muscle theory for DPOAE′s mobile mechanism and does not support Brownell′s electromobility theory. Conclusion A normal concentration of calcium ion in perilymphatic fluid is necessary for outer hair cell to produce DPOAE.
, 百拇医药
【Key words】 Perilymph Calcium Otoacoustic emissions, spontaneous
自从发现畸变产物耳声发射(distortion product otoacoustic emissions, DPOAE)现象，声源的动力来源一直是人们研究重点，目前一般认为是外毛细胞主动运动的结果。但外毛细胞运动的形式和过程尚不清楚。国外有人认为是外毛细胞电运动性机制，在此机制作用下，运动不需要钙离子作中介和ATP作能源[1]。而另有人认为是一般肌纤维机制，需要钙离子作中介和ATP作能源[2]。弄清这个问题对揭示DPOAE的产生机理十分重要。本研究利用置换外淋巴的方法，观察外淋巴中缺钙离子情况下对DPOAE的影响并探讨DPOAE产生机理。
材料和方法
取9只豚鼠(11耳实验)，性别不限，体重250～400 g。耳廓反射存在，短声诱发ABR阈值<30 dB peSPL。25%乌拉坦溶液中加入5%氯醛糖配成混合麻醉液，豚鼠腹腔注射2 ml/kg，全身麻醉。麻醉成功后按下列步骤操作和采集数据。
, 百拇医药
1.切开耳廓，打开骨大泡，暴露耳蜗，将豚鼠在立体定位仪上仰侧卧位，头夹固定。
2.测DPOAE：f0=1006 Hz(f1/f2=1.22)的输入输出曲线，给声L1=L2，自60 dB起，10 dB一档向下衰减至10 dB(表1)。
表1 外淋巴置换过程中的DPOAE(
±s dB SPL) 声强(dB SPL)
耳数
开骨大泡
耳蜗开骨窗
注无钙液
注正常液
, http://www.100md.com
60
11
45.3±6.0
41.3± 8.5
13.7±6.8
36.7±7.8
50
11
34.6±6.7
34.7±11.8
3.4±6.6
30.8±9.9
, 百拇医药
40
11
26.9±8.5
24.1±10.6
-0.6±6.5
20.7±9.3
30
11
14.7±7.2
10.6±12.3
-2.6±7.4
6.6±6.8
, 百拇医药
20
11
9.1±7.3
6.5± 5.4
-0.3±4.1
0.8±3.6
10
11
2.8±2.5
3.7± 5.0
-3.8±4.4
-2.3±5.1
, http://www.100md.com 3.耳蜗灌流参考Nuttall等[3]的方法，用直径0.5 mm金刚钻在耳蜗前庭阶和鼓阶骨壁上小心磨开二个直径约0.5 mm大小的骨窗，暴露骨膜。
4.将尖端20 μm的玻璃微电极固定于微操纵器上，调节微操纵器，用玻璃微电极尖端刺破前庭阶骨窗的骨膜，然后再退出微电极。调节微操纵器使针头刺入鼓阶处骨窗的骨膜，进入鼓阶，深约1 mm。
5.测DPOAE的输入输出曲线。
6.将微量进样器推杆接微进样泵，缓慢持续推入深蓝色的无钙外淋巴2.5 μl/min，持续10分钟，共推入25 μl。此时耳蜗内呈蓝色，从前庭阶开口流出的液体也呈蓝色[4]。用细棉签拭净从前庭阶破孔流出的积于骨大泡底部的外淋巴。
7.测DPOAE输入输出曲线，条件同步骤2、5。
, 百拇医药
