人鼻粘膜腺体细胞的悬浮培养
作者：郭永清 杨占泉 卜国铉
单位：130031 长春 白求恩医科大学中日联谊医院耳鼻咽喉-头颈外科
关键词：鼻粘膜；；细胞；培养的；；细胞分化
中华耳鼻咽喉科杂志/990108 【摘要】 目的 建立人鼻粘膜腺体细胞的悬浮培养模型。方法 采用胶原凝胶上悬浮培养。结果 经抗角蛋白单克隆抗体AE1/AE3染色呈阳性反应，证明培养的腺体细胞呈上皮系细胞特征。经过2周的培养，出现分泌粘液糖蛋白的表型分化，经AB-PAS染色染成深蓝色，证实存在粘液糖蛋白的分泌。透射电镜下可见明显的分泌颗粒，细胞膜表面生长微绒毛，细胞膜之间形成明显的紧密联接，具有典型的腺上皮特征。结论 成功地建立了人鼻粘膜腺体细胞的悬浮培养模型。
Floating culture of human nasal glandular cells GUO Yongqing，YANG Zhanquan，BU Guoxuan. Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, Third Clinical College of Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130031
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective To establish a floating cultural model of human nasal glandular (HNG) cells.Methods HNG cells were cultured on floating collagen gels.Results Cultured HNG cells incubated with monoclonal antibody for cytokeratin stained positively. After two-week culture, the cells stained blue by AB-PAS staining. Transmission electron microscopy showed that the cells exhibited numerous microvilli on their surfaces and had numerous secretary granules. They were well polarized and interconnected by junctional complexes. Cultured HNG cells possessed typical characteristics of normal epithelium.Conclusion The floating cultural model of HNG was successfully established.
, 百拇医药
【Key words】 Nasal mucosa Cells,cultured Cell differentiation
粘液分泌在呼吸道防御机制中起重要作用[1,2]，探讨正常及病理状态下的粘液分泌，细胞培养是不可缺少的研究手段。传统的单层细胞培养，细胞分化很差，失去正常机体细胞的生理功能，细胞外基质的应用为促进体外培养细胞的分化开辟了新的道路。我们对人鼻粘膜腺体(human nasal gland, HNG)细胞进行胶原凝胶(collagen gels, CG)悬浮培养，建立HNG细胞的分化模型，为进一步探讨HNG细胞分泌、增生的生理及病理学机制提供研究手段。
材料和方法
一、胶原凝胶上悬浮培养
标本来源于功能性鼻窦内窥镜手术切除的鼻息肉组织。HNG细胞的分离与原代培养采用Fulrukawa等[3]方法。经过5～7 d的原代培养，细胞完全融合后，用胰酶-EDTA消化，离心后加入到无血清培养液中，制备单细胞悬液，使用12孔培养板，每孔加0.5 ml(含1×105个细胞)到CG上，制备CG的材料来源于日本Nitta Gellatin公司提供的试剂盒。培养液中含50% DMEM(Dulbecco＇s Modified Eagle＇s Medium)培养液，50% Ham＇s F-12培养液，并加入以下激素及生长因子 (Sigma, 美国),10 mg/L胰岛素，5 mg/L转铁蛋白，20 μg/L 三碘甲状腺氨酸，0.36 mg/L氢化可的松,7.5 mg/L内皮细胞生长因子, 25 μg/L表皮生长因子, 0.1 μmol/L维生素A酸，20 μg/L霍乱毒素。5%CO2、95%空气条件下培养12 h后，去除未贴壁的细胞及培养液，更换新的培养液，经1周左右细胞融合后完全分离贴附于孔壁的凝胶，使其悬浮于培养液中，每3 d换液1次。
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二、抗人角蛋白单克隆抗体免疫组化染色
