维甲酸对人喉鳞癌裸鼠移植瘤的治疗观察
作者：尚虹 王强 孙连玉 徐如武 李潮 张本 李辉 盖默然
单位：121001辽宁省锦州医学院附属第一医院耳鼻咽喉科(尚虹、王强、孙连玉、张本、盖默然)，胸外科(徐如武)，病理科(李潮、李辉)
关键词：喉肿瘤；；维甲酸；；药物筛选试验；抗肿瘤；；原癌基因蛋白质c-myc类
中华耳鼻烟喉科杂志990403 摘要 目的 寻求有效的喉癌辅助治疗方法，研究全反式(all-trans)维甲酸 ( retinoic acid, RA)在体内的抗肿瘤作用。方法 利用人喉鳞癌瘤系PHC3制造裸鼠喉癌模型(裸鼠16只, 实验治疗组和对照组各8只)，观察RA治疗荷喉癌裸鼠的疗效，并在光镜及透射电镜下观察RA作用后肿瘤组织显微及超微结构，免疫组化检测肿瘤细胞c-myc蛋白的阳性率。结果 治疗组肿瘤生长明显受到抑制，抑制率达50%以上(P<0.05)。光镜及透射电镜观察发现，RA治疗组裸鼠移植人喉癌细胞有一定程度的良性趋向分化。免疫组化检测肿瘤细胞c-myc蛋白的阳性率，治疗组(34.0%±10.6%)与对照组(60.5%±15.2%)相比差异有显著性(P<0.01)。结论 维甲酸对裸鼠移植人喉癌有生长抑制及诱导分化作用，且与c-myc癌基因及蛋白的调控有关。
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The experimental treatment of laryngeal carcinoma with all-trans retinoic acid
SHANG Hong, WANG Qiang, SUN Lianyu,et al.
The first Affiliated Hospital, Jinzhou Medical College,Jinzhou 121001
Abstract Objective To investigate whether all-trans retinoic acid (RA)has antitumor effect in vivo. Methods Sixteen nude mice were transplanted with human laryngeal cell carcinoma PHC3. Eight of them were injected with RA intraperitoneally and others with solvent as the control. Response was measured and tumor histopathological features were studied. Results The growth and weight of RA-treated tumors were significantly reduced in comparison with those of the control. The growth inhibition rate reached more than 50% in the RA group. Studies also showed that RA-treated cells became well-differentiated. There was a significant decrease of c-myc protein level in the RA treated tumors as compared with the control. Conclusion It is suggested that RA could induce differentiation of human laryngeal carcinoma cells and suppress tumor growth in vivo. Regulation of c-myc gene or protein may be related to those happening.
, 百拇医药
Key words Laryngeal neoplasms Tretinoin Drug screening assays, antitumor Proto-oncogene proteins c-myc
维甲类化合物是维生素A及其合成的包括维甲酸( retinoic acid, RA)在内的衍生物的统称。研究表明，维甲类化合物对肿瘤细胞具有抑制恶性表型表达和诱导分化的活性[1]。维甲酸在体外对白血病，鳞状细胞癌等多种肿瘤细胞的生长有明显的抑制作用[2,3]。为了解维甲酸在体内是否也具有抗肿瘤作用，我们进行了维甲酸在动物体内抗肿瘤作用的实验，同时还观察了维甲酸对c-myc蛋白表达的调控作用。
材料及方法
一、 动物
4～5周龄BALB/C裸小鼠16只由北京肿瘤研究所动物室提供并饲养,均为雌性,裸鼠室恒温18～22℃,恒湿(50～80)%,密闭无菌环境,自由摄取无菌水和60钴照射灭菌标准饲料。
