人凝血因子ⅨcDNA在C2C12细胞中的表达
作者：李朝霞 王宏伟 王宁遂 卢大儒 邱信芳 薛京伦
单位：400014 重庆医科大学附属儿科医院(李朝霞、王宁遂)；上海复旦大学遗传研究所(王宏伟、卢大儒、邱信芳、薛京伦)
关键词：Christmas病；因子；Ⅸ；DNA；互补
中华儿科杂志/980608 【摘要】 目的 探索一种新的血友病B基因治疗的靶细胞。方法 用两种逆转录病毒载体G1NaMCⅨ和G1NaCⅨ分别将人凝血因子ⅨcDNA转入小鼠C2C12成肌细胞中，观察凝血因子Ⅸ(FⅨ)cDNA表达及肌肉组织特异性增强子序列对表达的调控。结果 带肌肉组织特异性增强子序列的逆转录病毒载体G1NaMCⅨ能使FⅨcDNA在C2C12中的最高表达量24小时达640ng/106细胞，活性达90%，明显高于无增强子序列的逆转录病毒载体G1NaCⅨ的24小时380ng/106细胞的表达量。结论 成肌细胞具有合成、分泌活性FⅨ的功能，可作为血友病B基因治疗的一种理想靶细胞。
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The expression of human factor Ⅸ cDNA by C2C12 myoblasts
Li Zhaoxia, Wang Hongwei, Wang Ningsui, et al.
Children′s Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400014
【Abstract 】 Objective To explore a new type of somatic cell for gene therapy for the inherited disorder-hemophilia B. Methods The C2C12 myoblasts were infected by retrovirus vectors G1NaMCⅨ and G1NaCⅨ, respectively. Then the authors observed the expression of human factor Ⅸ cDNA and the regulation by muscle specific enhancer. Results The highest level of human factor Ⅸ protein controlled by G1NaMCⅨ was 640ng/106 cells/24 hours, Significantly higher than 380 ng/106/24 hours controlled by G1NaCⅨ the biological activity was 90%. Conclusion Myoblasts can synthesize and secrete biologically active factor, and it is an ideal target cell in hemophilia B gene therapy.
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【Key words 】 Christmas disease Factor Ⅸ DNA, complementary
血友病B是由于凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因缺陷所致的一种严重的遗传性出血性疾病。临床对症措施不能根治该病，并且病人因长期输血面临各类病毒感染，人们设想用基因治疗的方法来替代目前常规治疗方法。成肌细胞是肌肉前体细胞，一方面具有分化潜能可相互融合形成新的肌纤维[1]，另一方面具有分泌性[2，3]，在体细胞基因治疗中扮演重要角色。我们选用从C3H小鼠分离的一种保持分化能力的成肌细胞株——C2C12细胞作为靶细胞，观察人凝血因子ⅨcDNA在其中的表达情况及肌肉组织特异性增强子对表达的调控。
材料和方法
一、材料
本研究所用各种限制性内切酶均为美国Sigma公司产品；逆转录病毒辅助细胞株PA317购自美国ATCC公司；抗人凝血因子Ⅸ单克隆抗体3A6由日本奈良医学院Yoshioka博士赠送；兔抗人凝血因子Ⅸ抗血清及辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG抗血清购自美国Calbi ochem-Behring公司；缺乏凝血因子Ⅸ基质血浆由上海瑞金医院血液研究室提供；G1Na病毒框架由第一军医大学彭朝晖教授赠送；检测凝血因子ⅨcDNA引物由复旦大学遗传研究所开放实验室合成；逆转录病毒载体G1NacⅨ由复旦大学遗传研究所基因治疗课题组构建；C2C12细胞株由美国密歇根医学中心姚寿南博士赠送；4RCAT质粒由美国加州大学医学中心Hauschka教授赠送。
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二、方法
1.G1 NaMCⅨ逆转录病毒载体的构建：包括碱法提质粒DNA、酶切、连接、DNA片段分离和回收、细胞转化等均按Sambrook等[4]方法进行。具体过程如下：
用PvuⅡ, HindⅢ二酶从4RCAT质粒上切下肌肉组织特异的增强子序列——小鼠肌酸激酶基因(MCK)增强子片段连接到人巨细胞病毒(hCMV)-Ⅸ cDNA片段上游, 使MCK增强子和hCMV启动子共同调控FⅨcDNA表达构成G1 NaMCⅨ逆转录病毒载体。鉴定时选择XhoⅠ、ScaⅠ两单一酶切位点, 消化后分别产生一条长为7.8 kb的片段。HindⅢ为双酶切位点, 消化后产生5.5 kb和2.3 kb两条片段。正向插入者, BamHⅠ酶切, 出现0.7 kb和7.1 kb两条片段。