培养1周后完全融合的细胞，经胰酶-EDTA消化后，作成单细胞悬液，将细胞离心于玻片上，自然干燥后，用丙酮固定。采用免疫组化ABC法,正常稀释血清作用20 min，鼠抗人角蛋白单克隆抗体(AE1/AE3)作用60 min，生物素标记的二次抗体作用60 min，PBS 洗10 min, ABC-AP试剂作用30 min，碱性磷酸酶底物作用30 min，对比染色，封片。
三、AB(pH 2.5)-PAS染色
CG上悬浮培养2周的细胞经10%甲醛固定，石腊包埋，具体染色步骤为：二甲苯脱腊，水化(100%、95%、90%、70%酒精各5min)，蒸流水洗5min，阿森蓝(Alcian blue，pH 2.5) 30 min，0.3%Na2CO3 30 min，1%过碘酸10 min，席夫试剂30 min，0.5%亚硫酸氢钠2 min 3次，苏木精1.5 min，1%盐酸3 min，1%碳酸锂3 min，脱水、透明、封片。
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四、透射电镜观察
培养2周的细胞经2.5%戊二醛，1%锇酸固定后,系列酒精脱水、浸透(丙酮∶Epon为1∶1)、Epon 812包埋。超薄切片，电子染色, 透射电镜(型号：JSM-2 000，日本)观察。
结果
一、HNG细胞的原代单层培养
分离的细胞悬液在培养瓶中37℃放置1 h，混入的大部分纤维母细胞首先贴壁。未贴壁的腺体细胞悬液取出重新注入到I型胶原蛋白涂抹的培养瓶中继续培养，6～12 h贴壁，经1周左右细胞完全融合，融合后的细胞用胰酶-EDTA消化，混入生长的少量纤维母细胞首先被消化，吸引出之后，继续消化，消化后的细胞经鼠抗人角蛋白单克隆抗体(AE1/AE3)染色，细胞浆被染成粉红色为阳性，所有细胞均呈阳性反应，证明为上皮系细胞。
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二、 HNG细胞的悬浮培养
在CG上播种的细胞，12 h后大部分贴壁，5～7 d完全融合呈上皮系细胞特征。培养2周的石腊包埋切片经AB(pH 2.5)-PAS染色，可见大部分细胞，特别是靠近表面的细胞染成深蓝色，证明存在粘液糖蛋白的分泌(图1)。透射电镜下可见细胞之间形成典型的紧密联接，表面形成微绒毛，细胞质内可见分泌颗粒(图2)。
图1 CG悬浮培养2周的HNG细胞。AB-PAS染色×100
图2 CG上悬浮培养2周的HNG细胞的透射电镜所见。 ×5 000
讨论
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传统的上皮系细胞培养主要是在玻璃或塑料的培养皿上进行单层贴壁培养，这种方法常常造成细胞的脱分化(didifferentiation)现象，失去细胞原来所具有的生理功能。为阻止这种现象，人们不断地探索如何模拟体内的细胞生长环境促进细胞分化。I型胶原蛋白是构成细胞外基质主要成分的纤维性蛋白，广泛存在于动物皮肤、骨骼、肌腱等部位。这些组织经弱酸处理后，胶原纤维之间的结合受到破坏，胶原蛋白分子(相对分子质量3 000 000)可以溶解出来，将这种酸性溶液的pH值中和，25～37℃加温后,胶原蛋白分子之间可以结合,形成纤维状的CG，研究表明CG不仅可以促进细胞贴壁而且可以促进细胞分化[3,4]。
悬浮培养是培养在CG上的细胞经过一段时间完全融合以后，将CG与培养皿壁分离，使其悬浮于培养液中。较早地利用这一方法的是关于乳腺细胞培养，Enami等[5]发现培养在CG上的乳腺细胞，尽管在培养中加入了激素成份，仍无乳汁蛋白的分泌，所以认为CG本身不具有细胞分化作用。但当悬浮培养后，在激素的存在下，诱导产生了大量的乳汁蛋白分泌，所以CG的悬浮对于细胞分化有很重要意义。CG悬浮培养能够促进细胞分化的机理尚未完全明确，可能与以下因素有关，CG悬浮后，首先产生的变化是随着时间的推移CG不断收缩，直径变小；从细胞形态来看，CG悬浮之前细胞呈扁平状态，悬浮后细胞形成柱状或立方体形态，这一细胞形态的变化是与CG的收缩同时发生，而无细胞生长的CG本身并不发生收缩，说明柱状上皮细胞本来具有向柱状方向生长的力量，在这个力量作用之下CG才发生收缩。因此细胞形态的变化可能为诱导细胞分化的因素之一。促进细胞分化的另一个因素是细胞的极性(polarity)，CG悬浮后，上方生长细胞的CG飘浮于培养液中，细胞的营养成份由基底侧吸收，与正常机体细胞的生长方式相似。我们采用CG上悬浮浮培养，结果证明培养的HNG细胞呈上皮系细胞特征，经抗角蛋白单克隆抗体AE1/AE3染色呈阳性反应。经过2周的培养，出现分泌粘液糖蛋白的表型分化，经AB-PAS染色染成深蓝色。透射电镜下可见明显的分泌颗粒，细胞膜表面生长微绒毛，细胞膜之间形成明显的紧密联接，具有典型的腺上皮特征。这一模型的成功建立为进一步探讨HNG细胞分泌、增生的生理及病理学机制提供研究手段。
, 百拇医药
《参考文献》