8.撤微量进样器，蒸溜水清洗二遍，再吸无色有钙人工外淋巴25 μl。
9.在原进针点再次刺入骨膜1 mm。重复步骤6，将有钙人工外淋巴注入耳蜗底回鼓阶，直至耳蜗蓝色消退，前庭阶开口流出的液体呈无色透明。
10.再测DPOAE，条件同步骤2、5、7。
记录用Celesta 503耳声发射描记系统。
因缺钙人工外淋巴有甲稀蓝和渗透浓度较全配方略低两个特点，为排除这两个因素对DPOAE的影响，设对照组。实验前先取2只豚鼠(4耳)进行甲烯蓝和低渗作用对照，耳蜗灌流前操作过程同实验组，插好微量进样器后先测50 dB的DPOAE，然后灌全配方人工外淋巴加甲烯蓝，灌好后再测50 dB的DPOAE，再灌NaCl浓度为134 mmol/L的低渗人工外淋巴(正常浓度为136 mmol/L)。完成后再测50dB的DPOAE。经计算NaCl浓度为134 mmol/L的外淋巴渗透浓度与无钙人工外淋巴相等。
, 百拇医药
结果
本实验条件下，本项实验的各操作过程对DPOAE影响见表1。
从表中可见，耳蜗上开骨窗，微量进样器针尖插入耳蜗底回鼓阶对DPOAE影响甚微，而以无钙外淋巴置换原正常外淋巴后DPOAE值降至13.7 dB(60 dB SPL刺激声强)，其输入输出曲线与死豚鼠的值相同。而用有钙外淋巴置换出无钙液后，DPOAE又可恢复，但不能恢复到100%的程度。对照组结果见表2。
表2 对照组甲烯蓝和低渗人工外淋巴
对DPOAE的影响(±s dB SPL) 检测时间
耳数
DPOAE
, 百拇医药
灌注前
4
35.2±9.3
灌加甲烯蓝液
4
34.1±8.2
灌低渗液
4
34.9±9.8
讨论
毛细胞胞体浸浴在Corti淋巴中，而后者是外淋巴通过骨螺旋板小孔流入Corti器所致，所以外淋巴是毛细胞的细胞外液。正常豚鼠耳蜗外淋巴的钙离子浓度是内淋巴的100倍左右，如此高的浓度差必定有其存在理由，很可能与某种生理活动有关。我们采用的人工外淋巴配方经许多学者证明对耳蜗功能无影响，能替代外淋巴[4]。所以，本实验DPOAE的消失纯粹是缺乏钙离子引起。最后补充有钙的人工外淋巴DPOAE又能恢复。这排除了可能存在的耳蜗结构破坏造成DPOAE消失。而恢复不完全可能是缺乏钙离子一段时间对耳蜗功能的影响。本实验耳蜗缺钙离子时间从30分钟～1小时不等。
, http://www.100md.com
Brownell[1]提出耳声发射(包括DPOAE)产生是由于外毛细胞电运动性机制，他认为外毛细胞感受器电位，即CM，能驱动外毛细胞长度随电位变化而周期性伸长和缩短，这种运动带动基底膜运动，引发耳声发射产生。这种运动不需要ATP作为能源，也不需要钙离子作为中介，它直接将CM电能转化为机械能。而我们的实验结果显示钙离子至少与DPOAE的产生密切相关，DPOAE产生依赖于正常浓度的钙离子，上述学说的正确性令人怀疑。
另一假说认为外毛细胞运动机理与一般肌纤维收缩相同[2]。外毛细内有肌动蛋白和肌球蛋白，也有钙结合蛋白，可象肌纤维一样收缩。当去极化使胞内负电位上升至-60mV以上时，钙离子内流，使钙调节蛋白变构，肌动纤维和肌凝蛋白分解ATP放能，二者产生相对位移，使毛细胞收缩。这种与一般肌纤维相同的收缩机制引起了包括DPOAE在内的耳声发射现象。Zinner[5]用Tritonx-100除去外毛细胞的外膜，保留细胞骨架，使ATP和钙离子可自由透入细胞浆，发现培养皿中加入ATP和钙离子均可使其收缩，而除去钙离子则加入ATP也不能引起收缩。在这种机理情况下，阻止钙离子跨膜内流和去除外淋巴中的钙离子均能使DPOAE消失。我们的实验结果支持后一种假说，即毛细胞的肌纤维象普通肌纤维一样收缩运动而产生DPOAE。
