急性淋巴细胞白血病微小残留病追踪检测的新方法
作者：肖燕 费洪宝 梁欣荃 金润铭 杨爱德
单位：430022 武汉，同济医科大学附属协和医院儿科
关键词：
中华儿科杂志9811122 急性淋巴细胞白血病(ALL，急淋)经治疗达到完全缓解后，复发的根源在于体内微小残留病(MRD)的存在。动态检测体内MRD，对于指导临床治疗和预防白血病复发具有重要意义。为了使急性淋巴细胞白血病MRD的检测在达到灵敏和特异的同时，又能快速、经济和方便，作者建立了一种以T细胞抗原受体γ链(TCRγ)重排基因为标志，RNA酶保护法与硝酸银染色相结合的新的非同位素方法，现报告如下。
材料及方法：1.细胞系及临床标本：细胞系Sup B7来自1例普通型急性淋巴细胞白血病(C-ALL)患儿的白血病细胞，具有TCRγ基因重排。临床标本54份取自20例白血病病人的骨髓细胞，其中缓解期标本34份。白血病的诊断根据FAB分型，20例病人均进行了免疫学分型，T系急淋5例，非T急淋15例。
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2.寡核苷酸引物：用于扩增TCRγ基因重排的引物序列为JrT7：5′-GC-TAATACGACTCACTATGGGAGAGCAACAAGTGTTGTTCCAC-3′；Vr 1，3：5′-CGGCTACATCCACTGGTACCT-3′；VrT7：5′-GC-TAATACGACTCACTATGGGAGACGGCTACATCCACTGGTACCT-3′；JrI7：5′-GTTCCACTGCCAAAGAGTTTCTT-3′。其中，Vr 1,3和JrT7是为制备探针RNA所设计的引物，JrT7在它的5′末端包含有一个RNA聚合酶的启动子序列。VrT7和JrI7是为制备待测样本RNA设计的，VrT7在它的5′末端也带有一个T7RNA酶启动子序列。
3.聚合酶链反应(PCR)：用苯酚抽提法提取DNA。反应体系50 μl，模板基因组DNA 1 μg。共30个循环。
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4.体外转录：PCR阳性产物经蛋白酶K消化，苯酚抽提，无水乙醇沉淀后重溶于等体积(TE)中备用。取每个反应体系的PCR产物6 μl进行体外转录。转录反应体系50 μl，为防止转录本被RNA酶降解，反应体系中加入RNA酶抑制剂。转录后，模板DNA用无RNA酶的DNA酶I消化。
5.RNA转录本分子杂交和RNA酶消化：探针RNA与待测RNA在40 μl体系中以1∶1的比例杂交。杂交完成后，为消化不配对核苷酸，于反应体系中加入RNA酶A进行消化。
6.电泳和硝酸银染色：经消化后的杂交产物用含7.6 mol/L尿素的6%聚丙稀酰胺变性胶(PAG)中电泳。电泳后凝胶用银染法检测结果，具体步骤：(1)双蒸水漂洗；(2)乙酸固定；(3)AgNO3染色；(4)0.25 MNa2CO3中显色。
结果：1.特异性和敏感性检测：用等浓度的正常骨髓细胞DNA对Sup B7细胞系DNA进行对数稀释，直至10-6。以每份稀释样本1 μg DNA用引物VrT7和JrI7进行PCR扩增，而后转录成待测RNA，用相同方法扩增和转录了本研究中1例患儿和1例正常人的DNA样本，制备成待测RNA。取未经稀释的Sup B7细胞系DNA，用引物Vr 1，3和JrT7扩增，并转录成探针RNA。从探针RNA中分别取20 μl与上述9个待测RNA样本以等体积杂交，RNA酶消化，PAG电泳和硝酸银染色。其结果为：探针与正常人和1例白血病患者的交叉杂交产物均未见到完整的被保护片段。而探针与对数稀释的7个样本的杂交产物，除10-6外，均可见到完整的被保护片段，而且其染色强度随着对数稀释度的增加而减弱。其检测结果说明本方法特异性强，敏感度可达到10-5水平。
, 百拇医药
2.MRD的追踪检测：对20例急淋患者的检测发现，15例可见到预计大小的被保护片段，故本组资料TCRγ单克隆重排基因的发生率为75%，检测诱导缓解治疗后0.5～2个月的标本共13份，全部阳性；3～4个月标本10份，7份阳性；5个月以上标本6份，1份阳性。
讨论：目前认为急淋白血病是一组异质性疾病，缺乏肿瘤特异性的基因标志。但由于其同时又具有单克隆特性，因此现在多采用免疫球蛋白重链基因(IgH)和TCR基因重排作为克隆标志来检测MRD。由于IgH基因重排在病程中约有50%发生克隆演变，而TCR较稳定，改变较少见，且通常只涉及两个等位基因之一[1，2]，因此，选用TCR基因重排作为分子标志是较合适的。当然，为防止克隆演变所造成的假阴性结果，若能同时选用两种基因标志(IgH，TCRγ)进行检测是最理想的。
目前用于MRD的检测方法，PCR是最为敏感的，其灵敏度可达10-5水平。但国外资料中用PCR检测时通常的方法是：用诊断时的肿瘤标本作PCR，将其产物直接作序列分析，根据序列分析的结果，构建一对与之相配对的特异性引物和探针，用构建的特异性引物对缓解期标本进行PCR扩增，再用合成的特异性探针与缓解期PCR产物杂交，分析结果[3]。这个方法的不足之处在于：一旦测序过程中或者在寡核苷酸片段合成中出现错误，就不可避免地出现假阴性结果。同时测序和DNA合成所需试剂和仪器都是昂贵的，也耗费时间[4]。
, 百拇医药
而本实验方法，由于在分别用于扩增急性期和缓解期标本的两对引物的相对位置上带有T7RNA聚合酶启动子序列，故用带有该序列的两条DNA产物进行体外转录时就将产生完全互补的两条RNA单链，一条为探针RNA，另一条为待测RNA。根据精确配对的RNA双链能抵抗RNA酶消化的原理，从杂交体的RNA酶消化结果中，就可确定是否有肿瘤细胞的存在，从而保证了本实验方法的特异性，交叉实验的阴性结果证明了这一点。同时，实验方法也较简便、经济。
