一氧化氮合酶基因治疗低氧性肺动脉高压的探索
作者：贾建锋 杜军保
单位：100034 北京医科大学第一医院儿科
关键词：
中华儿科杂志990131 内源性一氧化氮合成减少是低氧性肺动脉高压发病的重要因素。随着基因工程及一氧化氮体系分子生物学研究的进展，目前应用一氧化氮合酶基因治疗低氧性肺动脉高压的基础研究已取得初步进展。
(一)内源性一氧化氮与一氧化氮合酶：一氧化氮(nitric oxide，NO)的结构简单，呈脂溶性，半衰期仅数秒，在体内广泛分布。内源性NO是在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的作用下，以还原型辅酶Ⅱ为辅助因子，L-精氨酸与分子氧反应，脱去L-瓜氨酸而生成的[1]。NOS是内源性NO生成的限速酶，NOS活性的变化以及影响NOS基因转录、翻译的因素，都可以影响NO的形成。NOS分为结构型和诱生型两种亚型[2]。
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1.结构型一氧化氮合酶(constitutive endothelial NOS, ceNOS)：血管内皮细胞有ceNos表达，其氮末端与内皮细胞胞膜结合，有利于血管内皮细胞生成的NO扩散到临近的平滑肌细胞及血小板内，产生相应的生物学效应。ceNOS的活性对钙离子及钙调蛋白具有依赖性。编码ceNOS的基因位于第7号染色体，包含26个外显子，21 kb大小。在ceNOS基因的启动子区域附近，没有可识别RNA聚合酶、调节基因表达的“-TATA-”碱基框盒结构，却与看家蛋白基因类似，有富含“-GC-”碱基的结构序列以及可与“-GATA-”碱基结合蛋白结合的“-GATA-”碱基序列，并且存在调节蛋白的结合位点和对低氧及剪切应力等物理刺激产生应答的位点[2，3]。目前已经成功克隆了ceNOS cDNA，为应用NOS基因治疗某些疾病提供了前提条件[4]。
2.诱生型一氧化氮合酶(inducible NOS，iNOS)：生理条件下无iNOS表达，但在暴露于细菌、病毒和细胞因子等刺激因素时，包括血管内皮细胞和血管平滑肌细胞在内，大多数细胞都可产生iNOS。其活性对钙离子及钙调蛋白无依赖性，一经产生即表现出高度活性，产生大量NO，引起血管平滑肌的过度舒张、血管通透性增高、血压下降。编码iNOS的基因位于第17号染色体，包含26个外显子。在调节iNOS基因表达的区域，有可与肿瘤坏死因子等结合的位点，参与调节iNOS基因的表达，对iNOS合成的调节可发生基因转录水平[2，3]。
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(二)一氧化氮体系与低氧性肺动脉高压：1.一氧化氮对肺循环的调节作用：肺血管内皮细胞通过释放血管活性物质，调节肺血管张力，维持肺血管正常结构和肺循环的低阻力状态，NO即是其中之一[5]。内源性NO可直接扩散到临近组织细胞产生相应的生物学效应：(1)抑制钙离子内流和细胞内储存钙的释放，细胞内游离钙浓度降低，肌球蛋白轻链去磷酸化，肺血管平滑肌细胞舒张，循环阻力下降[6]。(2) 抑制内皮素等内皮衍化收缩因子和内皮生长因子的生成，可间接引起舒血管效应并维持肺血管的正常结构。(3)抑制血小板的凝集、附壁和粘着反应，减少血小板衍化生长因子对肺血管结构重建的影响[7，8]。
2.低氧性肺动脉高压时一氧化氮合酶的改变：慢性低氧性肺动脉高压大鼠及慢性低氧性肺动脉高压患者，肺动脉内皮细胞NOS mRNA及NOS含量降低，表明低氧可抑制NOS基因转录及翻译过程或降低NOS mRNA的稳定性，影响NOS的产生，使NO的合成减少[9，10，11]。低氧性肺动脉高压肺血管重建的病理改变程度，与NO体系受到抑制的程度呈正相关[12]。
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3.一氧化氮吸入在低氧性肺动脉高压治疗中的应用及其局限性：持续吸入低浓度[(10～80)×10-6]的NO，可选择性降低低氧性肺动脉高压患者的肺循环阻力，阻止低氧性肺血管重建的进一步恶化，但不能使慢性低氧性肺动脉高压患者已发生不可逆病理改变的肺血管结构得到改善[5，13]。NO进入血循环后迅速失活，疗效短暂，若要维持低氧性肺动脉高压患者肺循环的低阻力状态需要持续的NO吸入，并有可能产生高铁血红蛋白血症等毒副作用，为防止NO吸入过程中的氧化降解尚需特殊设备，限制了其推广应用[14]。然而基因工程研究的进展为NO体系在低氧性肺动脉高压治疗中的应用提供了新的途径。
