特发性血小板减少性紫癜与人细小病毒B19感染的关系
作者：张笑飞 许东亮 张国成 钱新宏 王瑞华
单位：710032 西安，第四军医大学西京医院儿科
关键词：细小病毒B19；人；聚合酶链反应；紫癜；血小板减少性；特发性
中华儿科杂志990105 【摘要】 目的 研究人细小病毒B19(HPV B19)感染与特发性血小板减少性紫癜(ITP)的关系。方法 应用巢式聚合酶链反应技术检测84例ITP患儿存档骨髓涂片标本中HPV B19-DNA，并以24例巨幼细胞性贫血(MA)患儿为对照。结果 84例ITP骨髓中HPV B19-DNA阳性36例，阳性率为43%,24例MA患儿骨髓中HPV B19-DNA阳性3例，阳性率为12%，(χ2=6.199,P<0.05)，ITP组中首发和复发，治疗前与治疗后以及不同性别患儿骨髓中HPV B19-DNA检出率均无明显差异，急性型与慢性型ITP患儿骨髓中HPV B19-DNA检出率之间有差异。结论 临床上较大部分ITP患儿的发病可能与HPV B19感染有关；急性型HPV B19-DNA检出率高。
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Relationship between human parovirous B19 infection and idiopathic thrombocytopenic purpura ZHANG Xiaofei, XU Dongliang, ZHANG Guocheng, et al. Department of Pediatrics, Xijing Hospital,the Fourth Military Medical University，Xian 710032
【Abstract】 Objective To study the relationship between human parovirus B19(HPV B19) infection and idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP). Methods Nested polymerase chain reaction was used to detect HPV B19-DNA on stock bone marrow smears from 84 children with ITP. Twenty-four cases of macrocytic anemia (MA) were chosen as controls. Results Thirty-six of 84 cases of ITP and 3 of 24 cases of MA were positive for HPV B19-DNA, with a positive rates of 43% and 12%, respectively (χ2=6.199, P<0.05). There were no differences in the HPV B19-DNA detective rates concerned with the onset and recurrence of ITP, treatment, and genders. However, there was a significant difference in detective rates between different stages of ITP (acute stage vs. chronic stage). Conclusion Most attacks of ITP might be correlated with HPV B19 infection. The higher detective rates of HPV B19 were found in the younger patients with ITP and in acute stage of ITP. However, the HPV B19-DNA detective rate was not correlated with the genders, treatement, as well as the onset and recurrence of ITP.
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【Key words】 Parvovirus B19, human Polymerase chain reaction Purpura，thrombocytopenic，idiopathic
特发性血小板减小性紫癜(ITP)是儿科常见的出血性疾病，其病因目前尚未完全明了。已知与ITP病因相关的病毒有十余种，其中以人细小病毒B19(HPV B19)尤为重要[1]，HPV B19可能是导致该病的主要病原之一。为探讨此病毒感染与小儿ITP之间的关系，我们用巢式聚合酶链反应(巢式PCR)方法对84 例ITP患儿经瑞氏染色存档的骨髓涂片标本进行了HPV B19-DNA的检测。
对象和方法
一、对象
ITP组：系1983年4月～1995年5月于我科住院的84例ITP患儿，其中男47例，女37例，男∶女为1.27∶1；年龄6个月～12岁。初发71例，复发13例，按照国内有关会议制定的标准确诊[2]。
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对照组：为同期巨幼红细胞性贫血(MA)患儿24例，男15例，女9例，男∶女为1.7:1；年龄1岁～10岁。
二、试剂
HPV B19巢式PCR特异性内外引物及阳性对照模板由沙特皇家医院研究中心提供。引物序列为：外引物 P1：5′-CTTTAGGTATAGCCAACTGG-3′, P2：5′-ACACTGAGTTTACTAAGTGGC-3′； 内引物P3：5′-CAAAAGCATGTGGAGTGAGG-3′, P4：5′-CCTTAT- AATGGTGCTCTGGG-3′。其扩增片段长度分别为1 112 bp(2 905～4 016)和104 bp(3 187～3 290)。Taq酶、10×PCR Buffer、4×dNTPs及Marker 均购自华美生物工程公司。
三、DNA提取