MRD检测方法运用中，放射性污染一直是影响临床推广的主要原因之一。本方法中采用的硝酸银染色技术，价格便宜，操作简便。对数稀释试验证明，其灵敏度可以达到本实验理论上最高值(10-5)，因此，完全可代替同位素，使MRD检测更利于临床推广。
本课题由国家自然科学基金资助(基金编号：39470786)
参考文献
, 百拇医药
1 Jacques J M, Van Dongen, Timo M, et al. Adriaansen, detection of minimal residual disease in acute leukemia by immunological marker analysis and polymerase chain reaction. Leukemia, 1992: 6 (Suppl 1), 47-59.
2 Beishuizen A, Hahlen K, Van Wering E R. Detection of minimal residual disease in childhood leukemia with the polymerase chain reaction. N Engl J Med, 1991, 324:772-773.
3 Hendrik Veelken, Benjamin Tycko, Jeffrey Sklar. Sensitive detection of clonal antigen receptor gene rearrangement for the diagnosis and monitoring of lymphoid neoplasms by a polymerase chain reaction-mediated ribonuclease protection assay. Blood, 1991, 78:1318-1326.
4 Lefranc MP, Forster A, Bear R, et al. Diversity and rearrangement of human T cell rearranging γ gene: nine germ-line variable genes belonging to the subgroup. Cell, 1986, 45:237-286.
(收稿：1997-12-17 修回：1998-06-18), 百拇医药
单位：430022 武汉，同济医科大学附属协和医院儿科
关键词：
中华儿科杂志9811122 急性淋巴细胞白血病(ALL，急淋)经治疗达到完全缓解后，复发的根源在于体内微小残留病(MRD)的存在。动态检测体内MRD，对于指导临床治疗和预防白血病复发具有重要意义。为了使急性淋巴细胞白血病MRD的检测在达到灵敏和特异的同时，又能快速、经济和方便，作者建立了一种以T细胞抗原受体γ链(TCRγ)重排基因为标志，RNA酶保护法与硝酸银染色相结合的新的非同位素方法，现报告如下。
材料及方法：1.细胞系及临床标本：细胞系Sup B7来自1例普通型急性淋巴细胞白血病(C-ALL)患儿的白血病细胞，具有TCRγ基因重排。临床标本54份取自20例白血病病人的骨髓细胞，其中缓解期标本34份。白血病的诊断根据FAB分型，20例病人均进行了免疫学分型，T系急淋5例，非T急淋15例。
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2.寡核苷酸引物：用于扩增TCRγ基因重排的引物序列为JrT7：5′-GC-TAATACGACTCACTATGGGAGAGCAACAAGTGTTGTTCCAC-3′；Vr 1，3：5′-CGGCTACATCCACTGGTACCT-3′；VrT7：5′-GC-TAATACGACTCACTATGGGAGACGGCTACATCCACTGGTACCT-3′；JrI7：5′-GTTCCACTGCCAAAGAGTTTCTT-3′。其中，Vr 1,3和JrT7是为制备探针RNA所设计的引物，JrT7在它的5′末端包含有一个RNA聚合酶的启动子序列。VrT7和JrI7是为制备待测样本RNA设计的，VrT7在它的5′末端也带有一个T7RNA酶启动子序列。
3.聚合酶链反应(PCR)：用苯酚抽提法提取DNA。反应体系50 μl，模板基因组DNA 1 μg。共30个循环。
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4.体外转录：PCR阳性产物经蛋白酶K消化，苯酚抽提，无水乙醇沉淀后重溶于等体积(TE)中备用。取每个反应体系的PCR产物6 μl进行体外转录。转录反应体系50 μl，为防止转录本被RNA酶降解，反应体系中加入RNA酶抑制剂。转录后，模板DNA用无RNA酶的DNA酶I消化。
5.RNA转录本分子杂交和RNA酶消化：探针RNA与待测RNA在40 μl体系中以1∶1的比例杂交。杂交完成后，为消化不配对核苷酸，于反应体系中加入RNA酶A进行消化。
6.电泳和硝酸银染色：经消化后的杂交产物用含7.6 mol/L尿素的6%聚丙稀酰胺变性胶(PAG)中电泳。电泳后凝胶用银染法检测结果，具体步骤：(1)双蒸水漂洗；(2)乙酸固定；(3)AgNO3染色；(4)0.25 MNa2CO3中显色。
