从分子水平研究小儿细菌感染
作者：吴仕孝 沈犁 余加林 唐军 刘友学 唐毅 彭若奇 尚世强 张万明
单位：400016 重庆医科大学儿科研究所
关键词：
中华儿科杂志981132 小儿细菌感染很常见，但从分子水平研究小儿细菌感染的报告尚少，现将我们在这方面所做的工作报道如下。
(一)质粒分析
质粒(plasmid)是染色体外的基因，与细菌致病性、耐药性等密切相关；耐药(R)质粒常含有多种耐药基因，它不但传给后代还可转移至无此质粒的细菌，使其由敏感菌变为耐药菌。不同菌株常含有数目及大小不等的质粒，利用相同质粒谱可追踪出传染源及寻找出传播途径。
1.重庆两医院发生新生儿流行性腹泻，69人患病。流行株EPEC O127：H6均含60、1.5 Md质粒。利用相同质粒谱证实：传染源来自首例患儿的母亲，患儿通过产道吞入了EPEC O127：H6而发病，再通过护士的手在婴儿间传播。消除60 Md质粒后，该菌对青霉素、氯霉素、四环素由耐药变为敏感，表明60 Md质粒含有对上述三种药的耐药基因[1]。
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2.某院鼠伤寒沙门菌感染流行，12名由该菌所致腹泻新生儿中7例血培养阳性。30株流行株均含3.8、67、98 kb质粒，非流行株含3.3、67、98 kb质粒。流行株也从首例患儿母亲粪便、奶瓶外表及护士手分离出，而牛奶、空气等均阴性，故传染源是先证者母亲，通过护士的手在婴儿间传播。消除98 kb质粒后，该菌对氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素、氯霉素、四环素的耐药性消失，表明98 kb质粒是R质粒，编码了以上5种药物的耐药基因[2]。
3.一产婴室暴发金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)感染，98份标本中分离出22株金葡菌。6例患儿脓疮液的金葡菌均含2.8 Md质粒，含此质粒的金葡菌仅从一医生鼻孔及其手分离出，其他人员分离出的金葡菌均无此质粒,故可确定该医生为传染源,并通过她的手在产婴间传播[3]。
4. 140名产婴生后12小时鼻孔、脐部金葡菌定植率分别为34.3%、17.9%，第二天为85.3%、79.4%，第三天为94.7%、93.9%，4天后均为100%。产婴金葡菌感染率15%。定值及感染的金葡菌均含1.4、1.7 Md质粒，1 358次采样培养结果，上述质粒的金葡菌仅在 5名护士鼻孔及手检出，表明定值及感染的金葡菌均来自护士，并通过其手在产婴中传播。对护士手指采样培养， 17例中5例检出金葡菌，洗手后即培养8例中仍有2例阳性；洗手后阴性护士护理新生儿后7例中4例检出金葡菌，因此在护理新生儿前后均应认真洗手[4]。
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5.首次报道3例新生儿败血症由凝固酶阴性的溶血葡萄球菌所致，此3株分别含1.6、1.8 、2.2 Md 质粒，98次采样培养未发现感染源[5]。
6.从1 554份标本分离出金葡菌276株，烧伤创面金葡菌感染率为25.2%(29/115)，54株流行株均含1.6、1.9 Md质粒，1.9 Md质粒含有10种耐药基因，利用相同质粒谱证实，8例患儿创面感染的金葡菌来自护理患儿家属的手[6]。
(二)限制酶分析
各种限制酶(restriction enzyme)各有其特异的酶切位点，故可鉴别有时分子量相同但核苷酸排列不同的质粒；还可酶切不含质粒细菌的染色体和病毒的DNA。酶切后的DNA片段完全一致，表明核苷酸上碱基排列顺序相同，确系同一菌株或病毒株，反之则否，故限制酶分析较质粒分析更加精确，用途更广。
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1.上述EPEC O127：H6流行株经Bam HI酶切后产生一致的6条DNA片段，表明确系同一菌株[1]。
2.上述鼠伤寒沙门菌流行株与非流行株3.8、3.3 kb一个质粒稍有不同，但用HindⅢ酶切后流行株有三个DNA片段(13.2、9.2、0.5 kb)非流行株没有，后者也有三个DNA片段(10.2、3.8、1.0 kb)前者缺乏，表明限制酶分析更加精确[2]。