将两组经瑞氏染色室温存档的骨髓涂片标本用高压灭菌新手术刀片分别刮取2.0 cm×1.0 cm的骨髓细胞涂膜，置于Eppendorf管中，加入50 μl含有蛋白酶K裂解液，混匀后于65℃孵育1小时后，95℃水浴10分钟灭活蛋白酶K，然后离心15分钟(15 000r/min)，取上清液作PCR模板。
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四、巢式PCR扩增HPV B19-DNA
方法同文献[3]。第1对引物扩增过程主要为：50 μl反应体系中包括双蒸水32.5 μl，10×Buffer 5 μl，dNTP 4 μl，Taq酶1.5 μl，外引物P1、P2(300 mg/L)，模板5 μl(阳性对照1 μl，阴性对照以双蒸水作模板)。PCR循环条件为：93℃1分钟、55℃1分30秒、72℃1分钟，35个循环后72℃充分延伸10分钟 。第2对引物扩增：取第1次扩增产物2 μl为模板，以内引物P3、P4代替外引物，反应体系及条件同第一次扩增。
五、结果判定
取第2次扩增产物5 μl在2%琼脂糖凝胶中电泳，EB染色，紫外线灯下观察结果，于104 bp处出现特异性荧光区带判为HPV B19-DNA阳性。同批用猫细小病毒(CPV)、腺病毒3型(Adv3)、呼吸道合胞病毒(RSV)、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒(HSV)及风疹病毒(RV)提取的核酸，行巢式PCR检测，作为阴性对照。
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结果
一、巢式PCR特异性
将CPV、Adv3、RSV、CMV、HSV、RV核酸和HPV B19-DNA同批作巢式PCR扩增，只有HPV B19-DNA在104 bp处出现特异的阳性电泳带。
二、ITP组和对照组检测结果
巢式PCR检测84例ITP和24例MA患儿骨髓标本中的HPV B19-DNA，结果，ITP 84例中36例阳性，阳性率43%；对照组24例中3例阳性，阳性率12%。ITP组HPV B19-DNA阳性率高于对照组，差异有显著意义(χ2=6.199, P<0.05)。
三、ITP组不同性别HPV B19-DNA的检测结果
男性47例中阳性22例，阳性率47%；女性37例中阳性14例，阳性率38%。不同性别之间HPV B19-DNA的检出率差异无显著意义(χ2=0.363, P>0.05)。
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四、ITP组初发与复发HPV B19-DNA检测结果
初发71例患儿中阳性31例，阳性率44%；复发13例中阳性5例，阳性率38%。两组之间HPV B19-DNA检出率差异无显著意义(χ2=0.002, P>0.05)。
五、ITP组治疗前后HPV B19-DNA检测结果
治疗前61例患儿中阳性25例，阳性率41%；治疗后23例患儿中阳性11例，阳性率48%。治疗前后HPV B19-DNA的检出率差异无显著意义(χ2=0.101，P>0.05)。
六、ITP组不同类型HPV B19-DNA的检测结果
急性型49例患儿中阳性29例，阳性率59%；慢性型35例患儿中阳性7例，阳性率20%。急性型HPV B19-DNA的检测率高于慢性型。(χ2=11.256, P<0.05)。
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七、ITP组不同年龄HPV B19-DNA的检测结果
≤3岁19例(均为急性型)，其中阳性14例，阳性率74%；>3岁(65例)ITP患儿急性型30例，其中阳性22例(急性型15例)，阳性率34%。3岁以下患儿HPV B19-DNA的检测率高于3岁以上患儿(χ2=7.971,P<0.001)。
八、ITP组和对照组小于3岁HPV B19-DNA检测的结果
ITP组≤3岁19例中阳性14例，阳性率74%,对照组≤3岁11例中均为阴性，经Fisher′s确切概率检验，P值为0.00009，两者间差异有非常显著意义。
讨论
病毒感染被认为是导致ITP的主要原因[1]，有资料表明，约80%的ITP患儿在发病前3 周有上呼吸道病毒感染史[4]。但究竟ITP与何种病毒有较为密切的关系尚不能确定。有学者认为与EB 病毒、CMV及HPV B19等10余种DNA和(或)RNA病毒有关[5]。随着对HPV B19的深入研究，有关HPV B19感染与ITP并存的平行关系已有报道。1994年Murray等[6]对HPV B19与ITP相关性作了最新的前瞻性研究：35例以往健康的ITP患儿，其中17例(49%)外周血和骨髓中HPV B19-DNA阳性。6例(17%)HPV B19 IgM阳性，8例(23%)HPV B19 IgG阳性。而14例健康对照者中外周血HPV B19-DNA和IgM均无阳性者。此结果提示HPV B19可能与ITP密切相关。迄今为止国内未见有关应用巢式PCR技术检测ITP患儿存档骨髓涂片中HPV B19-DNA的报道。我们用巢式PCR 方法检测了84例ITP患儿存档骨髓涂片标本中HPV B19-DNA，阳性率为43%，明显高于对照组，提示国内有相当一部分ITP患儿发病可能与HPV B19感染有关。在本研究中，HPV B19感染与ITP患儿的首次发病和复发并无关系，与治疗前和治疗后(泼尼松、氨肽素、长春新碱)以及性别亦无关系。但急性型ITP中HPV B19-DNA的检出率高于慢性型，故认为急性型ITP的发生与HPV B19感染的关系可能更为密切，≤3岁的ITP患儿HPV B19-DNA的检出率高于3岁以上ITP患儿，且≤3岁的ITP患儿HPV B19-DNA的检出率明显高于≤3岁的MA对照组，这可能是婴幼儿发生急性ITP机会较多的原因。从而符合急性型多系病毒感染所致的观点。因本研究受标本限制，故未能作HPV B19特异性IgM检测。HPV B19感染引起ITP机制尚不清楚，需深入研究。
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参考文献
[1] 钱新宏，张笑飞，陈星琪.特发性血小板减少性紫癜病因学的研究进展.国外医学儿科学分册，1998，25：193-195.
