急性淋巴细胞性白血病患儿中性粒细胞吞噬和杀菌功能的研究
作者：许伟 汤云珍
单位：221002 徐州医学院附属医院
关键词：
中华儿科杂志/980919
急性淋巴细胞性白血病(简称急淋)患儿最常见、最严重的并发症是感染，临床治疗也最困难。中性粒细胞(PMN)功能缺陷是否可作为病人易感染的原因之一?为了明确这一点，我们测定了急淋患儿PMN吞噬和杀菌功能，并与正常儿进行了比较。
对象：急淋患儿16例，均为男性，平均年龄5.0±2.2岁。除1例为复发病例外，其余均为初发病例。所有患儿实验前至少2周未用过任何化疗药物，至少1周未用过抗生素，也未接受过输血。诊断标准按1993年“小儿急性白血病诊疗建议”[1]。正常儿20名，男18例，女2例，平均年龄5.8±2.6岁。均无血液病史及其他肿瘤史，实验前1周无感染史及服药史。
, 百拇医药
方法：(1)采集血液标本：采静脉血10～15 ml，其中8～13 ml抗凝，2 ml不抗凝保留其血清。(2)制备细菌悬液：培养18小时的金葡菌26 001株，在自体血清中被调理1.5小时，最后用HBSSG液悬浮，调整细菌数为(6.36±0.20)×106/ml。(3)制备粒细胞悬液：4.5%的Dextran加入至抗凝血中，使红细胞自然沉降，用淋巴细胞分离液分出单个核细胞层，弃去。管底的颗粒细胞加入适量的红细胞破碎液，使残留的红细胞溶解，所剩粒细胞用HBSSG液悬浮即为粒细胞悬液。设置实验组(急淋患儿的粒细胞)和对照组(正常儿的粒细胞)。两组粒细胞均置37℃水浴箱中孵育30分钟。对所得粒细胞分别进行如下检查：①用2%台盼蓝拒染试验鉴定PMN活力；②调整两组细胞数至3×106/ml左右；两组PMN纯度无差异(分别为95.8%±1.3%及95.9%±1.2%)。③检测PMN吞噬功能：分别取两组的粒细胞悬液各1 ml，加等量金葡菌悬液，混匀。于5、10、表1 急淋患儿和正常儿的PMN与细菌孵育不同时间后
, 百拇医药
其胞外菌数(
±s,×106CFU*/ml) 组别
例数
5 min
10 min
15 min
45 min
实验组
16
4.83±1.04
3.38±1.20
, http://www.100md.com 2.23±1.23
2.23±1.24
对照组
20
4.62±1.06
3.16±1.20
2.23±1.14
2.17±1.10
P值
>0.05
>0.05
>0.05
, http://www.100md.com >0.05
* CFU为克隆形成单位表2 急淋患儿和正常儿PMN吞噬细菌不同时间后其胞内活菌数(±s,%) 组别
例数
45 min
60 min
90 min
120 min
实验组
16
4.03±1.33
, http://www.100md.com
3.30±1.33
2.51±1.40
1.61±1.51
对照组
20
3.78±1.25
3.20±1.28
2.21±1.34
0.99±1.67
P值
>0.05
>0.05
, 百拇医药
>0.05
<0.05
15、45分钟后离心取上清，通过连续稀释、平皿接种的方法来计数上清液中未被吞噬的细菌菌落，测定PMN的吞噬功能。④检测PMN细胞内杀菌功能：用Lysostaphin和Trypsin处理PMN表面粘连的细菌，于45、60、90、120分钟后用冷蒸馏水溶解PMN并释出有活力的细菌，用上述同样的方法来计数，测定PMN的杀菌功能。患儿和正常儿的PMN悬液及其与细菌的混合液离心固定后作电镜检查。统计方法：实验数据用对数值作配对t检验。检验水准，α=0.05。
结果：(1)PMN细胞活性：实验组PMN活力达98.9%±1.0%，对照组达99.0%±0.8%。两组之间无显著性差异(P>0.05)。(2)急淋患儿和正常儿PMN吞噬和杀菌功能的比较：两组PMN与细菌孵育5、10、15、45分钟后其PMN的胞外菌数均逐渐减少(表1)。但两组之间无显著性差异(P>0.05)。提示急淋患儿的PMN吞噬功能正常。(3)两组PMN细胞内细菌存活率比较：以吞噬开始后15分钟时胞内的活菌数为100%，吞噬45、60、90、120分钟后，两组PMN的胞内菌数见表2。在45、60、90分钟时急淋患儿组细胞内活菌率比对照组高，但差异无显著意义，在120分钟时两组之间差异有显著意义(P<0.05)。提示急淋患儿的PMN杀菌功能低于正常。实验中发现，HBSSG液对细菌生长无明显影响。(4)急淋患儿PMN超微结构的改变：急淋患儿的PMN中线粒体肿胀，部分线粒体嵴消失。两组PMN与细菌孵育15分钟后，约98%的细胞有吞噬现象并形成囊泡，部分细胞脱颗粒。急淋患儿的一些PMN吞噬细胞后120分钟有自溶倾向，有的则变为脓细胞并释放出细菌。
, 百拇医药