(三)一氧化氮合酶基因治疗低氧性肺动脉高压研究的实践：肺内导入抑制肺血管重建和扩血管作用物质的基因，是低氧性肺动脉高压基因治疗的策略之一[15]。将目的基因有效地导入体内靶细胞是基因治疗的关键技术，包括制备目的基因与载体的复合体以及将此复合体送达目的组织细胞两个方面。可选用的载体有病毒和非病毒两类。重组DNA病毒和重组RNA病毒载体，虽缺乏组织特异性和靶向性，但转染效率较高，常用者有逆转录病毒、腺病毒和辅助腺病毒等[16]。逆转录病毒只能转染处于分裂期的细胞，非病毒类载体介导的基因转移的成功率相对较低，而腺病毒载体可以转染处于不同细胞周期的细胞优于其它载体[3，15]。
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肺脏基因转移有肺动脉基因定位转移和经呼吸道基因转移两条途径：(1) 肺动脉基因定位转移是在血管成型术和药物定位传送基础上发展起来的。采用动脉插管、各种球囊和血管支架等，将目的基因与载体的复合体选择性地转移至拟治疗部位。在载体复合物与病灶部位血管细胞紧密接触及压力作用下完成基因的转移过程，需要应用对血管内皮细胞具有高度粘着力的载体[3，16]。Von Der Lveyen等[17]用仙台病毒与牛ceNOS基因质粒，在球囊扩张损害的颈动脉进行基因转移，成功的抑制了基因转移部位血管内膜的增生，证明了NOS基因转移并用于治疗目的可行性。然而低氧性肺动脉高压患者的肺血管病变的范围广泛而且治疗时需阻断血流，不适于低氧性肺动脉高压的基因治疗。(2)肺动脉与气管、支气管相伴行，经呼吸道基因转移导入基因的范围可以达到细支气管水平。导入的NOS基因经转录、翻译生成NOS，使NO的合成增加，能持续供给肺动脉局部组织细胞NO，抑制低氧性肺血管收缩和低氧性肺血管重建，对低氧性肺动肺高压起到一定的治疗作用[18，19]。
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Setoguchi等[3]将ceNOS cDNA质粒导入体外培养的人肺动脉内皮细胞和肺动脉平滑肌细胞，发现细胞培养液中的NO代谢产物显著增高。免疫组化研究证明了导入ceNOS基因的阳性表达。Janssens等[19]用ceNOS cDNA重组腺病毒(AdCMVceNOS)转染体外培养的大鼠胎肺纤维母细胞，24小时后即可检测到ceNOS的产生，ceNOS阳性细胞在基因转移3天后达到最高。NOS选择性抑制剂—L-精氨酸甲酯可显著抑制其NOS样活性，而对照组细胞则没有NOS产生，证明应用AdCMVceNOS可将ceNOS基因导入体外培养的细胞，并获得阳性表达，产生具有生理活性的ceNOS。
Setoguchi等[3]用免疫组化方法发现，经呼吸道ceNOS cDNA质粒导入后，部分呼吸道上皮细胞ceNOS基因阳性表达增加，ceNOS生成增多，参与NO的合成，但未能达到能产生生理效应的水平。同时向肺动脉进行的直接基因转移，由于血流影响不能达到基因治疗的预期效果。Janssens等[19]用Ad CMV ceNOS雾化吸入到大鼠肺脏，随后用ceNOS单克隆抗体对肺组织进行免疫组化染色，发现实验组大鼠的气管、支气管上皮细胞、肺泡囊内皮细胞，肺中小血管的结缔组织细胞，内皮细胞均有大量的ceNOS产生。在基因转移后5天时阳性率最高，12天时仍可见有ceNOS基因的阳性表达。而对照组大鼠肺组织ceNOS的含量很低，AdCMV ceNOS雾化吸入后的大鼠肺蛋白粗提物转化L-精氨酸生成的NO的活性显著增高，并且可以被NOS选择性抑制剂L-精氨酸甲酯所抑制，证明存在NOS特异的酶促反应。ceNOS基因的导入使肺脏NO的生成明显增多，可以抑制急性低氧时肺动脉压力及肺血管阻力的增高。同时，iNOS单克隆抗体免疫组化的研究证明，AdCMV ceNOS雾化吸入不影响大鼠肺iNOS的产生，不影响生长发育，也不产生肺部感染症状。
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腺病毒载体介导的基因转移效率是重组质粒的102～104倍，Setoguchi等[3，19]所用的ceNOS cDNA质粒及AdCMV ceNOS中含有巨细胞病毒基因片段，具有调节导入ceNOS基因表达的作用，可以使ceNOS的生成增加，产生大量的NO，可能导致潜在的毒性反应，应设法避免。