, 百拇医药
参考文献
1 Brownell WE. Outer hair cell electromotility and otoacoustic emissions. Ear Hearri,1990,11: 82-92.
2 Pickles JO. Recent advances in cochlea physiolog. Progress Neurobiology,1985,24:1-42.
3 Nuttall AL,LaRouere MJ, Lawrence M. Acute perilymphatic perfusion of the guniea pig cochlea. Hear Res, 1982,6:207-221.
4 Bobbin RP, Jastreboff PJ, Fallon M, et al. Nimodipine, an L-chanel Ca2+ antagonist,reverses the negative summating potential recorded from the guniea pig cochlea. Hear Res ,1990,46:277-287.
5 Zinner HP. Motile response in outer hair cell. Hear Res ,1986,22:83-90.
(收稿：1997-07-07 修回：1997-11-15), http://www.100md.com
单位：100730 北京协和医院耳鼻咽喉科(李克勇 现在 200080 上海市第一人民医院耳鼻咽喉科)
关键词：外淋巴；钙；耳声发射；自发性
中华耳鼻咽喉科杂志980203 【摘要】 目的 研究外毛细胞运动产生畸变产物耳声发射(DPOAE)的机理。方法 观察9只豚鼠(11耳)采用无钙和有钙的人工外淋巴灌流外淋巴腔后DPOAE的变化。结果 用无钙人工外淋巴灌流后DPOAE的均值从41.3 dB SPL降至13.7 dB SPL，再用正常钙浓度的外淋巴灌流后又可回升到36.7 dB SPL。结论 DPOAE的产生需外淋巴中正常浓度的钙离子为必要条件。提示外毛细胞在产生DPOAE中并非以毛细胞的电运动性机制起作用，而是与一般肌纤维相似的收缩机理起作用，需要钙离子的中介。
The effect of calcium ion in perilymphatic fluid on guinea pig's distortion
, 百拇医药
product otoacoustic emissions
Li Keyong*，Wang Zhizhong,Cao Keli,et al.*Shanghai First People's Hospital, Shanghai 200080
【Abstract】 Objective To study the mechanism of the production of distortion product otoacoustic emissions (DPOAE) by electromobility of out hair cell. Methods The changes of nine gninea pig's DPOAE by means of perfusion of artificial perilymphatic fluid with and without calcium ion were observed. Results The mean value of DPOAE decreased from 41.3 dB to 13.7 dB after perfusion of fluid devoid of calcium ion, it revived to 36.7 dB after reperfusion with normal perilymphatic fluid. The result supports Pickle's muscle theory for DPOAE′s mobile mechanism and does not support Brownell′s electromobility theory. Conclusion A normal concentration of calcium ion in perilymphatic fluid is necessary for outer hair cell to produce DPOAE.