[2] 杨士元，整理.特发性血小板减少性紫癜诊疗常规(草案).中华儿科杂志，1987，25 :104-105.
[3] Musiani M, Azzi A, Zerbini M, et al. Nested polymerase chain reaction assay for the detection of B19 parovirus DNA in human immunodeficiency virus patients. J Med Virol, 1993，40:157-160.
[4] 吴瑞萍，胡亚美，江载芳，主编.诸福棠实用儿科学.第6版.北京：人民卫生出版社,1996, 1755-1756.
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[5] Kaplan C,Morinet F, Cartron J. Virus-induced antoimmune thrombocytopenia and neutropenia. Semin Hematol, 1992，29:34-44.
[6] Murray JC, Kelley PK, Hogrefe WR, et al. Childhood idiopathic thrombocytopenic purpura: association with human parvovirus B19 infection. Am J Pediatr Hematol Oncol, 1994，16:314-319.
(收稿：1998-08-17 修回：1998-09-29), http://www.100md.com
单位：710032 西安，第四军医大学西京医院儿科
关键词：细小病毒B19；人；聚合酶链反应；紫癜；血小板减少性；特发性
中华儿科杂志990105 【摘要】 目的 研究人细小病毒B19(HPV B19)感染与特发性血小板减少性紫癜(ITP)的关系。方法 应用巢式聚合酶链反应技术检测84例ITP患儿存档骨髓涂片标本中HPV B19-DNA，并以24例巨幼细胞性贫血(MA)患儿为对照。结果 84例ITP骨髓中HPV B19-DNA阳性36例，阳性率为43%,24例MA患儿骨髓中HPV B19-DNA阳性3例，阳性率为12%，(χ2=6.199,P<0.05)，ITP组中首发和复发，治疗前与治疗后以及不同性别患儿骨髓中HPV B19-DNA检出率均无明显差异，急性型与慢性型ITP患儿骨髓中HPV B19-DNA检出率之间有差异。结论 临床上较大部分ITP患儿的发病可能与HPV B19感染有关；急性型HPV B19-DNA检出率高。
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Relationship between human parovirous B19 infection and idiopathic thrombocytopenic purpura ZHANG Xiaofei, XU Dongliang, ZHANG Guocheng, et al. Department of Pediatrics, Xijing Hospital,the Fourth Military Medical University，Xian 710032
【Abstract】 Objective To study the relationship between human parovirus B19(HPV B19) infection and idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP). Methods Nested polymerase chain reaction was used to detect HPV B19-DNA on stock bone marrow smears from 84 children with ITP. Twenty-four cases of macrocytic anemia (MA) were chosen as controls. Results Thirty-six of 84 cases of ITP and 3 of 24 cases of MA were positive for HPV B19-DNA, with a positive rates of 43% and 12%, respectively (χ2=6.199, P<0.05). There were no differences in the HPV B19-DNA detective rates concerned with the onset and recurrence of ITP, treatment, and genders. However, there was a significant difference in detective rates between different stages of ITP (acute stage vs. chronic stage). Conclusion Most attacks of ITP might be correlated with HPV B19 infection. The higher detective rates of HPV B19 were found in the younger patients with ITP and in acute stage of ITP. However, the HPV B19-DNA detective rate was not correlated with the genders, treatement, as well as the onset and recurrence of ITP.
