沈阳地区30例流行性感冒的病原学研究
作者：金红 史金阳 陈淑荣 朴英爱 刘兰青 吕绳敏
单位：110003 沈阳,中国医科大学 第二临床学院 病毒研究室
关键词：感冒；基因；病毒；正粘病毒A型
中华儿科杂志/980912 【摘要】 目的 确定1995年冬至1996年春沈阳地区发生的严重流行性感冒的病原。方法 作者用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)， 对门诊上呼吸道感染病人咽拭子标本进行了48小时短期培养后流感病毒基因检测。结果 甲型流感病毒阳性率为60%，确定为甲型流感病毒引起的流感流行。此病毒为一种在鸡胚尿囊腔不生长，不凝集鸡红细胞的“O”相甲型流感病毒。结论 RT-PCR法检测咽拭子中流感病毒基因，为特异、敏感、快速、简便的诊断流感病毒感染的方法。
Etiologic analysis of 30 cases of influenza in Shenyang area
, 百拇医药
Jin Hong, Shi Jinyang, Chen Shurong, et al. Virology Laboratory, The Second Clinical College, China Medical University, Shenyang 110003
【Abstract】 Objective To determine the pathogen of serious epidemic of influenza occured in Shenyang area in 1995-1996. Methods Throat swabs from patients with upper respiratory infection were collected in paediatric clinic during the period, and influenza virus gene was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results Positive rate of influenza virus A was 60%, so influenza virus A was considered to be the pathogenic agent of this epidemic. The strain of this virus was a strain which could not grow in chicken embryo and could not agglutinate chicken RBC. Conclusion The RT-PCR for detection of influenza virus gene from throat swab is a specific, sensitive, rapid and simple method for diagnosis of influenza virus infection.
, 百拇医药
【Key words】 Common cold Genes, viral Orthomyxoviruses type A
流行性感冒(简称流感)为突然暴发，迅速蔓延的急性呼吸道传染病，多数由流感病毒感染所致。1995年冬至1996年春，沈阳地区发生了较严重的流行性感冒，以家庭、学校为流行单位，流行面广。患者以持续高热、咳嗽为特征，部分伴腹泻、肺炎。作者对此进行了病原学研究。
资料和方法
一、资料
咽拭子标本来源：咽拭子标本取自1995年11月～1996年3月期间因上呼吸道感染在我院儿科门诊就诊患儿，男17例，女13例，年龄6个月～12岁。
二、实验方法
1.鸡胚接种：将全部咽拭子标本处理后0.3 ml接种于9日龄鸡胚尿囊腔中，35℃温箱孵育72小时后放4℃过夜，取尿囊液做血凝试验。
, http://www.100md.com
2.细胞培养：咽拭子标本0.3 ml接种于长成单层的狗肾传代细胞(MDCK)(由中国预防医学科学院病毒所流感组提供)中，吸附30分钟，加生长液0.8 ml，35℃培养48小时后-60℃冻存。冻前全部进行了血凝试验。
3.提取RNA：上述冻存的MDCK细胞全部进行1 000 r/min离心5分钟， 沉淀悬液100 μl加入1 ml TRIZoL RNA提取液(GiBCoBRL)，加入0.2 ml氯仿，摇匀，室温放置3分钟后13 000 r/min，4℃离心15分钟，取水相加0.5 ml异丙醇沉淀RNA，75%酒精洗一次，空气干燥，并溶于10 μl二乙基焦碳酸酯(DEPC)水中。