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【Key words】 Perilymph Calcium Otoacoustic emissions, spontaneous
自从发现畸变产物耳声发射(distortion product otoacoustic emissions, DPOAE)现象，声源的动力来源一直是人们研究重点，目前一般认为是外毛细胞主动运动的结果。但外毛细胞运动的形式和过程尚不清楚。国外有人认为是外毛细胞电运动性机制，在此机制作用下，运动不需要钙离子作中介和ATP作能源[1]。而另有人认为是一般肌纤维机制，需要钙离子作中介和ATP作能源[2]。弄清这个问题对揭示DPOAE的产生机理十分重要。本研究利用置换外淋巴的方法，观察外淋巴中缺钙离子情况下对DPOAE的影响并探讨DPOAE产生机理。
材料和方法
取9只豚鼠(11耳实验)，性别不限，体重250～400 g。耳廓反射存在，短声诱发ABR阈值<30 dB peSPL。25%乌拉坦溶液中加入5%氯醛糖配成混合麻醉液，豚鼠腹腔注射2 ml/kg，全身麻醉。麻醉成功后按下列步骤操作和采集数据。
, 百拇医药
1.切开耳廓，打开骨大泡，暴露耳蜗，将豚鼠在立体定位仪上仰侧卧位，头夹固定。
2.测DPOAE：f0=1006 Hz(f1/f2=1.22)的输入输出曲线，给声L1=L2，自60 dB起，10 dB一档向下衰减至10 dB(表1)。
表1 外淋巴置换过程中的DPOAE(
±s dB SPL) 声强(dB SPL)耳数
开骨大泡
耳蜗开骨窗
注无钙液
注正常液
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60
11
45.3±6.0
41.3± 8.5
13.7±6.8
36.7±7.8
50
11
34.6±6.7
34.7±11.8
3.4±6.6
30.8±9.9
, 百拇医药
40
11
26.9±8.5
24.1±10.6
-0.6±6.5
20.7±9.3
30
11
14.7±7.2
10.6±12.3
-2.6±7.4
6.6±6.8
, 百拇医药
20
11
9.1±7.3
6.5± 5.4
-0.3±4.1
0.8±3.6
10
11
2.8±2.5
3.7± 5.0
-3.8±4.4
-2.3±5.1
, http://www.100md.com 3.耳蜗灌流参考Nuttall等[3]的方法，用直径0.5 mm金刚钻在耳蜗前庭阶和鼓阶骨壁上小心磨开二个直径约0.5 mm大小的骨窗，暴露骨膜。
4.将尖端20 μm的玻璃微电极固定于微操纵器上，调节微操纵器，用玻璃微电极尖端刺破前庭阶骨窗的骨膜，然后再退出微电极。调节微操纵器使针头刺入鼓阶处骨窗的骨膜，进入鼓阶，深约1 mm。
5.测DPOAE的输入输出曲线。
6.将微量进样器推杆接微进样泵，缓慢持续推入深蓝色的无钙外淋巴2.5 μl/min，持续10分钟，共推入25 μl。此时耳蜗内呈蓝色，从前庭阶开口流出的液体也呈蓝色[4]。用细棉签拭净从前庭阶破孔流出的积于骨大泡底部的外淋巴。
7.测DPOAE输入输出曲线，条件同步骤2、5。
, 百拇医药
8.撤微量进样器，蒸溜水清洗二遍，再吸无色有钙人工外淋巴25 μl。
9.在原进针点再次刺入骨膜1 mm。重复步骤6，将有钙人工外淋巴注入耳蜗底回鼓阶，直至耳蜗蓝色消退，前庭阶开口流出的液体呈无色透明。
10.再测DPOAE，条件同步骤2、5、7。
记录用Celesta 503耳声发射描记系统。
因缺钙人工外淋巴有甲稀蓝和渗透浓度较全配方略低两个特点，为排除这两个因素对DPOAE的影响，设对照组。实验前先取2只豚鼠(4耳)进行甲烯蓝和低渗作用对照，耳蜗灌流前操作过程同实验组，插好微量进样器后先测50 dB的DPOAE，然后灌全配方人工外淋巴加甲烯蓝，灌好后再测50 dB的DPOAE，再灌NaCl浓度为134 mmol/L的低渗人工外淋巴(正常浓度为136 mmol/L)。完成后再测50dB的DPOAE。经计算NaCl浓度为134 mmol/L的外淋巴渗透浓度与无钙人工外淋巴相等。
, 百拇医药
结果