3.新生儿败血症31对血培养阳性的凝固酶阴性葡萄球菌中，仅10对细菌的质粒谱与限制酶酶切谱相同，表明确是同一菌株，21对不同者实系污染。1例患儿两份标本质粒谱相同(3.4、7.2 kb)，但Hind Ⅲ酶切后一个含1.7、2.1、2.5、2.9、3.2 kb五个DNA片段，另一个含2.2、2.9、9.3、4.1 kb四个DNA片段，表明并非同一菌株[7]。
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4. 20例新生儿皮下坏疽中 8例患儿由同一流行株金葡菌引起。一株含4.2与31 kb质粒与另一株含4.2、28.5 kb质粒的金葡菌经EcoRI酶切后产生一致的五条DNA片段(2.3、3.0、4.3、6.5、17.5 kb)，故二者不仅4.2 kb质粒DNA上碱基顺序相同，而且28.5 kb与31 kb质粒DNA上碱基顺序也高度同源，系同一质粒在各菌株中经缺失、重组机制表现为大小略有差异(28.5与31 kb)的分子形式[8]。
(三)外膜蛋白(OMP)电泳
可作为革兰阴性细菌的一种分型方法,也可用来研究某些疾病的发病机制。
1.上述EPEC O127：H6流行株OMP电泳后均产生一致的五条OMP，表明确系同一菌株[1]。
, 百拇医药 2.我院新生儿室 56株不动杆菌流行株均具有一致的十条 DNA，而非流行株多一条25 kb OMP[9]。
3. EPEC O127：H6在体外对HeLa、HEP-2及FL细胞均产生局灶性粘附，用该菌1011从胃管注入10只家兔后均发生腹泻，尸体解剖见小肠下段扩张，充满黄绿色液体；光镜下见肠粘膜刷状缘有杆菌粘附；电镜下见杆菌粘附处微绒毛消失，肠上皮细胞内陷成环状。将该菌60 Md质粒消除后，其五条主要OMP中45及82 kd两条主要OMP也消失，此质粒消除株对上述细胞不产生粘附，用该菌1011由胃管注入另10条家兔后均无腹泻。故60 Md基因表达产物为45及82 kd主要OMP，其生物活性与该菌致病性有关，表现为局灶性粘附，使小肠微绒毛破坏消失，吸收水分、电解质等减少而导致腹泻[10]。
(四)聚合酶链反应(PCR)
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对重庆278名孕妇取宫颈拭子用McCoy细胞培养沙眼衣原体(CT)，10.8%(30/278)阳性，而PCR检测CT14.0%(39/278)阳性。母婴垂直传播CT的发生率为55.0%，其婴儿29.3%发生CT结膜炎，18.2%发生CT肺炎[11]。
(五)DNA序列分析
一例母亲宫颈拭子及其子鼻咽拭子用PCR扩增出的CT DNA，以pUC19质粒为载体，转化到大肠杆菌DH5α上，增殖后提取重组质粒，用通用引物α-32p-dATP标记，双脱氧链末端终止法测序，结果两标本DNA上碱基的排列序列完全一致，与CT血清型E相同，首次从DNA序列分析分子水平证实母婴垂直传播CT[11]。
(六)裂解酶片段长度多态性(CFLP)
CFLP是利用裂解酶(cleavase)的特性，有效地将 DNA单链在一定条件下自身形成发夹圈底部 5端核苷酸序列切断，经变性聚丙烯酰胺电泳分离开，然后有标记的一段核苷酸链显影从而得到 CFLP图谱，可敏锐地反映核苷酸序列的细微变化，具有快速、灵敏、准确、操作简单等特点，分析结果时间只需1～6小时。我们首次建立[α-35S]dATP标记CFLP方法初步用于CT的基因分型。5份新生儿鼻咽拭子培养CT阳性的DNA用聚合酶催化后用1169基因扩增仪作裂解酶的裂解反应，结果3份标本CFLP图谱相同均出现10个条带，DNA序列测定为E型，2份标本CFLP为另一相同图谱有13个条带，DNA序列测定为 F型。
, 百拇医药
本课题由两项国家自然科学基金资助(基金编号：3870771，39270702)及卫生部重点科研资助(部-儿-52)
参考文献
1 Wu SX, Peng RQ. Studies on an outbreak of neonatal diarrhea casued by EPEC O127∶H6 with plasmid analysis restriction analysis and outer membrane protein determination. Acta Paediatr, 1992, 81:217-221.