(四)问题与前景：目前用于基因治疗的病毒类载体，由于缺乏组织特异性和靶向性，所以难以对组织器官进行理想的定位治疗，有待于研究出具有组织特异性的载体。ceNOS基因导入肺脏后，如何有效调节导入基因的表达，以充分发挥其治疗作用而不产生毒性也有待于研究，并应设法增长导入基因的有效作用时间。肺脏ceNOS基因转移对慢性低氧性肺动脉高压、新生儿持续性肺动脉高压以及先天性心脏病合并肺动脉高压患者手术治疗前后具有潜在的治疗价值。
参考文献
[1] Kiechle FL, Malinski T. Nitric oxide. Biochemistry, pathophysiology and detection. Am J Clin Pathol, 1993, 100: 567-575.
, 百拇医药
[2] Nathan C, Xie QW. Regulation of biosynthesis of nitric oxide. J Biol Chem, 1994, 269:13725-13728.
[3] Setoguchi Y, Tamaki Y, Oki M, et al. Transfer of endothelial nitric oxide synthase gene in the purpose of gene therapy. Nippon Rinsho, 1996, 54:369-376.
[4] Janssens SP, Shimouchi A, Quertermous T, et al. Cloning and expression of a cDNA encoding human endothelium-derived relaxing factor/nitric oxide systhase. J Biol Chem, 1992, 267:14519-14522.
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[5] 杜军保，李树政.小儿肺动脉高压的研究进展.中华儿科杂志，1996，34：203-205.
[6] Umans JG, Levi R. Nitric oxide in the regulation of blood flow and arterial pressure. Annu Rev Physiol, 1995, 57:771-790.
[7] Voelkel NF, Tuder RM. Cellular and molecular mechanisms in the pathogenesis of severe pulmonary hypertension. Eur Respir J, 1995, 8:2129-2138.
[8] Kurembanas S, McQuinllan LP, Leung GK, et al. Nitric oxide regulates the expression of vascular constrictors and growth factors by vascular endothelium under both normoxia and hypoxia. J Clin Invest, 1993, 92: 99-104.
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[9] 杜军保，赵斌，黎文.一氧化氮合酶mRNA在低氧性肺动脉高压大鼠肺动脉的表达和分布.中华儿科杂志，1998, 36:19-21.
[10] 杜军保，李万镇，赵斌.低氧对大鼠不同阶段肺动脉一氧化氮合酶mRNA表达的影响.中华医学杂志，1998，78:420-422.
[11] Giaid A, Saleh D. Reduced expression of endothelial nitric oxide synthase in the lung of patients with pulmonary hypertension. N Engl J Med, 1995, 333:214-221.
[12] McQuillan LP, Leung GK, Marsden PA, et al. Hypoxia inhibits expression of eNOS via transcriptional and posttranscriptional mechanisms. Am J Physiol, 1994, 267: H1921-H1927.
