一种FⅨ基因多态性在广西人群中的检出
作者：蒋迎佳 龙桂芳 谢建生
单位：530021 南宁，广西医科大学血红蛋白研究室(蒋迎佳现在510010 广州，广东省妇幼保健院)
关键词：Christmas病；因子Ⅸ；聚合酶链反应；多态性；限制性片段长度
中华儿科杂志981011 【摘要】 目的 研究广西人群FⅨ(凝血因子Ⅸ)基因多态性。方法 利用聚合酶链反应(PCR)和限制性内切酶Tru9 I(同功酶即Mse I)酶解技术,对120名志愿者进行研究。结果 首次在广西人群中发现FⅨ基因5′侧翼698位核苷酸存在Tru9 I多态性,该多态性由83 bp/58 bp+25 bp组成,二者的基因频率在受检的180个FⅨ基因中,分别为0.622和0.378,女性杂合子频率为0.473。结论 该发现有助于血友病乙携带者的检测及产前基因诊断。
, 百拇医药 A polymorphism of factor Ⅸ in the Guangxi People Jiang Yingjia, Long Guifang, Xie Jiansheng. Laboratory of Haemoglobin, Guangxi Medical University, Nanning 530021
【Abstract】 Objective To study the polymorphism of factor Ⅸ in Guangxi population. Methods Polymerase chain reaction (PCR) and restriction endonuclease digestion technique were used to examine the polymorphism of FⅨ in 120 volunteers of Guangxi population. Results A Tru9 I (MSE I) restriction fragment length polymorphism (RFLP) in the 5′ flanking region of the FⅨ gene was first identified in Guangxi. The polymorphism was constituted by three bands, 83 bp/58bp+25 bp. When the base 698 of 5′flanking region was C, a band, 83bp was seen. The frequencies were 0.622. When the base 698 was substituted by T, a new Tru9 I recognition sequence (TTAA) was created. Two bands of 58 bp and 25 bp were shown. The frequencies were 0.378. The female heterozygous showed all three bands and the frequencies were 0.473. Conclusion The findings seem to be useful for carrier detection and prenatal diagnosis of hemophilia B in Guangxi population.
, 百拇医药
【Key words】 Christmas disease Factor Ⅸ Polymorase chain reaction Polymorphism, restiction fragment length
血友病乙是一种X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病[1]。因编码因子Ⅸ(FⅨ)基因缺陷，导致FⅨ缺乏或结构异常，使凝血活性降低，从而形成严重的凝血功能障碍。因此，携带者的检测和产前基因诊断是降低缺陷基因频率的重要措施。当前对FⅨ基因突变尚未明确，分析FⅨ基因限制性片段长度多态性(RFLP)被认为是产前诊断和携带者检测的最好方法。为寻找我国广西人群中可能存在的FⅨ基因的多态性，我们对120名志愿者的180个FⅨ基因5′侧翼区698位核苷酸C和T进行了研究，报告如下。
对象和方法
一、对象
, http://www.100md.com 120名无血缘关系健康体检者，其中男性汉族和壮族人各30名，女性汉族和壮族人各30名。
二、方法
1.DNA标本:各取上述研究对象静脉血3～4 ml，用ACD(含红细胞保养成分的抗凝剂)抗凝(ACD∶全血=1∶4)。分离白细胞，于白细胞悬液中加1～2滴10%SDS十二烷基硫酸钠，之后按酚-氯仿法提取DNA。