4.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)：逆转录引物根据不同亚型甲型流感病毒NP基因序列，经计算机设计(日本)，选择同源序列5′-AGCAAAAGCAGGGT-3′(由上海细胞所合成)，总反应体积为20 μl，加入引物、5XRT缓冲液，10 mM四种核苷酸(dNTP)，RNasin及AMV反转录酶(promega)，42℃60分钟。
, http://www.100md.com
PCR引物为甲型流感病毒NP基因(同逆转录引物)特异性引物：5′-GCTTAACAATAGAGAGAAA TGGTG-3′，5′-TCCATTCCGGTGCGAACAAGAGC-3′。(设计合成过程同逆转录引物)。加入逆转录产物3 μl，10XPCR缓冲液，2 mmol dNTP，Taq酶(上海)，使最终体积为20 μl。95℃变性1分钟后按94℃1分钟，52℃1分钟，72℃1分钟，循环30次。产物为300 bp。设阳性[A/Aichi/2/68(H3N2)株]及阴性对照。扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。标准分子量：∮X174/HaeⅢ。
结果
一、血细胞凝集试验
咽拭子标本接种于鸡胚尿囊腔，孵育后取尿囊腔液，用鸡红细胞做血凝试验，结果全部阴性。
咽试子标本接种于MDCK细胞48小时后做了血凝试验，用鸡血细胞呈阴性结果，而用人“O”型血呈阳性结果，推测为“O”相毒株。
, 百拇医药
二、RT-PCR
上述30份咽拭子标本，经RT-PCR检测，18份出现阳性条带，阳性率为60%。
三、特异性及敏感性
用本试验应用的甲型流感病毒特异性引物扩增乙型流感病毒(B/yamagata)，未出现扩增带，说明此引物对甲型流感病毒特异。用乙型流感病毒特异性引物检测本试验阳性标本，未出现扩增带。可以确定本次流行株为甲型流感病毒。
阳性标本的16%(3/18)，血凝试验阴性，而RT-PCR阳性。过去的研究表明RT-PCR法可以测到100 fg的基因。说明RT-PCR法具有较高的敏感性
讨论
一、流行性感冒的病原学
, http://www.100md.com
流行性感冒病毒属正粘病毒科，分甲、乙、丙三型，又根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的差异分为不同亚型。造成大流行的主要为甲型流感病毒，乙型也可以造成局部流行[1]。丙型流感病毒不同于甲型和乙型， 在人类仅引起不明显的或轻微的上呼吸道感染，很少引起流行[2]。
流行性感冒病毒为RNA病毒，基因为分节段的、单链的、阴性的RNA，由病毒体转录酶蛋白(PB1、PB2、PA)、核蛋白(NP)、膜蛋白(M)、非结构蛋白(NS)、HA、NA 基因组成，分别合成相应蛋白质。流行性感冒病毒的最外层所含的HA和NA，它们的结构易发生改变，形成新的亚型。对新型流感病毒，人们缺乏免疫力，易造成流行。1918年至1919年的流感大流行使近2万人丧生。自1957年以来的3 次世界性流感流行均起源于我国[3]。有学者报道，从甲型流感病毒引起的流感流行情况来看，1957～1961年以H2N2亚型流感病毒所致流感较多，1968～1975年以H3N2亚型为主要流行株，而1977～1983年则H1N1亚型和H3N2亚型流感病毒所致流感皆有流行[4]。1996年北京流感中心报道，北京地区1995年冬～1996年春有H3N2亚型甲型流感病毒所致流感流行。本研究虽然没有进一步进行亚型分析，但估计此次流行株为与北京地区流行株相同的H3N2亚型甲型流感病毒，为一种在鸡胚不能生长， 不能凝集鸡红细胞的“O”相甲型流感病毒。
, http://www.100md.com
二、流感病毒感染的实验室诊断
流感病毒传入人群后，很快在人群中传播，发病急、潜伏期1～3天，患者以发热、头痛、咳嗽、全身无力为主要症状，持续几个星期左右，亦有伴腹泻、肺炎者，老年人或婴幼儿可导致死亡。流感病毒的流行对社会影响面广，人们的正常工作生活都受影响。所以尽快搞清病原，采取有效措施预防疾病传播非常重要。诊断流感病毒感染，传统上使用鸡胚或狗肾细胞培养，采用血凝或红细胞吸附现象检测病毒，运用单克隆抗体及血凝抑制试验确定亚型。但上述试验需要活病毒存在，而且费时费力。用免疫染色或酶联免疫吸附试验检测常常因敏感性太差出现假阴性结果。Yamada等[5]报告， 用RT-PCR方法从患者咽拭子标本中直接检测流感病毒基因，可以快速、准确地确定病原，而且可以通过运用甲型流感病毒H1、H3基因特异性引物进行亚型分析，在24小时内做出诊断。本研究中作者把咽拭子标本接种于MDCK细胞培养48小时后再进行了RT-PCR，这样病毒得到了增殖，提高检测阳性率，还可以较长时间保存标本。本实验所用的标本反复冻融多次，仍可检测出流感病毒基因。实验结果表明，RT-PCR法为特异、快速、敏感、简便的检测流感病毒感染的方法。