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[13] Kouyoumdjian C, Adont S, Levame M, et al. Continuous inhalation of nitric oxide protects against development of pulmonary hypertension in chronically hypoxic rats. J Clin Invest. 1994, 94: 578-584.
[14] Barbera JA, Roger N, Roca J, et al . Worsening of pulmonary gas exchange with nitric oxide inhalation in chronic obstructive pulmonary disease. Lancet, 1996, 347: 436-440.
[15] 闫波，刘德培.病毒性载体介导的基因转移研究进展.国外医学分子生物学分册, 1996，18：126-129.
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[16] 钱虎生，张柏根，陈诗书.再狭窄基因治疗最新进展.国外医学分子生物学分册，1997，19：38-41.
[17] Von Der Leyen HE, Gibbons GH, Morishita R, et al. Gene therapy inhibiting neointimal vascular lesion: in vivo transfer of endothelial cell nitric oxide synthase gene. Proc Natl Acad Sci, 1995, 92:1137-1141.
[18] Mastrangeli A, Danel C, Rosenfeld M, et al. Diversity of airway epithelial cell targets for in vivo recombinant adenovirus-mediated gene transfer. J Clin Invest, 1993, 91:225-234.
[19] Janssens SP, Bloch KD, Nong Z, et al. Adenoviral-mediated transfer of the human endothelial nitric oxide synthase gene reduces acute hypoxic pulmonary Vasoconstriction in rats. J Clin Invest, 1996, 98:317-324.
(收稿：1998-01-15 修回：1998-07-06), 百拇医药
单位：100034 北京医科大学第一医院儿科
关键词：
中华儿科杂志990131 内源性一氧化氮合成减少是低氧性肺动脉高压发病的重要因素。随着基因工程及一氧化氮体系分子生物学研究的进展，目前应用一氧化氮合酶基因治疗低氧性肺动脉高压的基础研究已取得初步进展。
(一)内源性一氧化氮与一氧化氮合酶：一氧化氮(nitric oxide，NO)的结构简单，呈脂溶性，半衰期仅数秒，在体内广泛分布。内源性NO是在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的作用下，以还原型辅酶Ⅱ为辅助因子，L-精氨酸与分子氧反应，脱去L-瓜氨酸而生成的[1]。NOS是内源性NO生成的限速酶，NOS活性的变化以及影响NOS基因转录、翻译的因素，都可以影响NO的形成。NOS分为结构型和诱生型两种亚型[2]。
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1.结构型一氧化氮合酶(constitutive endothelial NOS, ceNOS)：血管内皮细胞有ceNos表达，其氮末端与内皮细胞胞膜结合，有利于血管内皮细胞生成的NO扩散到临近的平滑肌细胞及血小板内，产生相应的生物学效应。ceNOS的活性对钙离子及钙调蛋白具有依赖性。编码ceNOS的基因位于第7号染色体，包含26个外显子，21 kb大小。在ceNOS基因的启动子区域附近，没有可识别RNA聚合酶、调节基因表达的“-TATA-”碱基框盒结构，却与看家蛋白基因类似，有富含“-GC-”碱基的结构序列以及可与“-GATA-”碱基结合蛋白结合的“-GATA-”碱基序列，并且存在调节蛋白的结合位点和对低氧及剪切应力等物理刺激产生应答的位点[2，3]。目前已经成功克隆了ceNOS cDNA，为应用NOS基因治疗某些疾病提供了前提条件[4]。