2.细胞培养及细胞融合：逆转录病毒包装细胞PA317和小鼠成纤维细胞NIH3T3用含10%小牛血清DMEM培养液培养。C2C12细胞用含10%小牛血清的DMEM培养液培养、含5%马血清的DMEM培养液使C2C12细胞融合, 72小时后形成肌纤维和肌小管。
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3.DNA和病毒感染：用电穿孔法将重组质粒DNA转染PA317细胞, 逆转录病毒悬液感染C2C12细胞, 用NIH3T3细胞进行滴度测定等参照文献[5]进行。
4.聚合酶链反应(PCR)检测：若两种病毒载体将FⅨ cDNA转入C2C12细胞中, PCR扩增C2C12细胞的DNA，将出现183bp的阳性片段[6]。
5.人凝血因子Ⅸ抗原含量的测定采用酶联免疫吸附分析法(ELISA)[7]。
6.人凝血因子Ⅸ活性检测用柠檬酸钡吸附法[8]。
结果
人凝血因子ⅨcDNA在离体C2C12细胞中的表达：
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一、PCR检测结果
均为阳性。说明G1NaMCⅨ和G1NaCⅨ两种逆转录病毒载体均已成功地将FⅨcDNA转移到C2C12细胞中。
二、FⅨcDNA在C2C12细胞中的表达分析(附表)
对照组为未转染FⅨcDNA的C2C12细胞, 其FⅨ24小时表达量为0 ng/106细胞。经统计分析两逆转录病毒载体所感染的C2C12成肌细胞, 人凝血因子Ⅸ蛋白的表达量与对照组相比较其差异均有显著意义(t1=19,P1<0.01；t2=12.8, P2<0.01), 两逆
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附表 人凝血因子Ⅸ在C2C12细胞中24小时的
表达量和活性(
±s) 逆转录
病毒载体
例数
人凝血因子Ⅸ
(ng/106细胞)*
活性
(%)
G1NaCⅨ
4
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380±20
90
G1NaMCⅨ
4
640±50
90
* 各4个表达最高克隆的平均值
转录病毒间的差异亦有显著意义(t=3.86,P<0.05)。
三、C2C12/ G1NaCⅨ细胞和C2C12/ G1NaMCⅨ细胞分化前后人凝血因子Ⅸ蛋白表达比较
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C2C12/ G1NaCⅨ细胞分化前FⅨ表达量为2×105细胞80ng,分化后为400 ng, 增加约5倍；C2C12/ G1NaMCⅨ细胞分化前FⅨ表达量为140 ng, 分化后2×105细胞1 600 ng, 增加约11倍, 说明MCK在肌纤维和肌小管中的增强作用更显著。讨论
血友病B是凝血因子Ⅸ基因缺陷而致的一种严重遗传性出血性疾病。自本世纪80年代末开展基因治疗以来, 戴一凡等[9]及薛京伦等[10]以人皮肤成纤维细胞为靶细胞取得了较满意的成果。但无论自体或异体成纤维细胞在体内均有一定寿命, 当带有正常因子ⅨcDNA的细胞衰老死亡后, 必然会影响因子Ⅸ的表达, 不能解决目的基因在体内长期表达的问题。而且使用该细胞需胶原包埋, 操作较繁杂。肝细胞在理论上是最理想的靶细胞, 但肝细胞是终级分化细胞, 对逆转录病毒载体感染不敏感, 而且重新植入肝脏后不会再分裂, 亦不能使目的基因长期表达。国外学者Barr等[2]和Dhawan等[3]分别证明了成肌细胞具有合成、修饰、分泌血浆蛋白的功能，可作为体细胞基因治疗的靶细胞。
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我们的实验结果显示：FⅨcDNA在培养的C2C12成肌细胞中最高表达量24小时可达640 ng/106细胞，活性达90%, 与国外学者Yao等[11], Dai等[12]的报道相似, 证实了成肌细胞确实具有合成、修饰、分泌凝血因子Ⅸ的功能, 符合血友病B基因治疗靶细胞的基本条件。而且还有独特的优点：(1)肌肉组织庞大，约占体重40%, 取材、回输容易, 临床应用象肌注给药一样简便易行。(2)成肌细胞进入体内一方面可以相互融合成肌纤维, 而且可以与机体内的肌纤维融合, 将目的基因传递给其它纤维。(3)肌肉组织血管丰富, Ⅸ蛋白很容易进入血液循环。
基因治疗成功在于外源基因高效长期表达。而高效持久表达受多种因素影响, 除了启动子外, 增强子是另一重要因素。我们新设计构建的逆转录病毒载体G1NaMCⅨ是带有肌肉组织特异的增强子序列——小鼠肌肉肌酸激酶基因，长60bp，包含下列起增强子作用的核心顺序：CCCAACACCTGCTGCCT。实验证实了该序列确实起着明显增强表达的作用，尤其在肌小管中的增强作用更明显, 与Yao等[11]的观察一致。以上事实说明今后选择肌肉途径进行血友病B基因治疗是一种理想的方案。
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参考文献
1 Yao SN, Kurachi K. Inplanted myoblasts not only fuse with myofibers but also survive as muscle precusor cells. J Cell Sci, 1993, 105: 957-963.