, http://www.100md.com
本研究用甲型流感病毒特异性引物，扩增乙型流感病毒，未出现阳性条带，说明此引物对甲型流感病毒特异。另外，作者用乙型流感病毒特异性引物对阳性标本进行了检测，亦未出现阳性，说明作者检测到的病毒确为甲型流感病毒，检测阳性率为60%。部分上呼吸道感染病人未检测出流感病毒，可能原因为个别标本中流感病毒RNA已降解，出现假阴性结果，另一部分可能为其它呼吸道病毒感染所致。我们同一时期检测到部分上呼吸道感染、肺炎患儿血清中，有呼吸道合胞病毒、腺病毒Ⅲ型及支原体抗体阳性者。
参考文献
1 黄祯祥，主编.医学病毒学基础及实验技术.北京：科学出版社，1990.661-691.
2 孟祥金. 丙型流感病毒的分子生物学和流行病学. 国外医学微生物学分册，1988，6:245-248.
3 侯云德，主编.分子病毒学.北京:学苑出版社，1990.313-328.
4 David OW， Frank JF. Medical Virology. 4t′ed, London： Academin, 1994, 498-499.
5 Yamada A, Imanishi J, Nakajima E, et al. Detection of influenza virus in throat swab by using polymerase chain reaction. Micro Immunol,1991,35: 259-265.
(收稿：1997-07-29 修回：1998-05-18), 百拇医药
单位：110003 沈阳,中国医科大学 第二临床学院 病毒研究室
关键词：感冒；基因；病毒；正粘病毒A型
中华儿科杂志/980912 【摘要】 目的 确定1995年冬至1996年春沈阳地区发生的严重流行性感冒的病原。方法 作者用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)， 对门诊上呼吸道感染病人咽拭子标本进行了48小时短期培养后流感病毒基因检测。结果 甲型流感病毒阳性率为60%，确定为甲型流感病毒引起的流感流行。此病毒为一种在鸡胚尿囊腔不生长，不凝集鸡红细胞的“O”相甲型流感病毒。结论 RT-PCR法检测咽拭子中流感病毒基因，为特异、敏感、快速、简便的诊断流感病毒感染的方法。
Etiologic analysis of 30 cases of influenza in Shenyang area
, 百拇医药
Jin Hong, Shi Jinyang, Chen Shurong, et al. Virology Laboratory, The Second Clinical College, China Medical University, Shenyang 110003
【Abstract】 Objective To determine the pathogen of serious epidemic of influenza occured in Shenyang area in 1995-1996. Methods Throat swabs from patients with upper respiratory infection were collected in paediatric clinic during the period, and influenza virus gene was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results Positive rate of influenza virus A was 60%, so influenza virus A was considered to be the pathogenic agent of this epidemic. The strain of this virus was a strain which could not grow in chicken embryo and could not agglutinate chicken RBC. Conclusion The RT-PCR for detection of influenza virus gene from throat swab is a specific, sensitive, rapid and simple method for diagnosis of influenza virus infection.