2.诱生型一氧化氮合酶(inducible NOS，iNOS)：生理条件下无iNOS表达，但在暴露于细菌、病毒和细胞因子等刺激因素时，包括血管内皮细胞和血管平滑肌细胞在内，大多数细胞都可产生iNOS。其活性对钙离子及钙调蛋白无依赖性，一经产生即表现出高度活性，产生大量NO，引起血管平滑肌的过度舒张、血管通透性增高、血压下降。编码iNOS的基因位于第17号染色体，包含26个外显子。在调节iNOS基因表达的区域，有可与肿瘤坏死因子等结合的位点，参与调节iNOS基因的表达，对iNOS合成的调节可发生基因转录水平[2，3]。
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(二)一氧化氮体系与低氧性肺动脉高压：1.一氧化氮对肺循环的调节作用：肺血管内皮细胞通过释放血管活性物质，调节肺血管张力，维持肺血管正常结构和肺循环的低阻力状态，NO即是其中之一[5]。内源性NO可直接扩散到临近组织细胞产生相应的生物学效应：(1)抑制钙离子内流和细胞内储存钙的释放，细胞内游离钙浓度降低，肌球蛋白轻链去磷酸化，肺血管平滑肌细胞舒张，循环阻力下降[6]。(2) 抑制内皮素等内皮衍化收缩因子和内皮生长因子的生成，可间接引起舒血管效应并维持肺血管的正常结构。(3)抑制血小板的凝集、附壁和粘着反应，减少血小板衍化生长因子对肺血管结构重建的影响[7，8]。
2.低氧性肺动脉高压时一氧化氮合酶的改变：慢性低氧性肺动脉高压大鼠及慢性低氧性肺动脉高压患者，肺动脉内皮细胞NOS mRNA及NOS含量降低，表明低氧可抑制NOS基因转录及翻译过程或降低NOS mRNA的稳定性，影响NOS的产生，使NO的合成减少[9，10，11]。低氧性肺动脉高压肺血管重建的病理改变程度，与NO体系受到抑制的程度呈正相关[12]。
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3.一氧化氮吸入在低氧性肺动脉高压治疗中的应用及其局限性：持续吸入低浓度[(10～80)×10-6]的NO，可选择性降低低氧性肺动脉高压患者的肺循环阻力，阻止低氧性肺血管重建的进一步恶化，但不能使慢性低氧性肺动脉高压患者已发生不可逆病理改变的肺血管结构得到改善[5，13]。NO进入血循环后迅速失活，疗效短暂，若要维持低氧性肺动脉高压患者肺循环的低阻力状态需要持续的NO吸入，并有可能产生高铁血红蛋白血症等毒副作用，为防止NO吸入过程中的氧化降解尚需特殊设备，限制了其推广应用[14]。然而基因工程研究的进展为NO体系在低氧性肺动脉高压治疗中的应用提供了新的途径。
(三)一氧化氮合酶基因治疗低氧性肺动脉高压研究的实践：肺内导入抑制肺血管重建和扩血管作用物质的基因，是低氧性肺动脉高压基因治疗的策略之一[15]。将目的基因有效地导入体内靶细胞是基因治疗的关键技术，包括制备目的基因与载体的复合体以及将此复合体送达目的组织细胞两个方面。可选用的载体有病毒和非病毒两类。重组DNA病毒和重组RNA病毒载体，虽缺乏组织特异性和靶向性，但转染效率较高，常用者有逆转录病毒、腺病毒和辅助腺病毒等[16]。逆转录病毒只能转染处于分裂期的细胞，非病毒类载体介导的基因转移的成功率相对较低，而腺病毒载体可以转染处于不同细胞周期的细胞优于其它载体[3，15]。
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肺脏基因转移有肺动脉基因定位转移和经呼吸道基因转移两条途径：(1) 肺动脉基因定位转移是在血管成型术和药物定位传送基础上发展起来的。采用动脉插管、各种球囊和血管支架等，将目的基因与载体的复合体选择性地转移至拟治疗部位。在载体复合物与病灶部位血管细胞紧密接触及压力作用下完成基因的转移过程，需要应用对血管内皮细胞具有高度粘着力的载体[3，16]。Von Der Lveyen等[17]用仙台病毒与牛ceNOS基因质粒，在球囊扩张损害的颈动脉进行基因转移，成功的抑制了基因转移部位血管内膜的增生，证明了NOS基因转移并用于治疗目的可行性。然而低氧性肺动脉高压患者的肺血管病变的范围广泛而且治疗时需阻断血流，不适于低氧性肺动脉高压的基因治疗。(2)肺动脉与气管、支气管相伴行，经呼吸道基因转移导入基因的范围可以达到细支气管水平。导入的NOS基因经转录、翻译生成NOS，使NO的合成增加，能持续供给肺动脉局部组织细胞NO，抑制低氧性肺血管收缩和低氧性肺血管重建，对低氧性肺动肺高压起到一定的治疗作用[18，19]。