2 Wu SX, Tang Y, Molecular epidemiologic study of an outbreak of Samonella typhiurium infection at a newbron nursery. Chinese Medical J, 1993, 106:423-427.
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3 吴仕孝，沈犁.质粒分析在新生儿葡萄球菌感染中的应用.中华儿科杂志，1987，25：199-202.
4 Wu SX, Shen L. Plasmid analysis and phage typing in the study of staphylococcal colonization and disease in newborn infants. Chinese Medical Science J, 1993, 8:157-161.
5 Wu SX, Shen L, Tang J. Neonatal septicemia caused by coagulase negative staphylococcus with plasmid analysis. Acta Paediatr Scand, 1988, 77:308-309.
6 Wu SX, Liu YX. Molecular epidemiologic study on burn wound infection caused by Staphylococcus aureus in children. Chinese Medical J, 1994, 107:570-573.
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7 Wu SX, Shangg SQ. Study on coagulase negative staphyloccol septicemia in Chinese low birth weight infants. Acta Paediatr, 1994, 83:226-228.
8 Wu SX, Tang J. Epidemiologic study of neonatal subcutaneous gangrene caused by multiresistant Staphylococcus aureus. Acta Paediatr Scand, 1989, 78:222-227.
9 吴仕孝，唐毅，彭若奇，等.细菌外膜蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳在新生儿细菌感染中的应用.中华传染病杂志，1992，10：192-195.
10 Wu SX, Peng RQ. Studies on adherence and outer membrane protein of EPEC O127:H6 and their related plasmids. Acta Paediatr Scand, 1991, 80:1019-1024.
11 吴仕孝，沈犁，刘官信.母婴垂直传播沙眼衣原体的聚合酶链反应及测序研究.中华儿科杂志，1997，35：283-285.
(收稿：1997-12-16 修回：1998-04-28), http://www.100md.com
单位：400016 重庆医科大学儿科研究所
关键词：
中华儿科杂志981132 小儿细菌感染很常见，但从分子水平研究小儿细菌感染的报告尚少，现将我们在这方面所做的工作报道如下。
(一)质粒分析
质粒(plasmid)是染色体外的基因，与细菌致病性、耐药性等密切相关；耐药(R)质粒常含有多种耐药基因，它不但传给后代还可转移至无此质粒的细菌，使其由敏感菌变为耐药菌。不同菌株常含有数目及大小不等的质粒，利用相同质粒谱可追踪出传染源及寻找出传播途径。
1.重庆两医院发生新生儿流行性腹泻，69人患病。流行株EPEC O127：H6均含60、1.5 Md质粒。利用相同质粒谱证实：传染源来自首例患儿的母亲，患儿通过产道吞入了EPEC O127：H6而发病，再通过护士的手在婴儿间传播。消除60 Md质粒后，该菌对青霉素、氯霉素、四环素由耐药变为敏感，表明60 Md质粒含有对上述三种药的耐药基因[1]。
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2.某院鼠伤寒沙门菌感染流行，12名由该菌所致腹泻新生儿中7例血培养阳性。30株流行株均含3.8、67、98 kb质粒，非流行株含3.3、67、98 kb质粒。流行株也从首例患儿母亲粪便、奶瓶外表及护士手分离出，而牛奶、空气等均阴性，故传染源是先证者母亲，通过护士的手在婴儿间传播。消除98 kb质粒后，该菌对氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素、氯霉素、四环素的耐药性消失，表明98 kb质粒是R质粒，编码了以上5种药物的耐药基因[2]。