讨论：由于持续缓解期的延长，急淋患儿在缓解期发生严重感染和死亡的人数也有所增加。其原因除缓解期反复维持化疗发生粒细胞减少及免疫功能降低外，白细胞功能缺陷也是一重要因素。Thompson等[2]曾报道，36%复发期和25%缓解期急淋患儿有不同程度的PMN功能损害，且与临床感染有关。本实验结果表明：从急淋患儿全血中分离出的PMN活性与正常儿的相同，急淋患儿PMN虽然吞噬功能正常，但其杀菌功能低下。结果与国外的一些报道不尽相同，其原因可能与本实验中多为初发患儿，实验前未用过化疗药物，而国外的研究对象实验前接受过化疗，这些药物对PMN功能的影响不能排除。我们在电镜下观察的结果与Rosner等[3]研究的结果相似。他发现急淋复发期的白细胞吞噬念珠菌后2～3小时，死亡明显增加，团集减少。Pickering等[4]认为PMN吞噬及杀菌功能的异常可被PMN中单磷酸己糖旁路(HMPS)活性的改变所反应，而PMN中线粒体的改变可能会影响HMPS的活性，对此，我们尚须深入研究。本实验的结果提示，在对患儿进行化疗时不仅要监测PMN的数目，还要考虑到它的功能改变。
, http://www.100md.com
参考文献
1 孙桂香，李齐岳.小儿急性白血病诊疗建议.中华儿科杂志，1993，31：285-287.
2 Thompson EN, Williams R. Bactericidal capacity of peripheral blood leucocytes in relation to bacterial infections in acute lymphoblastic leukemia in children. J Clin Pathol, 1974, 27:906-910.
3 Rosner F, Valmont I, Kozinn PJ, et al. Leukocyte function in patients with leukemia. Cancer, 1970,25:835-842.
4 Pickering LK, Anderson DC, Choi S, et al. Leukocyte function in children with malignancies. Cancer, 1975, 35:1365-1371., 百拇医药
单位：221002 徐州医学院附属医院
关键词：
中华儿科杂志/980919
急性淋巴细胞性白血病(简称急淋)患儿最常见、最严重的并发症是感染，临床治疗也最困难。中性粒细胞(PMN)功能缺陷是否可作为病人易感染的原因之一?为了明确这一点，我们测定了急淋患儿PMN吞噬和杀菌功能，并与正常儿进行了比较。
对象：急淋患儿16例，均为男性，平均年龄5.0±2.2岁。除1例为复发病例外，其余均为初发病例。所有患儿实验前至少2周未用过任何化疗药物，至少1周未用过抗生素，也未接受过输血。诊断标准按1993年“小儿急性白血病诊疗建议”[1]。正常儿20名，男18例，女2例，平均年龄5.8±2.6岁。均无血液病史及其他肿瘤史，实验前1周无感染史及服药史。
, 百拇医药
方法：(1)采集血液标本：采静脉血10～15 ml，其中8～13 ml抗凝，2 ml不抗凝保留其血清。(2)制备细菌悬液：培养18小时的金葡菌26 001株，在自体血清中被调理1.5小时，最后用HBSSG液悬浮，调整细菌数为(6.36±0.20)×106/ml。(3)制备粒细胞悬液：4.5%的Dextran加入至抗凝血中，使红细胞自然沉降，用淋巴细胞分离液分出单个核细胞层，弃去。管底的颗粒细胞加入适量的红细胞破碎液，使残留的红细胞溶解，所剩粒细胞用HBSSG液悬浮即为粒细胞悬液。设置实验组(急淋患儿的粒细胞)和对照组(正常儿的粒细胞)。两组粒细胞均置37℃水浴箱中孵育30分钟。对所得粒细胞分别进行如下检查：①用2%台盼蓝拒染试验鉴定PMN活力；②调整两组细胞数至3×106/ml左右；两组PMN纯度无差异(分别为95.8%±1.3%及95.9%±1.2%)。③检测PMN吞噬功能：分别取两组的粒细胞悬液各1 ml，加等量金葡菌悬液，混匀。于5、10、表1 急淋患儿和正常儿的PMN与细菌孵育不同时间后
, 百拇医药
其胞外菌数(
±s,×106CFU*/ml) 组别例数
5 min
10 min
15 min
45 min
实验组
16
4.83±1.04
3.38±1.20
, http://www.100md.com 2.23±1.23
2.23±1.24
对照组
20
4.62±1.06
3.16±1.20
2.23±1.14
2.17±1.10
P值
>0.05
>0.05
>0.05
, http://www.100md.com >0.05
