外源性腺苷脱氨酶基因转移进入脐血细胞及其表达稳定性的初步探讨
作者：陆华中 邹萍 李崇渔
单位：430022 武汉，同济医科大学血液病学研究所
关键词：
中华儿科杂志/980614 本研究利用脂质体介导的基因转移策略将外源性腺苷脱氨酶(adenosine deaminase, ADA)基因转移进入脐血细胞，并对其表达的稳定性进行了初步观察。报道如下。
1.资料和方法：脐血细胞的制备、培养与体外扩增：脐血取自健康、足月、自然分娩后立即断脐的脐血。将脐血入无菌瓶内，肝素抗凝。采用Ficoll-Hypaque液离心分离，吸取单个核细胞层。以RPMI1640 15%小牛血清培养于37℃、5%二氧化碳培养箱中。基因转移后进行扩增时，在常规液体培养基的基础上加入下列细胞因子：IL-3 10ng/ml，SCF 100 ng/ml，GM-CSF 100 ng/ml。
, 百拇医药
2.基因转移的操作：先制备脂质体-质粒DNA复合物。取Lipofectin(Gibco公司产品)20 μl加入无血清培养基100 μl中。室温放置40分钟。取质粒pAMG(荷兰Valerio博士赠送)20 μg，pKo-neo 1 μg加入无血清培养基100 μl中。然后将两者轻轻混合，室温放置15分钟。将培养48～72小时的脐血细胞以无血清培养基洗2次，调整细胞浓度至2×106/ml。将脂质体-质粒DNA复合物加入培养体系中。对脐血细胞进行共转移，37℃、5%CO2，16～18小时。
3.G418选择：将上述转导细胞体系中加入小牛血清，培养过夜。再加入终浓度为1 mg/ml的G418。对转导阳性细胞进行筛选。
4.ADA酶活性的测定：对转导细胞筛选前后以及扩增前后样本进行ADA酶活性测定。以正常脐血细胞作对照。将脐血细胞以Hank′s液洗涤2次后加入pH 7.2的PBS。然后，将细胞置于-20℃反复冻融10次。离心取上清，采用紫外分光光度法进行ADA酶活性测定。蛋白定量采用Lowry酚试剂法。酶活性单位(U)为：μmol腺苷*mgpro-1*min-1。
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结果：
1.转导细胞在G418体系中的选择：将转导脐血细胞加入G418体系中培养，含有NeoR基因的转导阳性细胞可抵抗G418的毒性作用而存活，并发展成集落。而未转导细胞则很快死亡。从而使转导阳性细胞得以选择。
2.转导细胞的ADA酶活性：转导细胞的ADA酶活性为35.92±2.07 U。比正常脐血细胞的酶活性(20.35±2.07 U)显著增高。经G418筛选后，转导细胞的ADA酶活性达到90.83±4.05 U。可见外源性ADA基因在转导细胞中获得表达，尤其经筛选后酶活性增高。提示两个基因发生了共转移，经G418筛选使得转导阳性细胞得到富集。
3.扩增对转导细胞ADA基因表达稳定性的影响：将转导细胞经G418筛选后分别于体外扩增1～3周。再观察ADA酶活性，结果分别为：89.81±3.34、91.02±4.49及90.12±5.58 U提示，外源性ADA基因在转导细胞中表达稳定。
讨论：本研究利用脂质体介导的基因转移策略对脐血细胞进行了ADA基因的转移实验。旨在克服上述缺陷，为探索非病毒载体介导体细胞基因治疗的临床试验提供依据。
我们同时应用两个基因共转导脐血细胞。因此，在经G418筛选后，除了带有NeoR基因的转导阳性细胞得到选择外，带有ADA基因的细胞也得以富集。从而，使得转导细胞ADA活性显著增高，此外，本研究提示，外源性ADA基因在脐血红胞中的表达稳定。至于外源基因是否发生整合，目前尚存在争论。有人认为外源基因以episome的形式存在。也有人认为外源基因整合进入宿主细胞基因组，有关这一问题还有待于进一步探讨。, 百拇医药
