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编号:10268970
琼脂胰岛素对体外培养人鼻中隔软骨细胞生长增殖的影响

     作者:李雪盛 黄金中

    单位:第一军医大学附属珠江医院耳鼻咽喉科 广州 510282

    关键词:

    中华耳鼻咽喉科杂志000623 观察琼脂包埋培养皿后鼻中隔软骨细胞体外单层培养的生长状况,将胰岛素作用于鼻中隔软骨细胞,了解其对软骨细胞生长的影响,为软骨组织工程提供理论参考。

    一、材料和方法

    1.软骨细胞的培养:无菌条件下取10例鼻中隔偏曲手术患者鼻中隔软骨,PBS液(含青霉素200 U/ml,链霉素200 μg/ml)漂洗3次,剪成1 mm×1 mm×1 mm大小软骨碎片,PBS液漂洗2次,加入2倍体积的Ⅱ型胶原酶(3 mg/ml,sigma公司,美国),37℃恒温震荡消化,过滤,离心,PBS液漂洗2次,离心,弃上清,1640培养基(sigma,美国。含20%新生牛血清,50 mg/L维生素C,100 U/ml青霉素,100 μg/ml链霉素,292 mg/L谷氨酰胺)悬浮细胞,血细胞计数器计数,调整细胞密度至3×105/ml,接种于培养瓶中,于37℃、含5%CO2的饱和湿空气中培养。

    2.培养器皿的包埋: 取34 g琼脂,加入1 000 ml蒸馏水微加热使溶解,高压蒸汽灭菌,备用。使用时加热使之溶解,适量倒入培养皿表面,自然冷却凝固。使用前PBS冲洗2次,紫外线消毒。

    3.胰岛素最佳作用浓度的测定:取生长状态良好的第2代软骨细胞,调整细胞密度,接种于96孔培养板,每孔细胞数为103个,共接种30孔。胰岛素终浓度按0、1、10、100、1 000、10 000 U/L(分别为对照组和1~5组)各加入5孔,每孔培养基总量为200 μL 。体外培养3 d后,每孔吸出 20 μL培养液,加入20 μL MTT(2 mg/ml),继续培养 4 h,吸出培养液,加入 DMSO 150 μL,微孔板振荡器上振荡 10 min,500型酶标仪以 405 nm为测定波长,以 655 nm为参考波长,测定各孔吸光度(A)值。由于活细胞中的脱氢酶能将MTT还原为不溶于水的蓝色产物甲月 赞(formazan),并沉淀于细胞中,二甲亚砜(DMSO)能溶解甲月 赞,溶液的颜色深浅即可代表活细胞数,测吸光度即可得知细胞的生长增殖情况。

    4.生长曲线的观察:取生长状态良好的第2代软骨细胞,调整细胞浓度1×104/ml,接种 7块 96孔培养板,每板接种 20孔,其中10孔琼脂包埋,接种细胞同上。每块板包埋与无包埋分别 5孔与含胰岛素(最佳浓度)的培养基作用,5孔以原培养基作用隔日换液。每24 h取 1块培养板,各组分别计数5孔细胞数,取其均值做为该组与该日细胞生长增殖数目,连续计数7 d,观察其生长曲线。

    5.统计方法:F检验及Dunnett-t检验。

    二、结果

    1.软骨细胞的生长状况:人鼻中隔软骨细胞接种于培养瓶中之后,12 h即有细胞贴壁,24 h绝大部分细胞贴壁。36 h后细胞细胞体积增大,胞浆伸出突起,细胞向多角形变化。琼脂包埋培养器皿表面后,软骨细胞,始终保持圆形形态,细胞生长繁殖往往集簇成团,传至第4代仍保持其圆形形态。

    2.胰岛素的最佳作用浓度:对照组和1~5组的A(±s)分别为:0.039±0.004 3,0.046±0.005 2,0.052±0.007 6,0.050±0.007 8,0.039±0.005 4,0.038±0.003 7。经F检验:各组之间有显著性差异(P<0.01),Dunnett-t检验:2、3组与对照组之间差异有显著性(分别为P<0.01、P<0.05)。即当胰岛素浓度在10~100 U/L时可明显促进人鼻中隔软骨细胞的生长。

    3.软骨细胞生长曲线:各组接种24 h细胞无明显生长,3~5 d细胞呈指数生长,6 d以后细胞数目增长变缓,进入平台期。加入胰岛素组细胞增加明显多于未加胰岛素组(P<0.05),琼脂可使细胞数目略有增加,但无统计学意义(P>0.05)。

    三、讨论

    组织工程是近年来发展起来的一门新学科,其最基本的思路是在体外分离培养细胞,将一定量的细胞种植到具有一定空间结构的三维支架上,然后将此细胞-支架复合物植入体内或在体外继续培养,通过细胞间的相互粘附、生长繁殖、分泌细胞外基质,从而形成具有一定结构和功能的组织或器官。其中将一定量的细胞在体外培养扩增,达到相当的数量并保持表型的稳定,是形成新生组织的先决条件。

    本实验证实琼脂包埋培养皿表面后,体外单层培养的软骨细胞传至 4代仍可保持其圆形形态,从而可以保持其表型的稳定。

    本实验发现胰岛素浓度在10~100 U/L时,能有效地促进人鼻中隔软骨细胞的生长。

    基金项目:广东省自然科学基金资助项目(990418)

    (收稿日期:2000-02-18)
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