2.聚合酶链反应(PCR)扩增:反应总体系为25 μl，内含模板DNA 0.5～1 μg、50 mmol Tris-HCI，pH 9.0、1.5 mmol MgCL2、0.1% Triton X-100、0.1 mmol dNTPs、引物0.3 μmol。引物序列为:(1)5′-GAT AGA GAA ACT GGA AGT AG-3′(2)5′-GTA TAA GTG GTC CAG TTA GT-3′。扩增的DNA片段长度为520 bp。首先于94℃预变性，加Taq DNA聚合酶0.5 μl (5 U/μl，华美公司)。然后以94℃30秒→51℃60秒→70℃60秒为一个循环，共33个循环。整个反应过程在自动DNA热循环仪(Perkin-Elm er DTC)完成。基因扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，紫外检测，观察结果。
, 百拇医药
3.Tru9 I(Mse I)酶解及分离:酶反应体系为20 μl，内含1×buffer(酶解缓冲液)基因扩增产物8 μl、Tru9I为0.5 μl(10 U/μl,Promega)、灭菌去离子水，65℃孵育过夜。然后将酶解产物进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE电泳)，以pGEM-7zf(+)/HaeⅢDNA(华美公司)作标准对照，EB染色，紫外线检测并照像记录。
结果
基因扩增后，得到520bp片段。Tru9 I(Mse I)的识别序列是TTAA。若698位核苷酸为C，520bp片段本身具有6个Tru9I酶切位点，经酶解以后，PAGE电泳，则出现83bp。若698位核苷酸为T，出现新的酶切位点(TTAA)，原83bp经酶切，分为58bp和25bp；故Tru9 I(Mse I)多态性由83bp/58bp+25bp组成。若是女性杂合子，则显示83bp，58bp和25bp(其中25bp片段太短，电泳后未能显示)。
, 百拇医药
本组120名受检者的180个FⅨ基因，经检测表明698位是C者有112个(基因频率0.622)，698位是T者有68个(基因频率0.378)，由公式算出女性Tru9 I杂合子频率为2×0.622×0.378=0.470。汉族与壮族FⅨ基因C/T情况见附表。
附表 汉族及壮族FⅨ基因C/T结果 民族
C
T
女性杂合子频率
汉族
55(0.611)
35(0.389)
0.475
, http://www.100md.com
壮族
57(0.633)
33(0.367)
0.463
合计
112(0.622)
68(0.378)
0.473
注:括号内为基因频率讨论
血友病乙在男性中发病率为1/25 000～1/30 000[2]。该病的基因缺陷种类较多，至今发现已超过600种[3],说明此病有很大的异质性。因此世界上仍热衷于简单的以多态性为基础的携带者分析方法。人FⅨ基因的多态性具有明显的种族差异，包括中国人在内的亚洲人FⅨ基因缺乏在欧洲人中普遍存在的多态性[4，5]。
, 百拇医药
我国是个多民族国家，56个民族中汉族人数最多，大约占全国人口的92%。少数民族中,壮族为最大的民族。广西壮族自治区地处祖国南疆，解放后重新查证，广西壮族人口有1 452万，约占全区人口的33%[6，7]。为了探索广西人群FⅨ基因限制性片段长度多态性存在的可能性，我们结合国内外文献报道，利用PCR/Tru9 I酶解技术对120名志愿者(汉族，壮族各60名)进行研究。首次在广西人群中发现FⅨ基因5′侧翼区698位核苷酸存在Tru9 I(即Mse I)多态性，其杂合子频率为0.473，为高杂合子频率，这与国内报道接近[8]。其中汉族人Tru9 I多态性杂合子频率为0.475，壮族人Tru9 I多态性杂合子频率为0.465，两者也十分接近。
该发现不仅改变了以往关于中国人缺乏FⅨ基因多态性的看法，同时提示Tru9 I在我国多民族人群中存在可能性。并且利用该多态性有助于广西血友病乙携带者筛查和产前基因诊断。
本课题由广西教委资助
, 百拇医药
参考文献
1 曾溢滔. 遗传性血液疾病. 北京:科学出版社, 1991.180-181.
2 刘京春. 血友病B分子生物学研究进展. 中华血液学杂志, 1992, 13:498-500.
3 杨天楹. 血友病临床与实验研究进展. 中华血液学杂志, 1993,14:551-557.
4 Chan VV, Yip B, Tong TM, et al. Molecular defects in haemophilia B: detection by direct estriction enzyme analysis. Br J Haematal,1991,79 :63-69.
5 Winship PR, Nichols CE, Chuansumrit A, et al. An Mse I RFLP in the 5′ flanking region of the factor Ⅸ gene: it′s use for haemophilia B carrier detection in Caucasian and Thai populations. Br J Haematal, 1993, 84:101-105.
6 Li XP. An outline zhuang history and culture. 南宁:广西民族出版社, 1995.1-5.
7 广西壮族自治区地方志编纂委员会. 广西通志7民俗篇. 南宁:广西人民出版社, 1991.1-10.
8 朱静, 王宁遂, 邓兵. 中国人凝血因子Ⅸ基因Mse I 多态性.中华血液学杂志, 1994,15:451-452.