2 Barr E, Leiden JM. Systemic delivery of recombinant proteins by genetically modified myoblasts. Science, 1991, 254: 1507-1509.
3 Dhawan J, Pan LC, Pavlath GK, et al. Systemic delivery of human growth hormone by injection of genetically engineered myoblasts. Science, 1991, 254: 1509-1512.
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4 Sambrook J, Fritsch EF, Marviatis T. Molecular cloning: a laboratory mannual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laborary Press, 1989, 46.
5 周洁民, 戴一凡, 邱信芳, 等.转染人凝血因子ⅨcDNA的血友病B患者皮肤成纤维细胞在小鼠体内的高效表达. 中国科学, B辑, 1992, 35: 611-618.
6 胡以平, 邱信芳, 薛京伦, 等.人凝血因子ⅨcDNA在细胞中和转基因小鼠内的表达特性. 遗传学报, 1995, 22: 161-166.
7 Anson DS, Austen DE, Brownlee GG. Expression of active human clottiong factor Ⅸ from recombinant DNA clones in mammalian cell. Nature, 1985, 315: 683-685.
, 百拇医药
8 Busby S, Kumar A, Joseph M, et al. Expression of active human factor Ⅸ in transfected cells. Nature, 1985, 316: 272-273.
9 戴一凡, 邱信芳, 薛京伦, 等. 带有人Ⅸ因子cDNA的反转录病毒载体的构建及其在血友病B患者皮肤成纤维细胞中的高效转移和表达.中国科学, B辑, 1990, 33: 1248-1292.
10 薛京伦, 卢大儒, 周洁民, 等. 成纤维细胞基因治疗血友病B的临床I期试验.中国科学, B辑, 1993, 36: 53-60.
11 Yao SN, Smith KJ, Kurachi K. Primary myoblast-mediated gene transfer: persistent expression of human factor Ⅸ in mice. Gene Therapy, 1994, 1: 99-107.
12 Dai Y, Roman M, Naviaux RK, et al. Gene therapy via primary myoblasts: long-term expression of factor Ⅸ protein following transplantation in vivo. Pro Natl Acad Sci USA, 1992, 89: 10892-10895., 百拇医药
单位：400014 重庆医科大学附属儿科医院(李朝霞、王宁遂)；上海复旦大学遗传研究所(王宏伟、卢大儒、邱信芳、薛京伦)
关键词：Christmas病；因子；Ⅸ；DNA；互补
中华儿科杂志/980608 【摘要】 目的 探索一种新的血友病B基因治疗的靶细胞。方法 用两种逆转录病毒载体G1NaMCⅨ和G1NaCⅨ分别将人凝血因子ⅨcDNA转入小鼠C2C12成肌细胞中，观察凝血因子Ⅸ(FⅨ)cDNA表达及肌肉组织特异性增强子序列对表达的调控。结果 带肌肉组织特异性增强子序列的逆转录病毒载体G1NaMCⅨ能使FⅨcDNA在C2C12中的最高表达量24小时达640ng/106细胞，活性达90%，明显高于无增强子序列的逆转录病毒载体G1NaCⅨ的24小时380ng/106细胞的表达量。结论 成肌细胞具有合成、分泌活性FⅨ的功能，可作为血友病B基因治疗的一种理想靶细胞。
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The expression of human factor Ⅸ cDNA by C2C12 myoblasts
Li Zhaoxia, Wang Hongwei, Wang Ningsui, et al.