3.一产婴室暴发金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)感染，98份标本中分离出22株金葡菌。6例患儿脓疮液的金葡菌均含2.8 Md质粒，含此质粒的金葡菌仅从一医生鼻孔及其手分离出，其他人员分离出的金葡菌均无此质粒,故可确定该医生为传染源,并通过她的手在产婴间传播[3]。
4. 140名产婴生后12小时鼻孔、脐部金葡菌定植率分别为34.3%、17.9%，第二天为85.3%、79.4%，第三天为94.7%、93.9%，4天后均为100%。产婴金葡菌感染率15%。定值及感染的金葡菌均含1.4、1.7 Md质粒，1 358次采样培养结果，上述质粒的金葡菌仅在 5名护士鼻孔及手检出，表明定值及感染的金葡菌均来自护士，并通过其手在产婴中传播。对护士手指采样培养， 17例中5例检出金葡菌，洗手后即培养8例中仍有2例阳性；洗手后阴性护士护理新生儿后7例中4例检出金葡菌，因此在护理新生儿前后均应认真洗手[4]。
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5.首次报道3例新生儿败血症由凝固酶阴性的溶血葡萄球菌所致，此3株分别含1.6、1.8 、2.2 Md 质粒，98次采样培养未发现感染源[5]。
6.从1 554份标本分离出金葡菌276株，烧伤创面金葡菌感染率为25.2%(29/115)，54株流行株均含1.6、1.9 Md质粒，1.9 Md质粒含有10种耐药基因，利用相同质粒谱证实，8例患儿创面感染的金葡菌来自护理患儿家属的手[6]。
(二)限制酶分析
各种限制酶(restriction enzyme)各有其特异的酶切位点，故可鉴别有时分子量相同但核苷酸排列不同的质粒；还可酶切不含质粒细菌的染色体和病毒的DNA。酶切后的DNA片段完全一致，表明核苷酸上碱基排列顺序相同，确系同一菌株或病毒株，反之则否，故限制酶分析较质粒分析更加精确，用途更广。
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1.上述EPEC O127：H6流行株经Bam HI酶切后产生一致的6条DNA片段，表明确系同一菌株[1]。
2.上述鼠伤寒沙门菌流行株与非流行株3.8、3.3 kb一个质粒稍有不同，但用HindⅢ酶切后流行株有三个DNA片段(13.2、9.2、0.5 kb)非流行株没有，后者也有三个DNA片段(10.2、3.8、1.0 kb)前者缺乏，表明限制酶分析更加精确[2]。
3.新生儿败血症31对血培养阳性的凝固酶阴性葡萄球菌中，仅10对细菌的质粒谱与限制酶酶切谱相同，表明确是同一菌株，21对不同者实系污染。1例患儿两份标本质粒谱相同(3.4、7.2 kb)，但Hind Ⅲ酶切后一个含1.7、2.1、2.5、2.9、3.2 kb五个DNA片段，另一个含2.2、2.9、9.3、4.1 kb四个DNA片段，表明并非同一菌株[7]。
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4. 20例新生儿皮下坏疽中 8例患儿由同一流行株金葡菌引起。一株含4.2与31 kb质粒与另一株含4.2、28.5 kb质粒的金葡菌经EcoRI酶切后产生一致的五条DNA片段(2.3、3.0、4.3、6.5、17.5 kb)，故二者不仅4.2 kb质粒DNA上碱基顺序相同，而且28.5 kb与31 kb质粒DNA上碱基顺序也高度同源，系同一质粒在各菌株中经缺失、重组机制表现为大小略有差异(28.5与31 kb)的分子形式[8]。
(三)外膜蛋白(OMP)电泳
可作为革兰阴性细菌的一种分型方法,也可用来研究某些疾病的发病机制。
1.上述EPEC O127：H6流行株OMP电泳后均产生一致的五条OMP，表明确系同一菌株[1]。
, 百拇医药 2.我院新生儿室 56株不动杆菌流行株均具有一致的十条 DNA，而非流行株多一条25 kb OMP[9]。
3. EPEC O127：H6在体外对HeLa、HEP-2及FL细胞均产生局灶性粘附，用该菌1011从胃管注入10只家兔后均发生腹泻，尸体解剖见小肠下段扩张，充满黄绿色液体；光镜下见肠粘膜刷状缘有杆菌粘附；电镜下见杆菌粘附处微绒毛消失，肠上皮细胞内陷成环状。将该菌60 Md质粒消除后，其五条主要OMP中45及82 kd两条主要OMP也消失，此质粒消除株对上述细胞不产生粘附，用该菌1011由胃管注入另10条家兔后均无腹泻。故60 Md基因表达产物为45及82 kd主要OMP，其生物活性与该菌致病性有关，表现为局灶性粘附，使小肠微绒毛破坏消失，吸收水分、电解质等减少而导致腹泻[10]。
(四)聚合酶链反应(PCR)
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对重庆278名孕妇取宫颈拭子用McCoy细胞培养沙眼衣原体(CT)，10.8%(30/278)阳性，而PCR检测CT14.0%(39/278)阳性。母婴垂直传播CT的发生率为55.0%，其婴儿29.3%发生CT结膜炎，18.2%发生CT肺炎[11]。
(五)DNA序列分析
