作者：陈阳 王锦玲 黄维国 乔莉 刘顺利 稽宪生
单位：稽宪生，基金班研究生 西安 第四军医大学附属西京医院耳鼻咽喉科 710032
关键词：庆大霉素类；；去铁胺；；药物相互作用；；中毒；；听力障碍
中华耳鼻咽喉科杂志990308 【摘要】 目的 探讨铁螯合剂甲磺酸去铁胺(deferoxamine mesylate, DFO)对抗庆大霉素(gentamicin，GM)耳毒性作用及其机理。方法 豚鼠随机分为GM组(17只)、DFO组(8只)、GM+DFO组(17只)及对照组(8只)，采用听性脑干反应(acoustic brainstem response，ABR)、耳蜗铺片及透射电镜技术，观察用药前后听反应阈及形态学变化，检测血清尿素氮、肌苷以及GM浓度，同时测定耳蜗和肾皮质组织中丙二醛、超氧化物歧化酶和铁离子含量。结果 GM组8 kHz ABR阈移为40～60 dB；GM+DFO组阈移为15～25 dB，差异有显著性(P<0.05)。形态学改变与听力变化一致。DFO对GM血药浓度没有影响。GM组肾功明显损伤,但肾皮质丙二醛、超氧化物歧化酶和铁离子变化差异无显著性(P>0.05)，GM+DFO组耳蜗组织丙二醛和铁离子含量较GM组明显减少(P<0.05)，超氧化物歧化酶含量明显高于GM组(P<0.05)。结论 自由基和铁离子在GM的耳毒性中起重要作用，DFO能有效减轻GM的耳毒性作用，可能成为有希望的预防药物。
Deferoxamine protects against gentamicin ototoxicity
CHEN Yang, WANG Jinling,HUANG Weiguo,et al. Department of Otorhinolaryngology, XiJing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032
【Abstract】 Objective To study the prevention of gentamicin(GM) ototoxicity by deferoxamine(DFO) in the guinea pig. Methods Guinea pigs were randomly assigned to three experimental groups (GM-treated alone, DFO-treated alone, GM and DFO in combination) and one control group. Acoustic brainstem response (ABR), the surface preparation and transmission electron microscopy were utilized to evaluate the hearing thresholds and the cochlear morphology. To explore the mechanism associated with deferoxamine protection, serum levels of GM, BUN and Cr, together with concentration of MDA, SOD and iron in cochlear and renal tissues were measured. Results The GM group developed up to 40 ～60 dB of the threshold shifts at 8 kHz while the GM+DFO group developed only 15 ～25 dB of the threshold shifts (P<0.05). Morphological changes were consistent with functional changes. DFO did not alter serum levels of GM. Renal function of GM group was damaged obviously. However, changes of MDA, SOD and iron were not significant (P>0.05). MDA and iron concentrations in cochlear tissue of the GM+DFO group were significantly lower than those in the GM group (P<0.05) while SOD level was much higher than that in GM group. Conclusion This study suggests that free radical and iron involve in GM ototoxicity and DFO may become a promising therapeutic agent that can be used to reduce gentamicin ototoxicity.