, 百拇医药
【Key words】 Common cold Genes, viral Orthomyxoviruses type A
流行性感冒(简称流感)为突然暴发，迅速蔓延的急性呼吸道传染病，多数由流感病毒感染所致。1995年冬至1996年春，沈阳地区发生了较严重的流行性感冒，以家庭、学校为流行单位，流行面广。患者以持续高热、咳嗽为特征，部分伴腹泻、肺炎。作者对此进行了病原学研究。
资料和方法
一、资料
咽拭子标本来源：咽拭子标本取自1995年11月～1996年3月期间因上呼吸道感染在我院儿科门诊就诊患儿，男17例，女13例，年龄6个月～12岁。
二、实验方法
1.鸡胚接种：将全部咽拭子标本处理后0.3 ml接种于9日龄鸡胚尿囊腔中，35℃温箱孵育72小时后放4℃过夜，取尿囊液做血凝试验。
, http://www.100md.com
2.细胞培养：咽拭子标本0.3 ml接种于长成单层的狗肾传代细胞(MDCK)(由中国预防医学科学院病毒所流感组提供)中，吸附30分钟，加生长液0.8 ml，35℃培养48小时后-60℃冻存。冻前全部进行了血凝试验。
3.提取RNA：上述冻存的MDCK细胞全部进行1 000 r/min离心5分钟， 沉淀悬液100 μl加入1 ml TRIZoL RNA提取液(GiBCoBRL)，加入0.2 ml氯仿，摇匀，室温放置3分钟后13 000 r/min，4℃离心15分钟，取水相加0.5 ml异丙醇沉淀RNA，75%酒精洗一次，空气干燥，并溶于10 μl二乙基焦碳酸酯(DEPC)水中。
4.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)：逆转录引物根据不同亚型甲型流感病毒NP基因序列，经计算机设计(日本)，选择同源序列5′-AGCAAAAGCAGGGT-3′(由上海细胞所合成)，总反应体积为20 μl，加入引物、5XRT缓冲液，10 mM四种核苷酸(dNTP)，RNasin及AMV反转录酶(promega)，42℃60分钟。
, http://www.100md.com
PCR引物为甲型流感病毒NP基因(同逆转录引物)特异性引物：5′-GCTTAACAATAGAGAGAAA TGGTG-3′，5′-TCCATTCCGGTGCGAACAAGAGC-3′。(设计合成过程同逆转录引物)。加入逆转录产物3 μl，10XPCR缓冲液，2 mmol dNTP，Taq酶(上海)，使最终体积为20 μl。95℃变性1分钟后按94℃1分钟，52℃1分钟，72℃1分钟，循环30次。产物为300 bp。设阳性[A/Aichi/2/68(H3N2)株]及阴性对照。扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。标准分子量：∮X174/HaeⅢ。
结果
一、血细胞凝集试验
咽拭子标本接种于鸡胚尿囊腔，孵育后取尿囊腔液，用鸡红细胞做血凝试验，结果全部阴性。
咽试子标本接种于MDCK细胞48小时后做了血凝试验，用鸡血细胞呈阴性结果，而用人“O”型血呈阳性结果，推测为“O”相毒株。
, 百拇医药
二、RT-PCR
上述30份咽拭子标本，经RT-PCR检测，18份出现阳性条带，阳性率为60%。
三、特异性及敏感性
用本试验应用的甲型流感病毒特异性引物扩增乙型流感病毒(B/yamagata)，未出现扩增带，说明此引物对甲型流感病毒特异。用乙型流感病毒特异性引物检测本试验阳性标本，未出现扩增带。可以确定本次流行株为甲型流感病毒。
阳性标本的16%(3/18)，血凝试验阴性，而RT-PCR阳性。过去的研究表明RT-PCR法可以测到100 fg的基因。说明RT-PCR法具有较高的敏感性
讨论
一、流行性感冒的病原学
, http://www.100md.com
流行性感冒病毒属正粘病毒科，分甲、乙、丙三型，又根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的差异分为不同亚型。造成大流行的主要为甲型流感病毒，乙型也可以造成局部流行[1]。丙型流感病毒不同于甲型和乙型， 在人类仅引起不明显的或轻微的上呼吸道感染，很少引起流行[2]。