结果：1.特异性和敏感性检测：用等浓度的正常骨髓细胞DNA对Sup B7细胞系DNA进行对数稀释，直至10-6。以每份稀释样本1 μg DNA用引物VrT7和JrI7进行PCR扩增，而后转录成待测RNA，用相同方法扩增和转录了本研究中1例患儿和1例正常人的DNA样本，制备成待测RNA。取未经稀释的Sup B7细胞系DNA，用引物Vr 1，3和JrT7扩增，并转录成探针RNA。从探针RNA中分别取20 μl与上述9个待测RNA样本以等体积杂交，RNA酶消化，PAG电泳和硝酸银染色。其结果为：探针与正常人和1例白血病患者的交叉杂交产物均未见到完整的被保护片段。而探针与对数稀释的7个样本的杂交产物，除10-6外，均可见到完整的被保护片段，而且其染色强度随着对数稀释度的增加而减弱。其检测结果说明本方法特异性强，敏感度可达到10-5水平。
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2.MRD的追踪检测：对20例急淋患者的检测发现，15例可见到预计大小的被保护片段，故本组资料TCRγ单克隆重排基因的发生率为75%，检测诱导缓解治疗后0.5～2个月的标本共13份，全部阳性；3～4个月标本10份，7份阳性；5个月以上标本6份，1份阳性。
讨论：目前认为急淋白血病是一组异质性疾病，缺乏肿瘤特异性的基因标志。但由于其同时又具有单克隆特性，因此现在多采用免疫球蛋白重链基因(IgH)和TCR基因重排作为克隆标志来检测MRD。由于IgH基因重排在病程中约有50%发生克隆演变，而TCR较稳定，改变较少见，且通常只涉及两个等位基因之一[1，2]，因此，选用TCR基因重排作为分子标志是较合适的。当然，为防止克隆演变所造成的假阴性结果，若能同时选用两种基因标志(IgH，TCRγ)进行检测是最理想的。
目前用于MRD的检测方法，PCR是最为敏感的，其灵敏度可达10-5水平。但国外资料中用PCR检测时通常的方法是：用诊断时的肿瘤标本作PCR，将其产物直接作序列分析，根据序列分析的结果，构建一对与之相配对的特异性引物和探针，用构建的特异性引物对缓解期标本进行PCR扩增，再用合成的特异性探针与缓解期PCR产物杂交，分析结果[3]。这个方法的不足之处在于：一旦测序过程中或者在寡核苷酸片段合成中出现错误，就不可避免地出现假阴性结果。同时测序和DNA合成所需试剂和仪器都是昂贵的，也耗费时间[4]。
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而本实验方法，由于在分别用于扩增急性期和缓解期标本的两对引物的相对位置上带有T7RNA聚合酶启动子序列，故用带有该序列的两条DNA产物进行体外转录时就将产生完全互补的两条RNA单链，一条为探针RNA，另一条为待测RNA。根据精确配对的RNA双链能抵抗RNA酶消化的原理，从杂交体的RNA酶消化结果中，就可确定是否有肿瘤细胞的存在，从而保证了本实验方法的特异性，交叉实验的阴性结果证明了这一点。同时，实验方法也较简便、经济。
MRD检测方法运用中，放射性污染一直是影响临床推广的主要原因之一。本方法中采用的硝酸银染色技术，价格便宜，操作简便。对数稀释试验证明，其灵敏度可以达到本实验理论上最高值(10-5)，因此，完全可代替同位素，使MRD检测更利于临床推广。
本课题由国家自然科学基金资助(基金编号：39470786)
参考文献
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1 Jacques J M, Van Dongen, Timo M, et al. Adriaansen, detection of minimal residual disease in acute leukemia by immunological marker analysis and polymerase chain reaction. Leukemia, 1992: 6 (Suppl 1), 47-59.
2 Beishuizen A, Hahlen K, Van Wering E R. Detection of minimal residual disease in childhood leukemia with the polymerase chain reaction. N Engl J Med, 1991, 324:772-773.
3 Hendrik Veelken, Benjamin Tycko, Jeffrey Sklar. Sensitive detection of clonal antigen receptor gene rearrangement for the diagnosis and monitoring of lymphoid neoplasms by a polymerase chain reaction-mediated ribonuclease protection assay. Blood, 1991, 78:1318-1326.
4 Lefranc MP, Forster A, Bear R, et al. Diversity and rearrangement of human T cell rearranging γ gene: nine germ-line variable genes belonging to the subgroup. Cell, 1986, 45:237-286.
(收稿：1997-12-17 修回：1998-06-18), 百拇医药