【Key words】 Gentamicins Poisoning Hearing disorders Deferoxamine Drug interactions
Priuska等
[1]提出庆大霉素(gentamicin，GM)耳毒性可能是由于GM在体内形成GM-铁复合物，催化产生自由基而损伤毛细胞。自由基清除剂和铁螯合剂可以减轻GM 引起的听力损害
[2]。本实验通过ABR检测、耳蜗铺片及透射电镜技术，观察豚鼠用药前后听反应阈及耳蜗毛细胞、血管纹的改变，观察铁螯合剂甲磺酸去铁胺(deferoxamine mesylate,DFO)对抗GM耳毒性的作用；同时检测耳蜗和肾皮质组织丙二醛、超氧化物歧化酶和铁离子的含量，测定血清GM和尿素氮、肌苷水平，以探讨其可能的作用机理及其与肾毒性的关系。
材料及方法
1.实验动物：耳廓反射正常的健康雄性杂色豚鼠50只，体重250～350 g，随机分成4组。 GM组17只：硫酸庆大霉素(西北第二合成药厂生产，批号970818) 120 mg/kg皮下注射，每天1次，连续19 d；DFO组8只：DFO(Sigma公司，美国，密西根大学医学中心Kresge听力研究所提供) 每次100 mg/kg皮下注射，每天2次(间隔4 h)，连续19 d；GM+DFO组17只：GM和DFO同时注射，4 h后注射DFO，剂量同上；对照组 8只：生理盐水等量皮下注射，每天1次，连续19 d。 动物实验期间每天秤体重以调整药量。
2.ABR检测听反应阈：用药前及用药后第9和19 d、第28和42 d周检测双耳ABR。动物在戊巴比妥钠 40 mg/kg 腹腔注射麻醉后，针型记录电极置前额正中皮下，参考电极置测试耳外耳道口后上皮下，鼻尖接地。用SS-1型声刺激器，286计算机自动采样，采用短声(click)1、2、4、8 kHz刺激，间隔75 ms，扫描时间20 ms，叠加256次，带通滤波80～1 500 Hz，在屏蔽隔声室内常规测试。
3.透射电镜标本制备：停药后第2 d检测ABR后各组随机取4 只动物断头处死，每只动物各取1耳，听泡置2.5%戊二醛内，解剖显微镜下摘除镫骨，刺破圆窗，挑开蜗顶，灌流固定后浸渍固定24 h，磷酸缓冲液漂洗后解剖标本，取出各回基底膜及血管纹，1%锇酸后固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，铀铅染色。
4.耳蜗硬铺片标本制备：取材时间同上，另1耳听泡硝酸银染色法常规制备
[3]。
5.微生物纸片扩散法测定庆大霉素血药浓度
[4]：GM组和GM+DFO组动物第9和19 d注射庆大霉素后 1 h剪爪取血，测定血清抑菌环直径，再查标准曲线图，得出血清庆大霉素浓度。
6.检测肾功：取样时间和方法同上，全自动生化检测仪(日立公司, 日本)测定血清尿素氮和肌苷。
7.检测耳蜗和肾皮质的丙二醛、超氧化物歧化酶和铁：GM组和GM+DFO组第9和19 d各取3只动物活杀，迅速取出耳蜗，双耳合为1份标本制成匀浆，4 000 r/min离心10 min，取上清液-20 ℃冻存。采用南京建成生物研究所的丙二醛、超氧化物歧化酶和考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，按说明操作检测；原子吸收分光光度计(天津第一医疗器材设备厂)检测铁的含量。统计学处理用方差分析。
结果
1.实验中GM组3只动物分别于用药第11、18和19 d死亡，死前均消瘦、无力、耳廓反射消失，其余各组无死亡。第19 d对照组平均增长35 g，而GM组动物体重平均减少2 g, 差异有显著性(P<0.05)；停药后GM组动物恢复体重增长。GM+DFO组、DFO组第19 d体重平均增长33g和31g，和对照组之间比较差异无显著性(P>0.05)。
2.ABR检测：豚鼠的ABR以Ⅲ波最著，因此以Ⅲ波判断ABR反应阈(dB SPL)，用药后各组动物ABR平均反应阈移见图1。虽然实验动物对药物的反应具有个体差异，但GM+DFO组反应阈损害较GM组明显减轻。用药后第4周，GM组4 kHz及8 kHz反应阈平均(
±s，下同)升高(44±18)dB及(60±17)dB，而GM+DFO组则分别为(16±5)dB及(21±5)dB，两组差异有显著性(P<0.05)。损伤具有频率差异，高频损伤明显比低频损伤严重(P<0.01)。DFO组和对照组反应阈变化不明显(P>0.05)。
图1 用药后各组动物不同频率短声刺激的ABR平均阈移
3.耳蜗铺片及透射电镜所见：耳蜗铺片显示GM组用药后3排外毛细胞损伤明显比GM+DFO组重(图2,3)，且从顶回至底回逐渐加重，外毛细胞损伤较内毛细胞重。透射电镜见GM组耳蜗毛细胞胞浆细胞器减少，呈空泡变性(图4)；GM+DFO组则显示损伤较轻，线粒体完整，出现一些多泡体结构(图5)。GM组还可见耳蜗传入神经突触线粒体空化，血管纹边缘细胞突起中的少数线粒体亦出现嵴减少、空化。DFO组与对照组用药前后耳蜗铺片及透射电镜改变不明显。