Children′s Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400014
【Abstract 】 Objective To explore a new type of somatic cell for gene therapy for the inherited disorder-hemophilia B. Methods The C2C12 myoblasts were infected by retrovirus vectors G1NaMCⅨ and G1NaCⅨ, respectively. Then the authors observed the expression of human factor Ⅸ cDNA and the regulation by muscle specific enhancer. Results The highest level of human factor Ⅸ protein controlled by G1NaMCⅨ was 640ng/106 cells/24 hours, Significantly higher than 380 ng/106/24 hours controlled by G1NaCⅨ the biological activity was 90%. Conclusion Myoblasts can synthesize and secrete biologically active factor, and it is an ideal target cell in hemophilia B gene therapy.
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【Key words 】 Christmas disease Factor Ⅸ DNA, complementary
血友病B是由于凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因缺陷所致的一种严重的遗传性出血性疾病。临床对症措施不能根治该病，并且病人因长期输血面临各类病毒感染，人们设想用基因治疗的方法来替代目前常规治疗方法。成肌细胞是肌肉前体细胞，一方面具有分化潜能可相互融合形成新的肌纤维[1]，另一方面具有分泌性[2，3]，在体细胞基因治疗中扮演重要角色。我们选用从C3H小鼠分离的一种保持分化能力的成肌细胞株——C2C12细胞作为靶细胞，观察人凝血因子ⅨcDNA在其中的表达情况及肌肉组织特异性增强子对表达的调控。
材料和方法
一、材料
本研究所用各种限制性内切酶均为美国Sigma公司产品；逆转录病毒辅助细胞株PA317购自美国ATCC公司；抗人凝血因子Ⅸ单克隆抗体3A6由日本奈良医学院Yoshioka博士赠送；兔抗人凝血因子Ⅸ抗血清及辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG抗血清购自美国Calbi ochem-Behring公司；缺乏凝血因子Ⅸ基质血浆由上海瑞金医院血液研究室提供；G1Na病毒框架由第一军医大学彭朝晖教授赠送；检测凝血因子ⅨcDNA引物由复旦大学遗传研究所开放实验室合成；逆转录病毒载体G1NacⅨ由复旦大学遗传研究所基因治疗课题组构建；C2C12细胞株由美国密歇根医学中心姚寿南博士赠送；4RCAT质粒由美国加州大学医学中心Hauschka教授赠送。
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二、方法
1.G1 NaMCⅨ逆转录病毒载体的构建：包括碱法提质粒DNA、酶切、连接、DNA片段分离和回收、细胞转化等均按Sambrook等[4]方法进行。具体过程如下：
用PvuⅡ, HindⅢ二酶从4RCAT质粒上切下肌肉组织特异的增强子序列——小鼠肌酸激酶基因(MCK)增强子片段连接到人巨细胞病毒(hCMV)-Ⅸ cDNA片段上游, 使MCK增强子和hCMV启动子共同调控FⅨcDNA表达构成G1 NaMCⅨ逆转录病毒载体。鉴定时选择XhoⅠ、ScaⅠ两单一酶切位点, 消化后分别产生一条长为7.8 kb的片段。HindⅢ为双酶切位点, 消化后产生5.5 kb和2.3 kb两条片段。正向插入者, BamHⅠ酶切, 出现0.7 kb和7.1 kb两条片段。
2.细胞培养及细胞融合：逆转录病毒包装细胞PA317和小鼠成纤维细胞NIH3T3用含10%小牛血清DMEM培养液培养。C2C12细胞用含10%小牛血清的DMEM培养液培养、含5%马血清的DMEM培养液使C2C12细胞融合, 72小时后形成肌纤维和肌小管。
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3.DNA和病毒感染：用电穿孔法将重组质粒DNA转染PA317细胞, 逆转录病毒悬液感染C2C12细胞, 用NIH3T3细胞进行滴度测定等参照文献[5]进行。
4.聚合酶链反应(PCR)检测：若两种病毒载体将FⅨ cDNA转入C2C12细胞中, PCR扩增C2C12细胞的DNA，将出现183bp的阳性片段[6]。
5.人凝血因子Ⅸ抗原含量的测定采用酶联免疫吸附分析法(ELISA)[7]。
6.人凝血因子Ⅸ活性检测用柠檬酸钡吸附法[8]。
结果
人凝血因子ⅨcDNA在离体C2C12细胞中的表达：