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【Key words】 Parvovirus B19, human Polymerase chain reaction Purpura，thrombocytopenic，idiopathic
特发性血小板减小性紫癜(ITP)是儿科常见的出血性疾病，其病因目前尚未完全明了。已知与ITP病因相关的病毒有十余种，其中以人细小病毒B19(HPV B19)尤为重要[1]，HPV B19可能是导致该病的主要病原之一。为探讨此病毒感染与小儿ITP之间的关系，我们用巢式聚合酶链反应(巢式PCR)方法对84 例ITP患儿经瑞氏染色存档的骨髓涂片标本进行了HPV B19-DNA的检测。
对象和方法
一、对象
ITP组：系1983年4月～1995年5月于我科住院的84例ITP患儿，其中男47例，女37例，男∶女为1.27∶1；年龄6个月～12岁。初发71例，复发13例，按照国内有关会议制定的标准确诊[2]。
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对照组：为同期巨幼红细胞性贫血(MA)患儿24例，男15例，女9例，男∶女为1.7:1；年龄1岁～10岁。
二、试剂
HPV B19巢式PCR特异性内外引物及阳性对照模板由沙特皇家医院研究中心提供。引物序列为：外引物 P1：5′-CTTTAGGTATAGCCAACTGG-3′, P2：5′-ACACTGAGTTTACTAAGTGGC-3′； 内引物P3：5′-CAAAAGCATGTGGAGTGAGG-3′, P4：5′-CCTTAT- AATGGTGCTCTGGG-3′。其扩增片段长度分别为1 112 bp(2 905～4 016)和104 bp(3 187～3 290)。Taq酶、10×PCR Buffer、4×dNTPs及Marker 均购自华美生物工程公司。
三、DNA提取
将两组经瑞氏染色室温存档的骨髓涂片标本用高压灭菌新手术刀片分别刮取2.0 cm×1.0 cm的骨髓细胞涂膜，置于Eppendorf管中，加入50 μl含有蛋白酶K裂解液，混匀后于65℃孵育1小时后，95℃水浴10分钟灭活蛋白酶K，然后离心15分钟(15 000r/min)，取上清液作PCR模板。
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四、巢式PCR扩增HPV B19-DNA
方法同文献[3]。第1对引物扩增过程主要为：50 μl反应体系中包括双蒸水32.5 μl，10×Buffer 5 μl，dNTP 4 μl，Taq酶1.5 μl，外引物P1、P2(300 mg/L)，模板5 μl(阳性对照1 μl，阴性对照以双蒸水作模板)。PCR循环条件为：93℃1分钟、55℃1分30秒、72℃1分钟，35个循环后72℃充分延伸10分钟 。第2对引物扩增：取第1次扩增产物2 μl为模板，以内引物P3、P4代替外引物，反应体系及条件同第一次扩增。
五、结果判定
取第2次扩增产物5 μl在2%琼脂糖凝胶中电泳，EB染色，紫外线灯下观察结果，于104 bp处出现特异性荧光区带判为HPV B19-DNA阳性。同批用猫细小病毒(CPV)、腺病毒3型(Adv3)、呼吸道合胞病毒(RSV)、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒(HSV)及风疹病毒(RV)提取的核酸，行巢式PCR检测，作为阴性对照。
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结果
一、巢式PCR特异性
将CPV、Adv3、RSV、CMV、HSV、RV核酸和HPV B19-DNA同批作巢式PCR扩增，只有HPV B19-DNA在104 bp处出现特异的阳性电泳带。
二、ITP组和对照组检测结果
巢式PCR检测84例ITP和24例MA患儿骨髓标本中的HPV B19-DNA，结果，ITP 84例中36例阳性，阳性率43%；对照组24例中3例阳性，阳性率12%。ITP组HPV B19-DNA阳性率高于对照组，差异有显著意义(χ2=6.199, P<0.05)。
三、ITP组不同性别HPV B19-DNA的检测结果
男性47例中阳性22例，阳性率47%；女性37例中阳性14例，阳性率38%。不同性别之间HPV B19-DNA的检出率差异无显著意义(χ2=0.363, P>0.05)。
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四、ITP组初发与复发HPV B19-DNA检测结果
初发71例患儿中阳性31例，阳性率44%；复发13例中阳性5例，阳性率38%。两组之间HPV B19-DNA检出率差异无显著意义(χ2=0.002, P>0.05)。
五、ITP组治疗前后HPV B19-DNA检测结果