图2 耳蜗铺片见GM组第二回外毛细胞损伤明显，仅有少数残留，内毛细胞亦见损伤。×400
图3 耳蜗铺片见GM+DFO组第二回外毛细胞损伤较轻，内毛细胞无缺失。×400
图4 透射电镜观察GM组毛细胞胞浆稀疏呈空泡变性，胞核浓缩。×6000
图5 透射电镜观察GM+DFO组毛细胞胞浆丰富，有多个多泡体形成。×4000
4.血清检测：GM组和GM+DFO组动物的血清GM浓度差异无显著性(P>0.05)。第9 d测定值(
±s，下同)分别为(75±12) mg/L和(80±9) mg/L，第19d测定值分别为(110±12) mg/L和(114±9) mg/L。GM组第19 d血清尿素氮和肌苷分别为(28.34±4.3)mmol/L和(93.39±15.8)mmol/L，GM+DFO组分别为 (11.48±5.6) mmol/L和(45.47±12.8) mmol/L，两组间差异有显著性(P<0.05)。
5. 耳蜗和肾皮质的丙二醛、超氧化物歧化酶和铁检测： GM+DFO组耳蜗组织第9和19 d的铁离子平均含量为5.01μmol/L和5.21μmol/L，低于GM组9.70μmol/L和8.21μmol/L，差异均有显著性(P<0.05)；GM+DFO组耳蜗组织同期的丙二醛平均含量为2.43和2.83 mmol/mg蛋白，低于GM组3.83和4.78 mmol/mg蛋白，差异有显著性(P<0.05)；GM+DFO组第9 d超氧化物歧化酶含量则显著高于GM组(P<0.05)，分别为4 351和2 480 U/mg蛋白(nitris unit)。两组肾皮质组织丙二醛、超氧化物歧化酶和铁含量差异无显著性(P>0.05)。此外，第19 d可见GM组3只动物的肾脏肿大如球状，呈亮黄色。
讨论
DFO是一种螯合剂，主要与铁离子和三价铝离子形成复合物，其复合物形成常数分别为1031和1025。这两种复合物通过胆汁和尿可完全排泄，因此而减少铁或铝在器官的病理性沉积。临床用于治疗输血所致的含铁血黄素沉着病和地中海贫血等急、慢性铁中毒
[5] 。临床曾报道DFO作长期治疗时，尤其所用剂量超过推荐剂量和/或其剂量未按低血清铁蛋白或血清铝浓度而调整时，可引起视力、听力障碍。也有研究证明其长期服用的安全性
[6]。本实验所用庆大霉素为临床应用的20倍，而DFO只是临床剂量的2～4倍，DFO组听反应阈在整个实验过程中保持稳定，表明其安全无毒性。停药后1周听力损害达到顶峰，GM+DFO组8 kHz听反应阈平均较GM组降低31.5 dB，1 kHz也降低了11 dB(P<0.05) ，耳蜗毛细胞的形态学损伤与听反应阈升高的程度相平行。这与Song等
[7]的结果一致，说明DFO能有效减轻GM的耳毒作用，成为有希望的预防药物。而且这种保护作用不影响GM的血药浓度，仍能保持GM的抗菌效力。与以往的报道相同，GM的听力损害以高频尤为敏感，8 kHz首先出现反应阈升高，且损失较中、低频为甚(P<0.01)。因此，高频听反应阈的升高可早期预示GM的耳毒性。
有关氨基糖甙类抗生素的耳毒性机理的学说很多，尚未完全明了，其中之一为自由基学说。1981年Pierson等
[8]报道自由基清除剂WR2721可延缓卡那霉素耳中毒的发生，并减轻听力损失程度。但随后各家实验的结果不相一致，不同的自由基清除剂治疗得到不同的结果。Garets等
[9]和Lautermann等
[10]都证实谷氨酰胺可减轻庆大霉素耳毒性，但仅对疾病状态下或营养缺乏的动物有效。这表明应用自由基清除剂防护庆大霉素耳毒性作用的不确定性。机体内的氧自由基由酶系统和非酶系统产生某些复合物催化的Haber-Weiss反应，由铁离子提供电子产生羟自由基是其中一条重要途径。Priuska等
[1]提出GM的耳毒作用是通过与游离铁离子形成复合物，催化产生自由基的反应而发挥耳毒性作用。自由基可通过生物膜中不饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤，并因此形成脂质过氧化物，如：醛基(丙二醛)、酮基、羟基、羰基等。因而测试丙二醛含量常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。
本实验结果证实铁螯合剂DFO能明显减轻GM对豚鼠的听力损害。DFO+GM组的耳蜗组织丙二醛和铁离子含量都显著低于GM组，说明丙二醛和铁离子可能在GM耳毒机理中起重要作用。DFO+GM组的耳蜗组织超氧化物歧化酶含量显著高于GM组(P<0.05)， 间接反映了DFO的保护作用与自由基有关。实验结果GM组肾功有明显损伤，而两组肾皮质组织丙二醛、超氧化物歧化酶和铁离子含量差异无显著性(P>0.05)，表明GM的肾毒性可能还有更复杂的作用机理，有待进一步研究。
参考文献
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(收稿：1998-11-06 修回：1999-03-02)
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