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二、人喉鳞癌裸鼠移植瘤系PHC3
人喉鳞癌瘤系PHC3由北京医科大学第一临床学院耳鼻咽喉科实验室建立,来自一男性声门上型喉中分化鳞癌[4] 。裸鼠体内稳定传代。
三、肿瘤接种
14代PHC3 瘤组织块复苏后,经裸鼠传两代,15代16代PHC3组织形态学、超微结构及c-myc基因蛋白表达一致。将16代PHC3 裸鼠移植瘤块剪切成1 mm3 大小,用套管针接种0.2 cm3 瘤块于裸鼠右胁部皮下,成为荷瘤动物。
四、肿瘤治疗
全反式维甲酸由上海第六制药厂提供,使用时加吐温80数滴研磨后,适量生理盐水制成混悬液备用。
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16只荷瘤裸鼠随机均分成2组。治疗组于肿瘤接种后24 h开始第1次,以后每周3次,裸鼠腹腔注射维甲酸,每次15mg/kg,对照组只给等量的溶剂。每周用卡尺测量肿瘤长、宽、高。实验6周末处死动物,完整剥取肿瘤称重,常规电镜超薄切片制作。肿瘤及动物肝、脾、肺、肾进行石蜡包埋切片,常规HE染色。
五、 SP免疫组化染色
鼠抗人c-myc蛋白单克隆抗体及免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术公司。染色程序:切片常规处理至水,3%H2O210 min,阻断内源性过氧化物酶；0.1%胰蛋白酶37℃消化10 min；10%羊血清孵育20 min；滴加第一抗体(1:100)4℃过夜；滴加生物素化羊抗鼠IgG(1:200) 37℃10 min；滴加辣根酶标记的链霉亲合素(1:200)37℃10 min。每步抗体孵育后以PBS液洗3次,每次5 min；DAB显色,苏木素复染,封片,显微镜下观察。以PBS代替第一抗体为阴性对照。
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六、统计学处理
统计学处理采用t检验。
结果
一、 RA对裸鼠喉癌移植瘤的抑制作用
每周测量肿瘤,用下列公式计算肿瘤体积:肿瘤体积=2/3(长×宽×高),绘肿瘤生长曲线(图1)。治疗组所荷肿瘤生长较对照组缓慢,肿瘤体积增长始终低于对照组。
图1 裸鼠移植瘤生长曲线
称肿瘤重量,按下列公式计算抑瘤率: 抑瘤率=(1-治疗组肿瘤重量/对照组肿瘤重量)×100%。治疗组肿瘤重量及体积均明显低于对照组,抑瘤率达50%以上(表1)。
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表1 实验6周末RA对喉癌模型的治疗效果(
±s) 分组
动物数
肿瘤体积(cm3 )
肿瘤重量(g)
对照组
8
0.232±0.110
0.193±0.092
治疗组
8
0.112±0.065
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0.090±0.056
抑瘤率(%)
51.7
53.4
t值
2.65
2.71
P值
<0.05
<0.05
二、肿瘤形态学改变
分别观察8只裸鼠治疗组和对照组喉癌细胞,每一例随机取一个光镜和电镜视野进行观察。组织形态学改变:治疗组癌细胞较对照组排列规整，核浆比例减小，核分裂像不明显。间质纤维组织增多，可见淋巴细胞浆细胞浸润。有明显坏死灶。
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超微结构改变：治疗组细胞群体表现为微绒毛明显减少或消失,细胞外形较规整。桥粒、张力原纤维丰富,核质比例较对照组为小,核仁单个,较小,核膜光滑,规整。染色质于核膜下聚集成块,胞质内分泌空泡增加,核蛋白较少,线粒体等细胞器较多,有的线粒体肿胀,嵴模糊(图2)。对照组细胞群体表现为细胞间隙增宽,微绒毛丰富,桥粒及胞质中张力原纤维存在。细胞核大而不规则。核仁大,有时出现两个以上核仁,核浆比例大。染色质无凝集成块现象(图3)。
图2 治疗组细胞群体表现为微绒毛明显减少或消失,细胞外形较规整。染色质于核膜下聚集成块,胞质内分泌空泡增加。×10 000 图3 对照组细胞群体表现为细胞间隙增宽,微绒毛丰富，细胞核大而不规则。桥粒及胞质中张力原纤维存在。×10 000
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三、 肿瘤c-myc蛋白表达的改变
经SP免疫组化染色,肿瘤细胞c-myc蛋白产物被染成棕黄色(图4,5),主要定位在癌细胞浆内及核周，每张切片中随机观察200个细胞，计数阳性细胞。对照组和实验治疗组均可见阳性细胞，其阳性率分别为(60.5±15.2)%与(34.0±10.6)%,两组比较差异有显著性(P<0.01)。
图4，5 移植瘤细胞c-myc蛋白产物被染成棕黄色。对照组(图4)和实验组(图5)阳性率分别为(60.5±15.2)%与(34.0±10.6)%,两组比较差异有显著性。SP免疫组化染色×400