(收稿：1998-01-08 修回：1998-05-19), http://www.100md.com
单位：530021 南宁，广西医科大学血红蛋白研究室(蒋迎佳现在510010 广州，广东省妇幼保健院)
关键词：Christmas病；因子Ⅸ；聚合酶链反应；多态性；限制性片段长度
中华儿科杂志981011 【摘要】 目的 研究广西人群FⅨ(凝血因子Ⅸ)基因多态性。方法 利用聚合酶链反应(PCR)和限制性内切酶Tru9 I(同功酶即Mse I)酶解技术,对120名志愿者进行研究。结果 首次在广西人群中发现FⅨ基因5′侧翼698位核苷酸存在Tru9 I多态性,该多态性由83 bp/58 bp+25 bp组成,二者的基因频率在受检的180个FⅨ基因中,分别为0.622和0.378,女性杂合子频率为0.473。结论 该发现有助于血友病乙携带者的检测及产前基因诊断。
, 百拇医药 A polymorphism of factor Ⅸ in the Guangxi People Jiang Yingjia, Long Guifang, Xie Jiansheng. Laboratory of Haemoglobin, Guangxi Medical University, Nanning 530021
【Abstract】 Objective To study the polymorphism of factor Ⅸ in Guangxi population. Methods Polymerase chain reaction (PCR) and restriction endonuclease digestion technique were used to examine the polymorphism of FⅨ in 120 volunteers of Guangxi population. Results A Tru9 I (MSE I) restriction fragment length polymorphism (RFLP) in the 5′ flanking region of the FⅨ gene was first identified in Guangxi. The polymorphism was constituted by three bands, 83 bp/58bp+25 bp. When the base 698 of 5′flanking region was C, a band, 83bp was seen. The frequencies were 0.622. When the base 698 was substituted by T, a new Tru9 I recognition sequence (TTAA) was created. Two bands of 58 bp and 25 bp were shown. The frequencies were 0.378. The female heterozygous showed all three bands and the frequencies were 0.473. Conclusion The findings seem to be useful for carrier detection and prenatal diagnosis of hemophilia B in Guangxi population.
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【Key words】 Christmas disease Factor Ⅸ Polymorase chain reaction Polymorphism, restiction fragment length
血友病乙是一种X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病[1]。因编码因子Ⅸ(FⅨ)基因缺陷，导致FⅨ缺乏或结构异常，使凝血活性降低，从而形成严重的凝血功能障碍。因此，携带者的检测和产前基因诊断是降低缺陷基因频率的重要措施。当前对FⅨ基因突变尚未明确，分析FⅨ基因限制性片段长度多态性(RFLP)被认为是产前诊断和携带者检测的最好方法。为寻找我国广西人群中可能存在的FⅨ基因的多态性，我们对120名志愿者的180个FⅨ基因5′侧翼区698位核苷酸C和T进行了研究，报告如下。
对象和方法
一、对象
, http://www.100md.com 120名无血缘关系健康体检者，其中男性汉族和壮族人各30名，女性汉族和壮族人各30名。
二、方法
1.DNA标本:各取上述研究对象静脉血3～4 ml，用ACD(含红细胞保养成分的抗凝剂)抗凝(ACD∶全血=1∶4)。分离白细胞，于白细胞悬液中加1～2滴10%SDS十二烷基硫酸钠，之后按酚-氯仿法提取DNA。