治疗前61例患儿中阳性25例，阳性率41%；治疗后23例患儿中阳性11例，阳性率48%。治疗前后HPV B19-DNA的检出率差异无显著意义(χ2=0.101，P>0.05)。
六、ITP组不同类型HPV B19-DNA的检测结果
急性型49例患儿中阳性29例，阳性率59%；慢性型35例患儿中阳性7例，阳性率20%。急性型HPV B19-DNA的检测率高于慢性型。(χ2=11.256, P<0.05)。
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七、ITP组不同年龄HPV B19-DNA的检测结果
≤3岁19例(均为急性型)，其中阳性14例，阳性率74%；>3岁(65例)ITP患儿急性型30例，其中阳性22例(急性型15例)，阳性率34%。3岁以下患儿HPV B19-DNA的检测率高于3岁以上患儿(χ2=7.971,P<0.001)。
八、ITP组和对照组小于3岁HPV B19-DNA检测的结果
ITP组≤3岁19例中阳性14例，阳性率74%,对照组≤3岁11例中均为阴性，经Fisher′s确切概率检验，P值为0.00009，两者间差异有非常显著意义。
讨论
病毒感染被认为是导致ITP的主要原因[1]，有资料表明，约80%的ITP患儿在发病前3 周有上呼吸道病毒感染史[4]。但究竟ITP与何种病毒有较为密切的关系尚不能确定。有学者认为与EB 病毒、CMV及HPV B19等10余种DNA和(或)RNA病毒有关[5]。随着对HPV B19的深入研究，有关HPV B19感染与ITP并存的平行关系已有报道。1994年Murray等[6]对HPV B19与ITP相关性作了最新的前瞻性研究：35例以往健康的ITP患儿，其中17例(49%)外周血和骨髓中HPV B19-DNA阳性。6例(17%)HPV B19 IgM阳性，8例(23%)HPV B19 IgG阳性。而14例健康对照者中外周血HPV B19-DNA和IgM均无阳性者。此结果提示HPV B19可能与ITP密切相关。迄今为止国内未见有关应用巢式PCR技术检测ITP患儿存档骨髓涂片中HPV B19-DNA的报道。我们用巢式PCR 方法检测了84例ITP患儿存档骨髓涂片标本中HPV B19-DNA，阳性率为43%，明显高于对照组，提示国内有相当一部分ITP患儿发病可能与HPV B19感染有关。在本研究中，HPV B19感染与ITP患儿的首次发病和复发并无关系，与治疗前和治疗后(泼尼松、氨肽素、长春新碱)以及性别亦无关系。但急性型ITP中HPV B19-DNA的检出率高于慢性型，故认为急性型ITP的发生与HPV B19感染的关系可能更为密切，≤3岁的ITP患儿HPV B19-DNA的检出率高于3岁以上ITP患儿，且≤3岁的ITP患儿HPV B19-DNA的检出率明显高于≤3岁的MA对照组，这可能是婴幼儿发生急性ITP机会较多的原因。从而符合急性型多系病毒感染所致的观点。因本研究受标本限制，故未能作HPV B19特异性IgM检测。HPV B19感染引起ITP机制尚不清楚，需深入研究。
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参考文献
[1] 钱新宏，张笑飞，陈星琪.特发性血小板减少性紫癜病因学的研究进展.国外医学儿科学分册，1998，25：193-195.
[2] 杨士元，整理.特发性血小板减少性紫癜诊疗常规(草案).中华儿科杂志，1987，25 :104-105.
[3] Musiani M, Azzi A, Zerbini M, et al. Nested polymerase chain reaction assay for the detection of B19 parovirus DNA in human immunodeficiency virus patients. J Med Virol, 1993，40:157-160.
[4] 吴瑞萍，胡亚美，江载芳，主编.诸福棠实用儿科学.第6版.北京：人民卫生出版社,1996, 1755-1756.
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[5] Kaplan C,Morinet F, Cartron J. Virus-induced antoimmune thrombocytopenia and neutropenia. Semin Hematol, 1992，29:34-44.
[6] Murray JC, Kelley PK, Hogrefe WR, et al. Childhood idiopathic thrombocytopenic purpura: association with human parvovirus B19 infection. Am J Pediatr Hematol Oncol, 1994，16:314-319.
(收稿：1998-08-17 修回：1998-09-29), http://www.100md.com