[1] Kaliner M, Shelhamer JH, Borson B, et al. Human respiratory mucus. Am Rev Respir Dis, 1986,134: 612-621.
[2] Reid L. Measurement of the bronchial mucous gland layer: a diagnostic yardstick in chronic bronchitis. Thorax,1963, 15: 132-141.
[3] Fulrukawa M, Yamaya M, Ikeda K, et al. Culture and characterization of human nasal gland cells. Am J Physiol 271(Lung cell Mol Physiol15), 1996,126:2027-2034.
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[4] Clark AB, Randell SH, Nettesheim P, et al. Regulation of ciliated cell differentiation in cultures of rat tracheal epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol, 1995,12:329-338.
[5] Enami J, Yang J, Nandi S. Floating culture of mouse mammary epithelial cells on collagen gels. Cancer Letters, 1977,6: 99-105.
(收稿：1998-01-12 修回：1998-10-30)
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单位：130031 长春 白求恩医科大学中日联谊医院耳鼻咽喉-头颈外科
关键词：鼻粘膜；；细胞；培养的；；细胞分化
中华耳鼻咽喉科杂志/990108 【摘要】 目的 建立人鼻粘膜腺体细胞的悬浮培养模型。方法 采用胶原凝胶上悬浮培养。结果 经抗角蛋白单克隆抗体AE1/AE3染色呈阳性反应，证明培养的腺体细胞呈上皮系细胞特征。经过2周的培养，出现分泌粘液糖蛋白的表型分化，经AB-PAS染色染成深蓝色，证实存在粘液糖蛋白的分泌。透射电镜下可见明显的分泌颗粒，细胞膜表面生长微绒毛，细胞膜之间形成明显的紧密联接，具有典型的腺上皮特征。结论 成功地建立了人鼻粘膜腺体细胞的悬浮培养模型。
Floating culture of human nasal glandular cells GUO Yongqing，YANG Zhanquan，BU Guoxuan. Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, Third Clinical College of Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130031
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【Abstract】 Objective To establish a floating cultural model of human nasal glandular (HNG) cells.Methods HNG cells were cultured on floating collagen gels.Results Cultured HNG cells incubated with monoclonal antibody for cytokeratin stained positively. After two-week culture, the cells stained blue by AB-PAS staining. Transmission electron microscopy showed that the cells exhibited numerous microvilli on their surfaces and had numerous secretary granules. They were well polarized and interconnected by junctional complexes. Cultured HNG cells possessed typical characteristics of normal epithelium.Conclusion The floating cultural model of HNG was successfully established.
