先天性心脏病心脏组织中B19-DNA的检测研究
作者：王晓明 张国成 韩美玉 许东亮
单位：
关键词：
中华儿科杂志/980617
宫内病毒感染是致先天性心脏病(CHD)的重要因子，微小病毒B19(Parvovirus,B19)在育龄妇女中感染率高，且具有高达33%的母胎垂直感染率[1]。而国内外尚未见B19感染与CHD关系的研究报道，为此我们采用巢式聚合酶链反应(PCR)技术进行病例对照研究，以探讨其相关性及可能的致畸作用。
材料：29例CHD系我校病理解剖教研室1977～1996年尸解的心脏标本，石蜡包块26例；4%甲醛固定组织3例。死亡年龄最小1天，最大18岁，平均3.8岁。病种有房间隔缺损(简称房缺)5例、室间隔缺损(简称室缺)13例、法乐四联症5例、法乐五联症1例、动脉导管未闭2例、右心室双出口1例、肺动脉狭窄并房缺1例、室缺并主动脉关闭不全1例。对照组为同期非先天畸形患儿的心脏组织，死亡年龄最小1天，最大14岁，平均1.2岁。病种有新生儿窒息10例、新生儿硬肿症5例、呼吸窘迫综合症2例、肺炎合并心力衰竭12例、风湿性心脏病1例。
, 百拇医药
试剂：巢式PCR特异性内外引物[2]与B19病毒质粒由沙特皇家医院研究中心(KFSH Research Center)提供，TaqDNA聚和酶、10×PCR buffer、dNTPs系美国Promega公司产品，蛋白酶K系美国Merck公司产品，琼脂糖、PGEM Marker、弓形体(TOX)PCR试剂盒系华美生物公司产品，单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)PCR试剂盒系本校基因生物研究所提供。
DNA提取:石蜡包埋块：组织切片经正辛烷脱蜡，无水乙醇脱脂(甲醛固定标本：剪碎组织研磨成浆，TE液悬浮)，SDS及蛋白酶K裂解消化，酚、氯异戊醇抽提，无水乙醇沉淀，pH 8.0 TE液溶解，-20℃保存待检。
巢式PCR：方法同文献[2]，50 μl反应体系中双蒸水36 μl，10×PCR buffer 5 μl，4×dNTPs 1 μl，Taq酶1 U，外引物1S、2A各300 ng模板5 μl(阳性对照1 μg，阴性对照以双蒸水作模板)。PCR条件为：93℃ 50秒、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟。35个周期后72℃充分延伸10分钟。取第1次扩增产物5 ml为模板，以内引物3S、4A代替外引物，同上述反应体系及条件进行第2次PCR循环。同批用本法作猫细小病毒、腺病毒37型、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒和EB病毒巢式PCR检测，均为阴性(特异性试验)。
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结果判断：取第2次PCR循环产物10 μl加样于含溴化乙锭的2%琼脂糖中电泳40 min紫外分析仪上观察于104 bp处出现金黄色电泳带者为阳性。
结果：(1)B19-DNA：病例组29例中5例B19-DNA阳性(17%)，对照组30例标本均阴性。经Fisher′s确切概率检验，P值为0.0237，两组间差异有显著意义。(2)TORCH部分病原体的鉴别：病例组(含B19阳性5份)10份与对照组10份标本分别作单纯疱疹病毒-聚合酶链反应(HSV-PCR)、弓形体(TOX-PCR)检测全为阴性。巨细胞病毒(CMV)病例组、对照组各3例阳性，其中CHD组2例为B19合并感染(附表)
讨论：本研究首次从CHD组织中检测到B19病毒，检出率为17%，经同期非畸形死亡患儿心脏组织对照，说明B19病毒对CHD患儿感染明显高于对照组(P=0.0237)，其感染系先天性或是后天获得，因心脏组织取材所限无法直接证实，但从5例阳性的年龄分布可见生后3个月内占3例(3/5)，说明先天性感染的可能性较大。B19与CHD的发病有着密切的相关性，确切证据有待于进一步的研究。对TORCH部分病原体鉴别表明，TOX、HSV检测病例组、对照组患儿均为阴性，说明可能系西安地区TOX、HSV感染属低发区，因观察病例较少有待扩大病例研究。CMV在病例组、对照组检出率均(3/10)较高，且CHD组中2例是CMV与B19混合感染，可能增加了病毒致畸的危险度。
, http://www.100md.com