流行性感冒病毒为RNA病毒，基因为分节段的、单链的、阴性的RNA，由病毒体转录酶蛋白(PB1、PB2、PA)、核蛋白(NP)、膜蛋白(M)、非结构蛋白(NS)、HA、NA 基因组成，分别合成相应蛋白质。流行性感冒病毒的最外层所含的HA和NA，它们的结构易发生改变，形成新的亚型。对新型流感病毒，人们缺乏免疫力，易造成流行。1918年至1919年的流感大流行使近2万人丧生。自1957年以来的3 次世界性流感流行均起源于我国[3]。有学者报道，从甲型流感病毒引起的流感流行情况来看，1957～1961年以H2N2亚型流感病毒所致流感较多，1968～1975年以H3N2亚型为主要流行株，而1977～1983年则H1N1亚型和H3N2亚型流感病毒所致流感皆有流行[4]。1996年北京流感中心报道，北京地区1995年冬～1996年春有H3N2亚型甲型流感病毒所致流感流行。本研究虽然没有进一步进行亚型分析，但估计此次流行株为与北京地区流行株相同的H3N2亚型甲型流感病毒，为一种在鸡胚不能生长， 不能凝集鸡红细胞的“O”相甲型流感病毒。
, http://www.100md.com
二、流感病毒感染的实验室诊断
流感病毒传入人群后，很快在人群中传播，发病急、潜伏期1～3天，患者以发热、头痛、咳嗽、全身无力为主要症状，持续几个星期左右，亦有伴腹泻、肺炎者，老年人或婴幼儿可导致死亡。流感病毒的流行对社会影响面广，人们的正常工作生活都受影响。所以尽快搞清病原，采取有效措施预防疾病传播非常重要。诊断流感病毒感染，传统上使用鸡胚或狗肾细胞培养，采用血凝或红细胞吸附现象检测病毒，运用单克隆抗体及血凝抑制试验确定亚型。但上述试验需要活病毒存在，而且费时费力。用免疫染色或酶联免疫吸附试验检测常常因敏感性太差出现假阴性结果。Yamada等[5]报告， 用RT-PCR方法从患者咽拭子标本中直接检测流感病毒基因，可以快速、准确地确定病原，而且可以通过运用甲型流感病毒H1、H3基因特异性引物进行亚型分析，在24小时内做出诊断。本研究中作者把咽拭子标本接种于MDCK细胞培养48小时后再进行了RT-PCR，这样病毒得到了增殖，提高检测阳性率，还可以较长时间保存标本。本实验所用的标本反复冻融多次，仍可检测出流感病毒基因。实验结果表明，RT-PCR法为特异、快速、敏感、简便的检测流感病毒感染的方法。
, http://www.100md.com
本研究用甲型流感病毒特异性引物，扩增乙型流感病毒，未出现阳性条带，说明此引物对甲型流感病毒特异。另外，作者用乙型流感病毒特异性引物对阳性标本进行了检测，亦未出现阳性，说明作者检测到的病毒确为甲型流感病毒，检测阳性率为60%。部分上呼吸道感染病人未检测出流感病毒，可能原因为个别标本中流感病毒RNA已降解，出现假阴性结果，另一部分可能为其它呼吸道病毒感染所致。我们同一时期检测到部分上呼吸道感染、肺炎患儿血清中，有呼吸道合胞病毒、腺病毒Ⅲ型及支原体抗体阳性者。
参考文献
1 黄祯祥，主编.医学病毒学基础及实验技术.北京：科学出版社，1990.661-691.
2 孟祥金. 丙型流感病毒的分子生物学和流行病学. 国外医学微生物学分册，1988，6:245-248.
3 侯云德，主编.分子病毒学.北京:学苑出版社，1990.313-328.
4 David OW， Frank JF. Medical Virology. 4t′ed, London： Academin, 1994, 498-499.
5 Yamada A, Imanishi J, Nakajima E, et al. Detection of influenza virus in throat swab by using polymerase chain reaction. Micro Immunol,1991,35: 259-265.
(收稿：1997-07-29 修回：1998-05-18), 百拇医药