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四、实验治疗组裸鼠肝、脾、肺、肾光镜观察未见异常。
讨论
裸鼠人癌移植模型保持原发瘤结构及分化特点, 具有生物学特性稳定,移植成功率高,便于观察等优点,为此,本实验在人喉鳞状细胞癌裸鼠移植模型上观察了RA的抗肿瘤作用。研究已表明,RA在体外抑制头颈鳞状细胞癌细胞系的生长[3],本实验结果表明RA在裸鼠体内对人喉癌移植瘤同样有明显的抑制作用,RA治疗组的荷瘤动物肿瘤生长较对照组明显缓慢,抑瘤率达50%以上。在抑制剂量下对宿主主要脏器无损害。因此,RA在本实验剂量下抗肿瘤治疗有效而安全,本实验为进一步进行RA的临床抗肿瘤研究提供了重要的参考资料。
形态学上的分化成熟是表明肿瘤细胞分化的标志[5],细胞形态学改变是细胞分化的表型特征及基本特征[6],本实验观察结果,治疗组与对照组比较,有喉癌细胞排列较规整，癌细胞核浆比例较小，间质纤维组织增多，淋巴细胞浆细胞浸润，微绒毛减少,桥粒增多,核质比例变小,核外形规整,细胞器增多等特征,表明RA可诱导裸鼠移植人喉癌细胞有一定程度的良性分化。至于治疗后细胞分泌空泡增加,这与RA促进细胞分泌有关[7]。而治疗组喉癌组织内有坏死灶及线粒体肿胀变性提示RA尚有轻微的致喉癌细胞退变,破坏肿瘤细胞的作用。RA具有诱导肿瘤良性分化的特性,预示诱导分化治疗将成为抗肿瘤治疗方法之一。
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肿瘤的生长和分化是受基因调控的相对复杂的过程。本实验用SP免疫组化方法研究表明RA治疗组与对照组c-myc蛋白表达差异有显著性,提示RA可以调节c-myc蛋白的表达。这与Murtaugh 等[8]和Levine等[9]报道的维甲类抑制c-myc癌基因表达结果一致。同时表明RA对裸鼠移植人喉癌细胞生长抑制和诱导分化作用可能是通过抑制c-myc基因及蛋白实现的。
本课题为辽宁省教委资助项目
参考文献
1 Sporn MB,Roberts AB. Role of retinoids in differentiation and carcinogenesis.J Natl Cancer Inst, 1984,73:1381-1387.
2 Yen A,Powers V，Fishbaugh J. Retinoic acid induced HL-60 myeloid differentiation:dependence of early and late isomeric structure. Leuk Res, 1986,10:619-629.
, http://www.100md.com
3 Jetten AM, Kim JS,Sacks PG,et al.Inhibition of growth and squamous-cell differentiation markers in cultured human head and neck squamous carcinoma cells by β-all-trans retinoic acid. Int J Cancer,1990, 45:195-202.
4 韩德宽,张滨学,王洁良,等.人喉癌裸鼠移植瘤系的建立.中华耳鼻咽喉科杂志,1993,28:154-156.
5 Cheson RD,Jasperse DM,Chun HG,et al.Differentiating agents in the treatment of human malignancies. Cancer Treat Rev,1986,13:129-145.
, 百拇医药
6 汤钊猷.现代肿瘤学 .上海:上海医科大学出版社,1993.157-167.
7 Brown R,Gray RH，Bernstein IA.Retinoids alter the direction of differentiation in primary cultures of cutaneous keratinocytes. Differentiation, 1985,28:268-278.
8 Murtaugh MP,Dennison O，Stein JP，et al.Retinoic acid-induced gene expression in normal and leukemic myeloid cells. J Exp Med ,1986,163:1325-1330.
9 Levine RA,LaRosa GJ，Gudas LJ. Isolation of cDNA clones for gene exhibiting reduced expression after differentiation of murine teratocarcinoma stem cells. Mol Cell Biol,1984,4:2142-2150.