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粘液分泌在呼吸道防御机制中起重要作用[1,2]，探讨正常及病理状态下的粘液分泌，细胞培养是不可缺少的研究手段。传统的单层细胞培养，细胞分化很差，失去正常机体细胞的生理功能，细胞外基质的应用为促进体外培养细胞的分化开辟了新的道路。我们对人鼻粘膜腺体(human nasal gland, HNG)细胞进行胶原凝胶(collagen gels, CG)悬浮培养，建立HNG细胞的分化模型，为进一步探讨HNG细胞分泌、增生的生理及病理学机制提供研究手段。
材料和方法
一、胶原凝胶上悬浮培养
标本来源于功能性鼻窦内窥镜手术切除的鼻息肉组织。HNG细胞的分离与原代培养采用Fulrukawa等[3]方法。经过5～7 d的原代培养，细胞完全融合后，用胰酶-EDTA消化，离心后加入到无血清培养液中，制备单细胞悬液，使用12孔培养板，每孔加0.5 ml(含1×105个细胞)到CG上，制备CG的材料来源于日本Nitta Gellatin公司提供的试剂盒。培养液中含50% DMEM(Dulbecco＇s Modified Eagle＇s Medium)培养液，50% Ham＇s F-12培养液，并加入以下激素及生长因子 (Sigma, 美国),10 mg/L胰岛素，5 mg/L转铁蛋白，20 μg/L 三碘甲状腺氨酸，0.36 mg/L氢化可的松,7.5 mg/L内皮细胞生长因子, 25 μg/L表皮生长因子, 0.1 μmol/L维生素A酸，20 μg/L霍乱毒素。5%CO2、95%空气条件下培养12 h后，去除未贴壁的细胞及培养液，更换新的培养液，经1周左右细胞融合后完全分离贴附于孔壁的凝胶，使其悬浮于培养液中，每3 d换液1次。
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二、抗人角蛋白单克隆抗体免疫组化染色
培养1周后完全融合的细胞，经胰酶-EDTA消化后，作成单细胞悬液，将细胞离心于玻片上，自然干燥后，用丙酮固定。采用免疫组化ABC法,正常稀释血清作用20 min，鼠抗人角蛋白单克隆抗体(AE1/AE3)作用60 min，生物素标记的二次抗体作用60 min，PBS 洗10 min, ABC-AP试剂作用30 min，碱性磷酸酶底物作用30 min，对比染色，封片。
三、AB(pH 2.5)-PAS染色
CG上悬浮培养2周的细胞经10%甲醛固定，石腊包埋，具体染色步骤为：二甲苯脱腊，水化(100%、95%、90%、70%酒精各5min)，蒸流水洗5min，阿森蓝(Alcian blue，pH 2.5) 30 min，0.3%Na2CO3 30 min，1%过碘酸10 min，席夫试剂30 min，0.5%亚硫酸氢钠2 min 3次，苏木精1.5 min，1%盐酸3 min，1%碳酸锂3 min，脱水、透明、封片。
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四、透射电镜观察
培养2周的细胞经2.5%戊二醛，1%锇酸固定后,系列酒精脱水、浸透(丙酮∶Epon为1∶1)、Epon 812包埋。超薄切片，电子染色, 透射电镜(型号：JSM-2 000，日本)观察。
结果
一、HNG细胞的原代单层培养
分离的细胞悬液在培养瓶中37℃放置1 h，混入的大部分纤维母细胞首先贴壁。未贴壁的腺体细胞悬液取出重新注入到I型胶原蛋白涂抹的培养瓶中继续培养，6～12 h贴壁，经1周左右细胞完全融合，融合后的细胞用胰酶-EDTA消化，混入生长的少量纤维母细胞首先被消化，吸引出之后，继续消化，消化后的细胞经鼠抗人角蛋白单克隆抗体(AE1/AE3)染色，细胞浆被染成粉红色为阳性，所有细胞均呈阳性反应，证明为上皮系细胞。
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二、 HNG细胞的悬浮培养
在CG上播种的细胞，12 h后大部分贴壁，5～7 d完全融合呈上皮系细胞特征。培养2周的石腊包埋切片经AB(pH 2.5)-PAS染色，可见大部分细胞，特别是靠近表面的细胞染成深蓝色，证明存在粘液糖蛋白的分泌(图1)。透射电镜下可见细胞之间形成典型的紧密联接，表面形成微绒毛，细胞质内可见分泌颗粒(图2)。
图1 CG悬浮培养2周的HNG细胞。AB-PAS染色×100
图2 CG上悬浮培养2周的HNG细胞的透射电镜所见。 ×5 000