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一、PCR检测结果
均为阳性。说明G1NaMCⅨ和G1NaCⅨ两种逆转录病毒载体均已成功地将FⅨcDNA转移到C2C12细胞中。
二、FⅨcDNA在C2C12细胞中的表达分析(附表)
对照组为未转染FⅨcDNA的C2C12细胞, 其FⅨ24小时表达量为0 ng/106细胞。经统计分析两逆转录病毒载体所感染的C2C12成肌细胞, 人凝血因子Ⅸ蛋白的表达量与对照组相比较其差异均有显著意义(t1=19,P1<0.01；t2=12.8, P2<0.01), 两逆
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附表 人凝血因子Ⅸ在C2C12细胞中24小时的
表达量和活性(
±s) 逆转录病毒载体
例数
人凝血因子Ⅸ
(ng/106细胞)*
活性
(%)
G1NaCⅨ
4
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380±20
90
G1NaMCⅨ
4
640±50
90
* 各4个表达最高克隆的平均值
转录病毒间的差异亦有显著意义(t=3.86,P<0.05)。
三、C2C12/ G1NaCⅨ细胞和C2C12/ G1NaMCⅨ细胞分化前后人凝血因子Ⅸ蛋白表达比较
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C2C12/ G1NaCⅨ细胞分化前FⅨ表达量为2×105细胞80ng,分化后为400 ng, 增加约5倍；C2C12/ G1NaMCⅨ细胞分化前FⅨ表达量为140 ng, 分化后2×105细胞1 600 ng, 增加约11倍, 说明MCK在肌纤维和肌小管中的增强作用更显著。讨论
血友病B是凝血因子Ⅸ基因缺陷而致的一种严重遗传性出血性疾病。自本世纪80年代末开展基因治疗以来, 戴一凡等[9]及薛京伦等[10]以人皮肤成纤维细胞为靶细胞取得了较满意的成果。但无论自体或异体成纤维细胞在体内均有一定寿命, 当带有正常因子ⅨcDNA的细胞衰老死亡后, 必然会影响因子Ⅸ的表达, 不能解决目的基因在体内长期表达的问题。而且使用该细胞需胶原包埋, 操作较繁杂。肝细胞在理论上是最理想的靶细胞, 但肝细胞是终级分化细胞, 对逆转录病毒载体感染不敏感, 而且重新植入肝脏后不会再分裂, 亦不能使目的基因长期表达。国外学者Barr等[2]和Dhawan等[3]分别证明了成肌细胞具有合成、修饰、分泌血浆蛋白的功能，可作为体细胞基因治疗的靶细胞。
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我们的实验结果显示：FⅨcDNA在培养的C2C12成肌细胞中最高表达量24小时可达640 ng/106细胞，活性达90%, 与国外学者Yao等[11], Dai等[12]的报道相似, 证实了成肌细胞确实具有合成、修饰、分泌凝血因子Ⅸ的功能, 符合血友病B基因治疗靶细胞的基本条件。而且还有独特的优点：(1)肌肉组织庞大，约占体重40%, 取材、回输容易, 临床应用象肌注给药一样简便易行。(2)成肌细胞进入体内一方面可以相互融合成肌纤维, 而且可以与机体内的肌纤维融合, 将目的基因传递给其它纤维。(3)肌肉组织血管丰富, Ⅸ蛋白很容易进入血液循环。
基因治疗成功在于外源基因高效长期表达。而高效持久表达受多种因素影响, 除了启动子外, 增强子是另一重要因素。我们新设计构建的逆转录病毒载体G1NaMCⅨ是带有肌肉组织特异的增强子序列——小鼠肌肉肌酸激酶基因，长60bp，包含下列起增强子作用的核心顺序：CCCAACACCTGCTGCCT。实验证实了该序列确实起着明显增强表达的作用，尤其在肌小管中的增强作用更明显, 与Yao等[11]的观察一致。以上事实说明今后选择肌肉途径进行血友病B基因治疗是一种理想的方案。
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参考文献
1 Yao SN, Kurachi K. Inplanted myoblasts not only fuse with myofibers but also survive as muscle precusor cells. J Cell Sci, 1993, 105: 957-963.
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5 周洁民, 戴一凡, 邱信芳, 等.转染人凝血因子ⅨcDNA的血友病B患者皮肤成纤维细胞在小鼠体内的高效表达. 中国科学, B辑, 1992, 35: 611-618.
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8 Busby S, Kumar A, Joseph M, et al. Expression of active human factor Ⅸ in transfected cells. Nature, 1985, 316: 272-273.
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10 薛京伦, 卢大儒, 周洁民, 等. 成纤维细胞基因治疗血友病B的临床I期试验.中国科学, B辑, 1993, 36: 53-60.
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