B19感染CHD的可能致病机理与其组织特异性受体有关。Brown等[3]报道的一项研究成果表明，B19的嗜红细胞特异性是因其能结合P血型抗原(即B19的细胞受体)，红细胞缺乏P抗原则不能与B19结合凝集，而抵抗B19的感染。Brown等[4]研究还表明，P抗原不仅仅局限于红细胞膜上，在巨核细胞、心肌细胞也可发现，因而导致了贫血、血小板减少、心肌炎的发生。心肌细胞P抗原的存在可能是B19病毒引起心脏疾患的生物学基础，组织细胞化学和病理生理资料[5]，也支持B19的感染亦与胎儿心脏疾病有关。B19对CHD是直接侵袭整合到细胞内影响基因表达，还是影响神经嵴的发育异常，有待于进一步研究。
参考文献
1 Public health laboratory service working party on fifth disease. Prospective study of human parvovirus (B19) infection in pregnancy. Br Med J, 1990, 300:1166-1170.
, 百拇医药
2 Musiani M, Azzi A, Zerbini M, et al. Nested polymerase chain reaction assay for the detection of B19 parvovirus DNA in human immunodeficiency virus patients. J Med Virol, 1993, 40:157-160.
3 Brown KE, Anderson SM, Young NS. Erythrocyte P antigen: cellar Receptor for B19 parvovirus. Sience, 1993, 262:114-115.
4 Brown KE, Hibbs JR, Gallinella G, et al. Resistance to parvovirus B19 infection due to lack of virus receptor (erythocyte P antigen). N Engl J Med, 1994, 330:1192-1196.
5 Barton LL, Lax D, Shehab ZM, er al. Congenital cardiomyopathy associated with human parvovirus B19 infection. Am Heart J, 1997, 133:131-133., 百拇医药
单位：
关键词：
中华儿科杂志/980617
宫内病毒感染是致先天性心脏病(CHD)的重要因子，微小病毒B19(Parvovirus,B19)在育龄妇女中感染率高，且具有高达33%的母胎垂直感染率[1]。而国内外尚未见B19感染与CHD关系的研究报道，为此我们采用巢式聚合酶链反应(PCR)技术进行病例对照研究，以探讨其相关性及可能的致畸作用。
材料：29例CHD系我校病理解剖教研室1977～1996年尸解的心脏标本，石蜡包块26例；4%甲醛固定组织3例。死亡年龄最小1天，最大18岁，平均3.8岁。病种有房间隔缺损(简称房缺)5例、室间隔缺损(简称室缺)13例、法乐四联症5例、法乐五联症1例、动脉导管未闭2例、右心室双出口1例、肺动脉狭窄并房缺1例、室缺并主动脉关闭不全1例。对照组为同期非先天畸形患儿的心脏组织，死亡年龄最小1天，最大14岁，平均1.2岁。病种有新生儿窒息10例、新生儿硬肿症5例、呼吸窘迫综合症2例、肺炎合并心力衰竭12例、风湿性心脏病1例。
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试剂：巢式PCR特异性内外引物[2]与B19病毒质粒由沙特皇家医院研究中心(KFSH Research Center)提供，TaqDNA聚和酶、10×PCR buffer、dNTPs系美国Promega公司产品，蛋白酶K系美国Merck公司产品，琼脂糖、PGEM Marker、弓形体(TOX)PCR试剂盒系华美生物公司产品，单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)PCR试剂盒系本校基因生物研究所提供。
DNA提取:石蜡包埋块：组织切片经正辛烷脱蜡，无水乙醇脱脂(甲醛固定标本：剪碎组织研磨成浆，TE液悬浮)，SDS及蛋白酶K裂解消化，酚、氯异戊醇抽提，无水乙醇沉淀，pH 8.0 TE液溶解，-20℃保存待检。
巢式PCR：方法同文献[2]，50 μl反应体系中双蒸水36 μl，10×PCR buffer 5 μl，4×dNTPs 1 μl，Taq酶1 U，外引物1S、2A各300 ng模板5 μl(阳性对照1 μg，阴性对照以双蒸水作模板)。PCR条件为：93℃ 50秒、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟。35个周期后72℃充分延伸10分钟。取第1次扩增产物5 ml为模板，以内引物3S、4A代替外引物，同上述反应体系及条件进行第2次PCR循环。同批用本法作猫细小病毒、腺病毒37型、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒和EB病毒巢式PCR检测，均为阴性(特异性试验)。