讨论
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传统的上皮系细胞培养主要是在玻璃或塑料的培养皿上进行单层贴壁培养，这种方法常常造成细胞的脱分化(didifferentiation)现象，失去细胞原来所具有的生理功能。为阻止这种现象，人们不断地探索如何模拟体内的细胞生长环境促进细胞分化。I型胶原蛋白是构成细胞外基质主要成分的纤维性蛋白，广泛存在于动物皮肤、骨骼、肌腱等部位。这些组织经弱酸处理后，胶原纤维之间的结合受到破坏，胶原蛋白分子(相对分子质量3 000 000)可以溶解出来，将这种酸性溶液的pH值中和，25～37℃加温后,胶原蛋白分子之间可以结合,形成纤维状的CG，研究表明CG不仅可以促进细胞贴壁而且可以促进细胞分化[3,4]。
悬浮培养是培养在CG上的细胞经过一段时间完全融合以后，将CG与培养皿壁分离，使其悬浮于培养液中。较早地利用这一方法的是关于乳腺细胞培养，Enami等[5]发现培养在CG上的乳腺细胞，尽管在培养中加入了激素成份，仍无乳汁蛋白的分泌，所以认为CG本身不具有细胞分化作用。但当悬浮培养后，在激素的存在下，诱导产生了大量的乳汁蛋白分泌，所以CG的悬浮对于细胞分化有很重要意义。CG悬浮培养能够促进细胞分化的机理尚未完全明确，可能与以下因素有关，CG悬浮后，首先产生的变化是随着时间的推移CG不断收缩，直径变小；从细胞形态来看，CG悬浮之前细胞呈扁平状态，悬浮后细胞形成柱状或立方体形态，这一细胞形态的变化是与CG的收缩同时发生，而无细胞生长的CG本身并不发生收缩，说明柱状上皮细胞本来具有向柱状方向生长的力量，在这个力量作用之下CG才发生收缩。因此细胞形态的变化可能为诱导细胞分化的因素之一。促进细胞分化的另一个因素是细胞的极性(polarity)，CG悬浮后，上方生长细胞的CG飘浮于培养液中，细胞的营养成份由基底侧吸收，与正常机体细胞的生长方式相似。我们采用CG上悬浮浮培养，结果证明培养的HNG细胞呈上皮系细胞特征，经抗角蛋白单克隆抗体AE1/AE3染色呈阳性反应。经过2周的培养，出现分泌粘液糖蛋白的表型分化，经AB-PAS染色染成深蓝色。透射电镜下可见明显的分泌颗粒，细胞膜表面生长微绒毛，细胞膜之间形成明显的紧密联接，具有典型的腺上皮特征。这一模型的成功建立为进一步探讨HNG细胞分泌、增生的生理及病理学机制提供研究手段。
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《参考文献》
[1] Kaliner M, Shelhamer JH, Borson B, et al. Human respiratory mucus. Am Rev Respir Dis, 1986,134: 612-621.
[2] Reid L. Measurement of the bronchial mucous gland layer: a diagnostic yardstick in chronic bronchitis. Thorax,1963, 15: 132-141.
[3] Fulrukawa M, Yamaya M, Ikeda K, et al. Culture and characterization of human nasal gland cells. Am J Physiol 271(Lung cell Mol Physiol15), 1996,126:2027-2034.
, http://www.100md.com
[4] Clark AB, Randell SH, Nettesheim P, et al. Regulation of ciliated cell differentiation in cultures of rat tracheal epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol, 1995,12:329-338.
[5] Enami J, Yang J, Nandi S. Floating culture of mouse mammary epithelial cells on collagen gels. Cancer Letters, 1977,6: 99-105.
(收稿：1998-01-12 修回：1998-10-30)
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