一例母亲宫颈拭子及其子鼻咽拭子用PCR扩增出的CT DNA，以pUC19质粒为载体，转化到大肠杆菌DH5α上，增殖后提取重组质粒，用通用引物α-32p-dATP标记，双脱氧链末端终止法测序，结果两标本DNA上碱基的排列序列完全一致，与CT血清型E相同，首次从DNA序列分析分子水平证实母婴垂直传播CT[11]。
(六)裂解酶片段长度多态性(CFLP)
CFLP是利用裂解酶(cleavase)的特性，有效地将 DNA单链在一定条件下自身形成发夹圈底部 5端核苷酸序列切断，经变性聚丙烯酰胺电泳分离开，然后有标记的一段核苷酸链显影从而得到 CFLP图谱，可敏锐地反映核苷酸序列的细微变化，具有快速、灵敏、准确、操作简单等特点，分析结果时间只需1～6小时。我们首次建立[α-35S]dATP标记CFLP方法初步用于CT的基因分型。5份新生儿鼻咽拭子培养CT阳性的DNA用聚合酶催化后用1169基因扩增仪作裂解酶的裂解反应，结果3份标本CFLP图谱相同均出现10个条带，DNA序列测定为E型，2份标本CFLP为另一相同图谱有13个条带，DNA序列测定为 F型。
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本课题由两项国家自然科学基金资助(基金编号：3870771，39270702)及卫生部重点科研资助(部-儿-52)
参考文献
1 Wu SX, Peng RQ. Studies on an outbreak of neonatal diarrhea casued by EPEC O127∶H6 with plasmid analysis restriction analysis and outer membrane protein determination. Acta Paediatr, 1992, 81:217-221.
2 Wu SX, Tang Y, Molecular epidemiologic study of an outbreak of Samonella typhiurium infection at a newbron nursery. Chinese Medical J, 1993, 106:423-427.
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3 吴仕孝，沈犁.质粒分析在新生儿葡萄球菌感染中的应用.中华儿科杂志，1987，25：199-202.
4 Wu SX, Shen L. Plasmid analysis and phage typing in the study of staphylococcal colonization and disease in newborn infants. Chinese Medical Science J, 1993, 8:157-161.
5 Wu SX, Shen L, Tang J. Neonatal septicemia caused by coagulase negative staphylococcus with plasmid analysis. Acta Paediatr Scand, 1988, 77:308-309.
6 Wu SX, Liu YX. Molecular epidemiologic study on burn wound infection caused by Staphylococcus aureus in children. Chinese Medical J, 1994, 107:570-573.
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7 Wu SX, Shangg SQ. Study on coagulase negative staphyloccol septicemia in Chinese low birth weight infants. Acta Paediatr, 1994, 83:226-228.
8 Wu SX, Tang J. Epidemiologic study of neonatal subcutaneous gangrene caused by multiresistant Staphylococcus aureus. Acta Paediatr Scand, 1989, 78:222-227.
9 吴仕孝，唐毅，彭若奇，等.细菌外膜蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳在新生儿细菌感染中的应用.中华传染病杂志，1992，10：192-195.
10 Wu SX, Peng RQ. Studies on adherence and outer membrane protein of EPEC O127:H6 and their related plasmids. Acta Paediatr Scand, 1991, 80:1019-1024.
11 吴仕孝，沈犁，刘官信.母婴垂直传播沙眼衣原体的聚合酶链反应及测序研究.中华儿科杂志，1997，35：283-285.
(收稿：1997-12-16 修回：1998-04-28), http://www.100md.com