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Setoguchi等[3]将ceNOS cDNA质粒导入体外培养的人肺动脉内皮细胞和肺动脉平滑肌细胞，发现细胞培养液中的NO代谢产物显著增高。免疫组化研究证明了导入ceNOS基因的阳性表达。Janssens等[19]用ceNOS cDNA重组腺病毒(AdCMVceNOS)转染体外培养的大鼠胎肺纤维母细胞，24小时后即可检测到ceNOS的产生，ceNOS阳性细胞在基因转移3天后达到最高。NOS选择性抑制剂—L-精氨酸甲酯可显著抑制其NOS样活性，而对照组细胞则没有NOS产生，证明应用AdCMVceNOS可将ceNOS基因导入体外培养的细胞，并获得阳性表达，产生具有生理活性的ceNOS。
Setoguchi等[3]用免疫组化方法发现，经呼吸道ceNOS cDNA质粒导入后，部分呼吸道上皮细胞ceNOS基因阳性表达增加，ceNOS生成增多，参与NO的合成，但未能达到能产生生理效应的水平。同时向肺动脉进行的直接基因转移，由于血流影响不能达到基因治疗的预期效果。Janssens等[19]用Ad CMV ceNOS雾化吸入到大鼠肺脏，随后用ceNOS单克隆抗体对肺组织进行免疫组化染色，发现实验组大鼠的气管、支气管上皮细胞、肺泡囊内皮细胞，肺中小血管的结缔组织细胞，内皮细胞均有大量的ceNOS产生。在基因转移后5天时阳性率最高，12天时仍可见有ceNOS基因的阳性表达。而对照组大鼠肺组织ceNOS的含量很低，AdCMV ceNOS雾化吸入后的大鼠肺蛋白粗提物转化L-精氨酸生成的NO的活性显著增高，并且可以被NOS选择性抑制剂L-精氨酸甲酯所抑制，证明存在NOS特异的酶促反应。ceNOS基因的导入使肺脏NO的生成明显增多，可以抑制急性低氧时肺动脉压力及肺血管阻力的增高。同时，iNOS单克隆抗体免疫组化的研究证明，AdCMV ceNOS雾化吸入不影响大鼠肺iNOS的产生，不影响生长发育，也不产生肺部感染症状。
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腺病毒载体介导的基因转移效率是重组质粒的102～104倍，Setoguchi等[3，19]所用的ceNOS cDNA质粒及AdCMV ceNOS中含有巨细胞病毒基因片段，具有调节导入ceNOS基因表达的作用，可以使ceNOS的生成增加，产生大量的NO，可能导致潜在的毒性反应，应设法避免。
(四)问题与前景：目前用于基因治疗的病毒类载体，由于缺乏组织特异性和靶向性，所以难以对组织器官进行理想的定位治疗，有待于研究出具有组织特异性的载体。ceNOS基因导入肺脏后，如何有效调节导入基因的表达，以充分发挥其治疗作用而不产生毒性也有待于研究，并应设法增长导入基因的有效作用时间。肺脏ceNOS基因转移对慢性低氧性肺动脉高压、新生儿持续性肺动脉高压以及先天性心脏病合并肺动脉高压患者手术治疗前后具有潜在的治疗价值。
参考文献
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[4] Janssens SP, Shimouchi A, Quertermous T, et al. Cloning and expression of a cDNA encoding human endothelium-derived relaxing factor/nitric oxide systhase. J Biol Chem, 1992, 267:14519-14522.
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[8] Kurembanas S, McQuinllan LP, Leung GK, et al. Nitric oxide regulates the expression of vascular constrictors and growth factors by vascular endothelium under both normoxia and hypoxia. J Clin Invest, 1993, 92: 99-104.
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[10] 杜军保，李万镇，赵斌.低氧对大鼠不同阶段肺动脉一氧化氮合酶mRNA表达的影响.中华医学杂志，1998，78:420-422.
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(收稿：1998-01-15 修回：1998-07-06), 百拇医药