(收稿：1999-01-10 修回：1999-04-27), 百拇医药
单位：121001辽宁省锦州医学院附属第一医院耳鼻咽喉科(尚虹、王强、孙连玉、张本、盖默然)，胸外科(徐如武)，病理科(李潮、李辉)
关键词：喉肿瘤；；维甲酸；；药物筛选试验；抗肿瘤；；原癌基因蛋白质c-myc类
中华耳鼻烟喉科杂志990403 摘要 目的 寻求有效的喉癌辅助治疗方法，研究全反式(all-trans)维甲酸 ( retinoic acid, RA)在体内的抗肿瘤作用。方法 利用人喉鳞癌瘤系PHC3制造裸鼠喉癌模型(裸鼠16只, 实验治疗组和对照组各8只)，观察RA治疗荷喉癌裸鼠的疗效，并在光镜及透射电镜下观察RA作用后肿瘤组织显微及超微结构，免疫组化检测肿瘤细胞c-myc蛋白的阳性率。结果 治疗组肿瘤生长明显受到抑制，抑制率达50%以上(P<0.05)。光镜及透射电镜观察发现，RA治疗组裸鼠移植人喉癌细胞有一定程度的良性趋向分化。免疫组化检测肿瘤细胞c-myc蛋白的阳性率，治疗组(34.0%±10.6%)与对照组(60.5%±15.2%)相比差异有显著性(P<0.01)。结论 维甲酸对裸鼠移植人喉癌有生长抑制及诱导分化作用，且与c-myc癌基因及蛋白的调控有关。
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The experimental treatment of laryngeal carcinoma with all-trans retinoic acid
SHANG Hong, WANG Qiang, SUN Lianyu,et al.
The first Affiliated Hospital, Jinzhou Medical College,Jinzhou 121001
Abstract Objective To investigate whether all-trans retinoic acid (RA)has antitumor effect in vivo. Methods Sixteen nude mice were transplanted with human laryngeal cell carcinoma PHC3. Eight of them were injected with RA intraperitoneally and others with solvent as the control. Response was measured and tumor histopathological features were studied. Results The growth and weight of RA-treated tumors were significantly reduced in comparison with those of the control. The growth inhibition rate reached more than 50% in the RA group. Studies also showed that RA-treated cells became well-differentiated. There was a significant decrease of c-myc protein level in the RA treated tumors as compared with the control. Conclusion It is suggested that RA could induce differentiation of human laryngeal carcinoma cells and suppress tumor growth in vivo. Regulation of c-myc gene or protein may be related to those happening.
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Key words Laryngeal neoplasms Tretinoin Drug screening assays, antitumor Proto-oncogene proteins c-myc
维甲类化合物是维生素A及其合成的包括维甲酸( retinoic acid, RA)在内的衍生物的统称。研究表明，维甲类化合物对肿瘤细胞具有抑制恶性表型表达和诱导分化的活性[1]。维甲酸在体外对白血病，鳞状细胞癌等多种肿瘤细胞的生长有明显的抑制作用[2,3]。为了解维甲酸在体内是否也具有抗肿瘤作用，我们进行了维甲酸在动物体内抗肿瘤作用的实验，同时还观察了维甲酸对c-myc蛋白表达的调控作用。
材料及方法
一、 动物
4～5周龄BALB/C裸小鼠16只由北京肿瘤研究所动物室提供并饲养,均为雌性,裸鼠室恒温18～22℃,恒湿(50～80)%,密闭无菌环境,自由摄取无菌水和60钴照射灭菌标准饲料。