* CFU为克隆形成单位表2 急淋患儿和正常儿PMN吞噬细菌不同时间后其胞内活菌数(
±s,%) 组别例数
45 min
60 min
90 min
120 min
实验组
16
4.03±1.33
, http://www.100md.com
3.30±1.33
2.51±1.40
1.61±1.51
对照组
20
3.78±1.25
3.20±1.28
2.21±1.34
0.99±1.67
P值
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, 百拇医药
>0.05
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15、45分钟后离心取上清，通过连续稀释、平皿接种的方法来计数上清液中未被吞噬的细菌菌落，测定PMN的吞噬功能。④检测PMN细胞内杀菌功能：用Lysostaphin和Trypsin处理PMN表面粘连的细菌，于45、60、90、120分钟后用冷蒸馏水溶解PMN并释出有活力的细菌，用上述同样的方法来计数，测定PMN的杀菌功能。患儿和正常儿的PMN悬液及其与细菌的混合液离心固定后作电镜检查。统计方法：实验数据用对数值作配对t检验。检验水准，α=0.05。
结果：(1)PMN细胞活性：实验组PMN活力达98.9%±1.0%，对照组达99.0%±0.8%。两组之间无显著性差异(P>0.05)。(2)急淋患儿和正常儿PMN吞噬和杀菌功能的比较：两组PMN与细菌孵育5、10、15、45分钟后其PMN的胞外菌数均逐渐减少(表1)。但两组之间无显著性差异(P>0.05)。提示急淋患儿的PMN吞噬功能正常。(3)两组PMN细胞内细菌存活率比较：以吞噬开始后15分钟时胞内的活菌数为100%，吞噬45、60、90、120分钟后，两组PMN的胞内菌数见表2。在45、60、90分钟时急淋患儿组细胞内活菌率比对照组高，但差异无显著意义，在120分钟时两组之间差异有显著意义(P<0.05)。提示急淋患儿的PMN杀菌功能低于正常。实验中发现，HBSSG液对细菌生长无明显影响。(4)急淋患儿PMN超微结构的改变：急淋患儿的PMN中线粒体肿胀，部分线粒体嵴消失。两组PMN与细菌孵育15分钟后，约98%的细胞有吞噬现象并形成囊泡，部分细胞脱颗粒。急淋患儿的一些PMN吞噬细胞后120分钟有自溶倾向，有的则变为脓细胞并释放出细菌。
, 百拇医药
讨论：由于持续缓解期的延长，急淋患儿在缓解期发生严重感染和死亡的人数也有所增加。其原因除缓解期反复维持化疗发生粒细胞减少及免疫功能降低外，白细胞功能缺陷也是一重要因素。Thompson等[2]曾报道，36%复发期和25%缓解期急淋患儿有不同程度的PMN功能损害，且与临床感染有关。本实验结果表明：从急淋患儿全血中分离出的PMN活性与正常儿的相同，急淋患儿PMN虽然吞噬功能正常，但其杀菌功能低下。结果与国外的一些报道不尽相同，其原因可能与本实验中多为初发患儿，实验前未用过化疗药物，而国外的研究对象实验前接受过化疗，这些药物对PMN功能的影响不能排除。我们在电镜下观察的结果与Rosner等[3]研究的结果相似。他发现急淋复发期的白细胞吞噬念珠菌后2～3小时，死亡明显增加，团集减少。Pickering等[4]认为PMN吞噬及杀菌功能的异常可被PMN中单磷酸己糖旁路(HMPS)活性的改变所反应，而PMN中线粒体的改变可能会影响HMPS的活性，对此，我们尚须深入研究。本实验的结果提示，在对患儿进行化疗时不仅要监测PMN的数目，还要考虑到它的功能改变。
, http://www.100md.com
参考文献
1 孙桂香，李齐岳.小儿急性白血病诊疗建议.中华儿科杂志，1993，31：285-287.
2 Thompson EN, Williams R. Bactericidal capacity of peripheral blood leucocytes in relation to bacterial infections in acute lymphoblastic leukemia in children. J Clin Pathol, 1974, 27:906-910.
3 Rosner F, Valmont I, Kozinn PJ, et al. Leukocyte function in patients with leukemia. Cancer, 1970,25:835-842.
4 Pickering LK, Anderson DC, Choi S, et al. Leukocyte function in children with malignancies. Cancer, 1975, 35:1365-1371., 百拇医药