本实验条件下，本项实验的各操作过程对DPOAE影响见表1。
从表中可见，耳蜗上开骨窗，微量进样器针尖插入耳蜗底回鼓阶对DPOAE影响甚微，而以无钙外淋巴置换原正常外淋巴后DPOAE值降至13.7 dB(60 dB SPL刺激声强)，其输入输出曲线与死豚鼠的值相同。而用有钙外淋巴置换出无钙液后，DPOAE又可恢复，但不能恢复到100%的程度。对照组结果见表2。
表2 对照组甲烯蓝和低渗人工外淋巴
对DPOAE的影响(
±s dB SPL) 检测时间耳数
DPOAE
, 百拇医药
灌注前
4
35.2±9.3
灌加甲烯蓝液
4
34.1±8.2
灌低渗液
4
34.9±9.8
讨论
毛细胞胞体浸浴在Corti淋巴中，而后者是外淋巴通过骨螺旋板小孔流入Corti器所致，所以外淋巴是毛细胞的细胞外液。正常豚鼠耳蜗外淋巴的钙离子浓度是内淋巴的100倍左右，如此高的浓度差必定有其存在理由，很可能与某种生理活动有关。我们采用的人工外淋巴配方经许多学者证明对耳蜗功能无影响，能替代外淋巴[4]。所以，本实验DPOAE的消失纯粹是缺乏钙离子引起。最后补充有钙的人工外淋巴DPOAE又能恢复。这排除了可能存在的耳蜗结构破坏造成DPOAE消失。而恢复不完全可能是缺乏钙离子一段时间对耳蜗功能的影响。本实验耳蜗缺钙离子时间从30分钟～1小时不等。
, http://www.100md.com
Brownell[1]提出耳声发射(包括DPOAE)产生是由于外毛细胞电运动性机制，他认为外毛细胞感受器电位，即CM，能驱动外毛细胞长度随电位变化而周期性伸长和缩短，这种运动带动基底膜运动，引发耳声发射产生。这种运动不需要ATP作为能源，也不需要钙离子作为中介，它直接将CM电能转化为机械能。而我们的实验结果显示钙离子至少与DPOAE的产生密切相关，DPOAE产生依赖于正常浓度的钙离子，上述学说的正确性令人怀疑。
另一假说认为外毛细胞运动机理与一般肌纤维收缩相同[2]。外毛细内有肌动蛋白和肌球蛋白，也有钙结合蛋白，可象肌纤维一样收缩。当去极化使胞内负电位上升至-60mV以上时，钙离子内流，使钙调节蛋白变构，肌动纤维和肌凝蛋白分解ATP放能，二者产生相对位移，使毛细胞收缩。这种与一般肌纤维相同的收缩机制引起了包括DPOAE在内的耳声发射现象。Zinner[5]用Tritonx-100除去外毛细胞的外膜，保留细胞骨架，使ATP和钙离子可自由透入细胞浆，发现培养皿中加入ATP和钙离子均可使其收缩，而除去钙离子则加入ATP也不能引起收缩。在这种机理情况下，阻止钙离子跨膜内流和去除外淋巴中的钙离子均能使DPOAE消失。我们的实验结果支持后一种假说，即毛细胞的肌纤维象普通肌纤维一样收缩运动而产生DPOAE。
, 百拇医药
参考文献
1 Brownell WE. Outer hair cell electromotility and otoacoustic emissions. Ear Hearri,1990,11: 82-92.
2 Pickles JO. Recent advances in cochlea physiolog. Progress Neurobiology,1985,24:1-42.
3 Nuttall AL,LaRouere MJ, Lawrence M. Acute perilymphatic perfusion of the guniea pig cochlea. Hear Res, 1982,6:207-221.
4 Bobbin RP, Jastreboff PJ, Fallon M, et al. Nimodipine, an L-chanel Ca2+ antagonist,reverses the negative summating potential recorded from the guniea pig cochlea. Hear Res ,1990,46:277-287.
5 Zinner HP. Motile response in outer hair cell. Hear Res ,1986,22:83-90.
(收稿：1997-07-07 修回：1997-11-15), http://www.100md.com