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二、人喉鳞癌裸鼠移植瘤系PHC3
人喉鳞癌瘤系PHC3由北京医科大学第一临床学院耳鼻咽喉科实验室建立,来自一男性声门上型喉中分化鳞癌[4] 。裸鼠体内稳定传代。
三、肿瘤接种
14代PHC3 瘤组织块复苏后,经裸鼠传两代,15代16代PHC3组织形态学、超微结构及c-myc基因蛋白表达一致。将16代PHC3 裸鼠移植瘤块剪切成1 mm3 大小,用套管针接种0.2 cm3 瘤块于裸鼠右胁部皮下,成为荷瘤动物。
四、肿瘤治疗
全反式维甲酸由上海第六制药厂提供,使用时加吐温80数滴研磨后,适量生理盐水制成混悬液备用。
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16只荷瘤裸鼠随机均分成2组。治疗组于肿瘤接种后24 h开始第1次,以后每周3次,裸鼠腹腔注射维甲酸,每次15mg/kg,对照组只给等量的溶剂。每周用卡尺测量肿瘤长、宽、高。实验6周末处死动物,完整剥取肿瘤称重,常规电镜超薄切片制作。肿瘤及动物肝、脾、肺、肾进行石蜡包埋切片,常规HE染色。
五、 SP免疫组化染色
鼠抗人c-myc蛋白单克隆抗体及免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术公司。染色程序:切片常规处理至水,3%H2O210 min,阻断内源性过氧化物酶；0.1%胰蛋白酶37℃消化10 min；10%羊血清孵育20 min；滴加第一抗体(1:100)4℃过夜；滴加生物素化羊抗鼠IgG(1:200) 37℃10 min；滴加辣根酶标记的链霉亲合素(1:200)37℃10 min。每步抗体孵育后以PBS液洗3次,每次5 min；DAB显色,苏木素复染,封片,显微镜下观察。以PBS代替第一抗体为阴性对照。
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六、统计学处理
统计学处理采用t检验。
结果
一、 RA对裸鼠喉癌移植瘤的抑制作用
每周测量肿瘤,用下列公式计算肿瘤体积:肿瘤体积=2/3(长×宽×高),绘肿瘤生长曲线(图1)。治疗组所荷肿瘤生长较对照组缓慢,肿瘤体积增长始终低于对照组。
图1 裸鼠移植瘤生长曲线
称肿瘤重量,按下列公式计算抑瘤率: 抑瘤率=(1-治疗组肿瘤重量/对照组肿瘤重量)×100%。治疗组肿瘤重量及体积均明显低于对照组,抑瘤率达50%以上(表1)。
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表1 实验6周末RA对喉癌模型的治疗效果(
±s) 分组动物数
肿瘤体积(cm3 )
肿瘤重量(g)
对照组
8
0.232±0.110
0.193±0.092
治疗组
8
0.112±0.065
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0.090±0.056
抑瘤率(%)
51.7
53.4
t值
2.65
2.71
P值
<0.05
<0.05
二、肿瘤形态学改变
分别观察8只裸鼠治疗组和对照组喉癌细胞,每一例随机取一个光镜和电镜视野进行观察。组织形态学改变:治疗组癌细胞较对照组排列规整，核浆比例减小，核分裂像不明显。间质纤维组织增多，可见淋巴细胞浆细胞浸润。有明显坏死灶。
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超微结构改变：治疗组细胞群体表现为微绒毛明显减少或消失,细胞外形较规整。桥粒、张力原纤维丰富,核质比例较对照组为小,核仁单个,较小,核膜光滑,规整。染色质于核膜下聚集成块,胞质内分泌空泡增加,核蛋白较少,线粒体等细胞器较多,有的线粒体肿胀,嵴模糊(图2)。对照组细胞群体表现为细胞间隙增宽,微绒毛丰富,桥粒及胞质中张力原纤维存在。细胞核大而不规则。核仁大,有时出现两个以上核仁,核浆比例大。染色质无凝集成块现象(图3)。
图2 治疗组细胞群体表现为微绒毛明显减少或消失,细胞外形较规整。染色质于核膜下聚集成块,胞质内分泌空泡增加。×10 000 图3 对照组细胞群体表现为细胞间隙增宽,微绒毛丰富，细胞核大而不规则。桥粒及胞质中张力原纤维存在。×10 000
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三、 肿瘤c-myc蛋白表达的改变
经SP免疫组化染色,肿瘤细胞c-myc蛋白产物被染成棕黄色(图4,5),主要定位在癌细胞浆内及核周，每张切片中随机观察200个细胞，计数阳性细胞。对照组和实验治疗组均可见阳性细胞，其阳性率分别为(60.5±15.2)%与(34.0±10.6)%,两组比较差异有显著性(P<0.01)。
图4，5 移植瘤细胞c-myc蛋白产物被染成棕黄色。对照组(图4)和实验组(图5)阳性率分别为(60.5±15.2)%与(34.0±10.6)%,两组比较差异有显著性。SP免疫组化染色×400
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四、实验治疗组裸鼠肝、脾、肺、肾光镜观察未见异常。