单位：430022 武汉，同济医科大学血液病学研究所
关键词：
中华儿科杂志/980614 本研究利用脂质体介导的基因转移策略将外源性腺苷脱氨酶(adenosine deaminase, ADA)基因转移进入脐血细胞，并对其表达的稳定性进行了初步观察。报道如下。
1.资料和方法：脐血细胞的制备、培养与体外扩增：脐血取自健康、足月、自然分娩后立即断脐的脐血。将脐血入无菌瓶内，肝素抗凝。采用Ficoll-Hypaque液离心分离，吸取单个核细胞层。以RPMI1640 15%小牛血清培养于37℃、5%二氧化碳培养箱中。基因转移后进行扩增时，在常规液体培养基的基础上加入下列细胞因子：IL-3 10ng/ml，SCF 100 ng/ml，GM-CSF 100 ng/ml。
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2.基因转移的操作：先制备脂质体-质粒DNA复合物。取Lipofectin(Gibco公司产品)20 μl加入无血清培养基100 μl中。室温放置40分钟。取质粒pAMG(荷兰Valerio博士赠送)20 μg，pKo-neo 1 μg加入无血清培养基100 μl中。然后将两者轻轻混合，室温放置15分钟。将培养48～72小时的脐血细胞以无血清培养基洗2次，调整细胞浓度至2×106/ml。将脂质体-质粒DNA复合物加入培养体系中。对脐血细胞进行共转移，37℃、5%CO2，16～18小时。
3.G418选择：将上述转导细胞体系中加入小牛血清，培养过夜。再加入终浓度为1 mg/ml的G418。对转导阳性细胞进行筛选。
4.ADA酶活性的测定：对转导细胞筛选前后以及扩增前后样本进行ADA酶活性测定。以正常脐血细胞作对照。将脐血细胞以Hank′s液洗涤2次后加入pH 7.2的PBS。然后，将细胞置于-20℃反复冻融10次。离心取上清，采用紫外分光光度法进行ADA酶活性测定。蛋白定量采用Lowry酚试剂法。酶活性单位(U)为：μmol腺苷*mgpro-1*min-1。
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结果：
1.转导细胞在G418体系中的选择：将转导脐血细胞加入G418体系中培养，含有NeoR基因的转导阳性细胞可抵抗G418的毒性作用而存活，并发展成集落。而未转导细胞则很快死亡。从而使转导阳性细胞得以选择。
2.转导细胞的ADA酶活性：转导细胞的ADA酶活性为35.92±2.07 U。比正常脐血细胞的酶活性(20.35±2.07 U)显著增高。经G418筛选后，转导细胞的ADA酶活性达到90.83±4.05 U。可见外源性ADA基因在转导细胞中获得表达，尤其经筛选后酶活性增高。提示两个基因发生了共转移，经G418筛选使得转导阳性细胞得到富集。
3.扩增对转导细胞ADA基因表达稳定性的影响：将转导细胞经G418筛选后分别于体外扩增1～3周。再观察ADA酶活性，结果分别为：89.81±3.34、91.02±4.49及90.12±5.58 U提示，外源性ADA基因在转导细胞中表达稳定。
讨论：本研究利用脂质体介导的基因转移策略对脐血细胞进行了ADA基因的转移实验。旨在克服上述缺陷，为探索非病毒载体介导体细胞基因治疗的临床试验提供依据。
我们同时应用两个基因共转导脐血细胞。因此，在经G418筛选后，除了带有NeoR基因的转导阳性细胞得到选择外，带有ADA基因的细胞也得以富集。从而，使得转导细胞ADA活性显著增高，此外，本研究提示，外源性ADA基因在脐血红胞中的表达稳定。至于外源基因是否发生整合，目前尚存在争论。有人认为外源基因以episome的形式存在。也有人认为外源基因整合进入宿主细胞基因组，有关这一问题还有待于进一步探讨。, 百拇医药