2.聚合酶链反应(PCR)扩增:反应总体系为25 μl，内含模板DNA 0.5～1 μg、50 mmol Tris-HCI，pH 9.0、1.5 mmol MgCL2、0.1% Triton X-100、0.1 mmol dNTPs、引物0.3 μmol。引物序列为:(1)5′-GAT AGA GAA ACT GGA AGT AG-3′(2)5′-GTA TAA GTG GTC CAG TTA GT-3′。扩增的DNA片段长度为520 bp。首先于94℃预变性，加Taq DNA聚合酶0.5 μl (5 U/μl，华美公司)。然后以94℃30秒→51℃60秒→70℃60秒为一个循环，共33个循环。整个反应过程在自动DNA热循环仪(Perkin-Elm er DTC)完成。基因扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，紫外检测，观察结果。
, 百拇医药
3.Tru9 I(Mse I)酶解及分离:酶反应体系为20 μl，内含1×buffer(酶解缓冲液)基因扩增产物8 μl、Tru9I为0.5 μl(10 U/μl,Promega)、灭菌去离子水，65℃孵育过夜。然后将酶解产物进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE电泳)，以pGEM-7zf(+)/HaeⅢDNA(华美公司)作标准对照，EB染色，紫外线检测并照像记录。
结果
基因扩增后，得到520bp片段。Tru9 I(Mse I)的识别序列是TTAA。若698位核苷酸为C，520bp片段本身具有6个Tru9I酶切位点，经酶解以后，PAGE电泳，则出现83bp。若698位核苷酸为T，出现新的酶切位点(TTAA)，原83bp经酶切，分为58bp和25bp；故Tru9 I(Mse I)多态性由83bp/58bp+25bp组成。若是女性杂合子，则显示83bp，58bp和25bp(其中25bp片段太短，电泳后未能显示)。
, 百拇医药
本组120名受检者的180个FⅨ基因，经检测表明698位是C者有112个(基因频率0.622)，698位是T者有68个(基因频率0.378)，由公式算出女性Tru9 I杂合子频率为2×0.622×0.378=0.470。汉族与壮族FⅨ基因C/T情况见附表。
附表 汉族及壮族FⅨ基因C/T结果 民族
C
T
女性杂合子频率
汉族
55(0.611)
35(0.389)
0.475
, http://www.100md.com
壮族
57(0.633)
33(0.367)
0.463
合计
112(0.622)
68(0.378)
0.473
注:括号内为基因频率讨论
血友病乙在男性中发病率为1/25 000～1/30 000[2]。该病的基因缺陷种类较多，至今发现已超过600种[3],说明此病有很大的异质性。因此世界上仍热衷于简单的以多态性为基础的携带者分析方法。人FⅨ基因的多态性具有明显的种族差异，包括中国人在内的亚洲人FⅨ基因缺乏在欧洲人中普遍存在的多态性[4，5]。
, 百拇医药
我国是个多民族国家，56个民族中汉族人数最多，大约占全国人口的92%。少数民族中,壮族为最大的民族。广西壮族自治区地处祖国南疆，解放后重新查证，广西壮族人口有1 452万，约占全区人口的33%[6，7]。为了探索广西人群FⅨ基因限制性片段长度多态性存在的可能性，我们结合国内外文献报道，利用PCR/Tru9 I酶解技术对120名志愿者(汉族，壮族各60名)进行研究。首次在广西人群中发现FⅨ基因5′侧翼区698位核苷酸存在Tru9 I(即Mse I)多态性，其杂合子频率为0.473，为高杂合子频率，这与国内报道接近[8]。其中汉族人Tru9 I多态性杂合子频率为0.475，壮族人Tru9 I多态性杂合子频率为0.465，两者也十分接近。
该发现不仅改变了以往关于中国人缺乏FⅨ基因多态性的看法，同时提示Tru9 I在我国多民族人群中存在可能性。并且利用该多态性有助于广西血友病乙携带者筛查和产前基因诊断。
本课题由广西教委资助
, 百拇医药
参考文献
1 曾溢滔. 遗传性血液疾病. 北京:科学出版社, 1991.180-181.
2 刘京春. 血友病B分子生物学研究进展. 中华血液学杂志, 1992, 13:498-500.
3 杨天楹. 血友病临床与实验研究进展. 中华血液学杂志, 1993,14:551-557.
4 Chan VV, Yip B, Tong TM, et al. Molecular defects in haemophilia B: detection by direct estriction enzyme analysis. Br J Haematal,1991,79 :63-69.
5 Winship PR, Nichols CE, Chuansumrit A, et al. An Mse I RFLP in the 5′ flanking region of the factor Ⅸ gene: it′s use for haemophilia B carrier detection in Caucasian and Thai populations. Br J Haematal, 1993, 84:101-105.
6 Li XP. An outline zhuang history and culture. 南宁:广西民族出版社, 1995.1-5.
7 广西壮族自治区地方志编纂委员会. 广西通志7民俗篇. 南宁:广西人民出版社, 1991.1-10.
8 朱静, 王宁遂, 邓兵. 中国人凝血因子Ⅸ基因Mse I 多态性.中华血液学杂志, 1994,15:451-452.
(收稿：1998-01-08 修回：1998-05-19), http://www.100md.com