讨论
裸鼠人癌移植模型保持原发瘤结构及分化特点, 具有生物学特性稳定,移植成功率高,便于观察等优点,为此,本实验在人喉鳞状细胞癌裸鼠移植模型上观察了RA的抗肿瘤作用。研究已表明,RA在体外抑制头颈鳞状细胞癌细胞系的生长[3],本实验结果表明RA在裸鼠体内对人喉癌移植瘤同样有明显的抑制作用,RA治疗组的荷瘤动物肿瘤生长较对照组明显缓慢,抑瘤率达50%以上。在抑制剂量下对宿主主要脏器无损害。因此,RA在本实验剂量下抗肿瘤治疗有效而安全,本实验为进一步进行RA的临床抗肿瘤研究提供了重要的参考资料。
形态学上的分化成熟是表明肿瘤细胞分化的标志[5],细胞形态学改变是细胞分化的表型特征及基本特征[6],本实验观察结果,治疗组与对照组比较,有喉癌细胞排列较规整，癌细胞核浆比例较小，间质纤维组织增多，淋巴细胞浆细胞浸润，微绒毛减少,桥粒增多,核质比例变小,核外形规整,细胞器增多等特征,表明RA可诱导裸鼠移植人喉癌细胞有一定程度的良性分化。至于治疗后细胞分泌空泡增加,这与RA促进细胞分泌有关[7]。而治疗组喉癌组织内有坏死灶及线粒体肿胀变性提示RA尚有轻微的致喉癌细胞退变,破坏肿瘤细胞的作用。RA具有诱导肿瘤良性分化的特性,预示诱导分化治疗将成为抗肿瘤治疗方法之一。
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肿瘤的生长和分化是受基因调控的相对复杂的过程。本实验用SP免疫组化方法研究表明RA治疗组与对照组c-myc蛋白表达差异有显著性,提示RA可以调节c-myc蛋白的表达。这与Murtaugh 等[8]和Levine等[9]报道的维甲类抑制c-myc癌基因表达结果一致。同时表明RA对裸鼠移植人喉癌细胞生长抑制和诱导分化作用可能是通过抑制c-myc基因及蛋白实现的。
本课题为辽宁省教委资助项目
参考文献
1 Sporn MB,Roberts AB. Role of retinoids in differentiation and carcinogenesis.J Natl Cancer Inst, 1984,73:1381-1387.
2 Yen A,Powers V，Fishbaugh J. Retinoic acid induced HL-60 myeloid differentiation:dependence of early and late isomeric structure. Leuk Res, 1986,10:619-629.
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3 Jetten AM, Kim JS,Sacks PG,et al.Inhibition of growth and squamous-cell differentiation markers in cultured human head and neck squamous carcinoma cells by β-all-trans retinoic acid. Int J Cancer,1990, 45:195-202.
4 韩德宽,张滨学,王洁良,等.人喉癌裸鼠移植瘤系的建立.中华耳鼻咽喉科杂志,1993,28:154-156.
5 Cheson RD,Jasperse DM,Chun HG,et al.Differentiating agents in the treatment of human malignancies. Cancer Treat Rev,1986,13:129-145.
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6 汤钊猷.现代肿瘤学 .上海:上海医科大学出版社,1993.157-167.
7 Brown R,Gray RH，Bernstein IA.Retinoids alter the direction of differentiation in primary cultures of cutaneous keratinocytes. Differentiation, 1985,28:268-278.
8 Murtaugh MP,Dennison O，Stein JP，et al.Retinoic acid-induced gene expression in normal and leukemic myeloid cells. J Exp Med ,1986,163:1325-1330.
9 Levine RA,LaRosa GJ，Gudas LJ. Isolation of cDNA clones for gene exhibiting reduced expression after differentiation of murine teratocarcinoma stem cells. Mol Cell Biol,1984,4:2142-2150.
(收稿：1999-01-10 修回：1999-04-27), 百拇医药