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结果判断：取第2次PCR循环产物10 μl加样于含溴化乙锭的2%琼脂糖中电泳40 min紫外分析仪上观察于104 bp处出现金黄色电泳带者为阳性。
结果：(1)B19-DNA：病例组29例中5例B19-DNA阳性(17%)，对照组30例标本均阴性。经Fisher′s确切概率检验，P值为0.0237，两组间差异有显著意义。(2)TORCH部分病原体的鉴别：病例组(含B19阳性5份)10份与对照组10份标本分别作单纯疱疹病毒-聚合酶链反应(HSV-PCR)、弓形体(TOX-PCR)检测全为阴性。巨细胞病毒(CMV)病例组、对照组各3例阳性，其中CHD组2例为B19合并感染(附表)
讨论：本研究首次从CHD组织中检测到B19病毒，检出率为17%，经同期非畸形死亡患儿心脏组织对照，说明B19病毒对CHD患儿感染明显高于对照组(P=0.0237)，其感染系先天性或是后天获得，因心脏组织取材所限无法直接证实，但从5例阳性的年龄分布可见生后3个月内占3例(3/5)，说明先天性感染的可能性较大。B19与CHD的发病有着密切的相关性，确切证据有待于进一步的研究。对TORCH部分病原体鉴别表明，TOX、HSV检测病例组、对照组患儿均为阴性，说明可能系西安地区TOX、HSV感染属低发区，因观察病例较少有待扩大病例研究。CMV在病例组、对照组检出率均(3/10)较高，且CHD组中2例是CMV与B19混合感染，可能增加了病毒致畸的危险度。
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B19感染CHD的可能致病机理与其组织特异性受体有关。Brown等[3]报道的一项研究成果表明，B19的嗜红细胞特异性是因其能结合P血型抗原(即B19的细胞受体)，红细胞缺乏P抗原则不能与B19结合凝集，而抵抗B19的感染。Brown等[4]研究还表明，P抗原不仅仅局限于红细胞膜上，在巨核细胞、心肌细胞也可发现，因而导致了贫血、血小板减少、心肌炎的发生。心肌细胞P抗原的存在可能是B19病毒引起心脏疾患的生物学基础，组织细胞化学和病理生理资料[5]，也支持B19的感染亦与胎儿心脏疾病有关。B19对CHD是直接侵袭整合到细胞内影响基因表达，还是影响神经嵴的发育异常，有待于进一步研究。
参考文献
1 Public health laboratory service working party on fifth disease. Prospective study of human parvovirus (B19) infection in pregnancy. Br Med J, 1990, 300:1166-1170.
, 百拇医药
2 Musiani M, Azzi A, Zerbini M, et al. Nested polymerase chain reaction assay for the detection of B19 parvovirus DNA in human immunodeficiency virus patients. J Med Virol, 1993, 40:157-160.
3 Brown KE, Anderson SM, Young NS. Erythrocyte P antigen: cellar Receptor for B19 parvovirus. Sience, 1993, 262:114-115.
4 Brown KE, Hibbs JR, Gallinella G, et al. Resistance to parvovirus B19 infection due to lack of virus receptor (erythocyte P antigen). N Engl J Med, 1994, 330:1192-1196.
5 Barton LL, Lax D, Shehab ZM, er al. Congenital cardiomyopathy associated with human parvovirus B19 infection. Am Heart J, 1997, 133:131-133., 百拇医药