新生大鼠缺氧缺血性脑损伤与肿瘤坏死因子基因表达的研究
作者：史金阳 韩玉昆 孙桂莲 高红
单位：110003 沈阳，中国医科大学第二临床学院
关键词：大鼠；脑缺氧；脑缺血；肿瘤坏死因子；基因表达
中华儿科杂志990207 【摘要】 目的 研究肿瘤坏死因子(TNF)α在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后脑内基因转录水平的变化。方法 制备左脑HIBD的新生大鼠模型。利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测新生大鼠HIBD后不同时间海马、皮质TNF-α基因转录水平的表达，经凝胶成像及分析系统扫描RT-PCR扩增产物，以内参照半定量分析TNF-α mRNA的动态变化。系列稀释的总RNA经RT-PCR扩增后行Southern杂交鉴定产物特异性。结果 (1)RT-PCR技术敏感特异，最低可检出100 fg总RNA，RT-PCR扩增产物只能特异地与其相应核酸探针杂交。(2)HIBD后1小时TNF-α mRNA开始增高，其高峰表达时间为HIBD后6小时，5天基本恢复至正常水平，高峰表达时左脑皮质、海马TNF-α mRNA水平分别为正常组的4.3～5.2倍(P<0.01)，为右脑的2.5～3.5倍(P<0.01)。损伤侧海马表达明显高于皮质(P<0.01)。结论 TNF-α在HIBD后早期出现转录，可能在HIBD发病过程中起重要作用。
, http://www.100md.com
A study on tumour necrosis factor-α gene expression in newborn rats after injury of cerebral hypoxic-ischemia. SHI Jinyang, HAN Yukun, SUN Guilian, et al. Second Hospital of China Medical University, Shenyang 110003
【Abstract】 Objective To study gene expression of tumour necrosis factor (TNF) α after hypoxic-ischemic brain damage (HIBD) in neonatal rats, in order to probe into the pathogenesis of HIBD. Methods A model of HIBD in newborn rats was established. TNF-α mRNA in the ischemic cortex and hippocampus was detected at different times after HIBD with reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Semiquantitative analysis of RT-PCR products was done with a White/UV transilluminator. Southern blot hybridization was used to identify the specificity of RT-PCR products amplified with sequential diluted total RNA. Results RT-PCR was a sensitive and specific technique. The expression of TNF-α mRNA was increased as early as 1 h after hypoxic-ischemia in both cortex and hippocampus, reached the peak level in 6 hrs, and returned to normal level in 5 days. The maximum expression of TNF-α mRNA was 4.3～5.2 times higher at the left side of cortex and hippocampus in HIBD rats than that in normal rats (P<0.01), and 2.5～3.5 times higher at the left side than that at the right (P<0.01). In the left hippocampus TNF-α mRNA expression was higher than that in the left cortex (P<0.01). Conclusion TNF-α transcribed at an early time after HIBD. It may play an important role in the process of developing HIBD.
, 百拇医药
【Key words】 Rats Cerebral anoxia Cerebral ischemia Tumor necrosis factor Gene expression
肿瘤坏死因子(TNF)α是参与中枢神经系统(CNS)炎症反应和免疫反应的多功能细胞因子[1]。它在CNS发育和脑损伤起重要作用。缺氧和(或)缺血是新生大鼠脑损伤的重要致病因素，我们用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法研究新生大鼠脑缺氧缺血后不同时间TNF-α mRNA表达水平，为探讨TNFα在未成熟脑损伤参与致病的可能机理奠定基础。
对象及方法
一、对象
1.新生大鼠左脑缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型的制作：于本院动物部选择7日龄新生Wistar大鼠54只，平均体重120 g，乙醚麻醉下无菌行左颈总动脉结扎术，1小时后于含8%氧气的氮气仓中缺氧2小时，测氧仪监测氧浓度为8±0.5%，仓温36±1℃。
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2.实验分组：新生大鼠HIBD后于1、3、6、12、48小时和5天分别断头处死大鼠，取其双侧大脑立即置于无RNA酶管中-196℃液氮中保存，每组大鼠各6只，设假手术对照组和正常对照组。
二、实验方法
1.总RNA提取：用TRIZOL总RNA提取试剂按说明书操作。分别提取双侧脑海马、皮质的总RNA，经紫外分光光度计(Shimadzu UV 1201)测定OD260和OD280值，计算总RNA含量。
2.反转录合成cDNA第一链及PCR扩增：取总RNA1 μg用于cDNA第一链合成。在20 μl反转录体系中，加入：AMV、RNAsin、dNTPs、Oligo(dT)15。5×RT Buffer，混匀后42℃保温60分钟，95℃ 5分钟灭活AMV，RT-PCR试剂购自Promega公司。取cDNA 3 μl用于PCR扩增。TNF-α引物和生物素5′末端标记的寡核苷酸探针根据基因库提供序列按引物设计原则自行设计，内参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物和探针序列参照文献[2]，均由上海细胞生物所合成，序列：TNF-α上游5′AGAACTCCAGGCGGTG TCTGTG3′下游5′GTGGCAAATCGGCTGACGGTGT3′探针5′-Biotin-GCTCCCTCTCATCAGGTTCCATGGCCCAG ACCCTCACACTCAGATCATCTT3′。GAPDH引物上游5′ACCACCATGGAGAAGGCTGG3′下游5′CTCAGTGTA GCCCAGGATGC3′探针5′-Biotin-GTGGAAGGGCTCAT GACCACAGTCCATGCCATCACTGCCACTCAGAAGAC3′
, 百拇医药
按以下程序扩增：94℃30秒钟、55℃45秒钟、72℃60秒钟、35个循环后72℃延伸5分钟。RT-PCR扩增产物经琼脂糖电泳、溴化乙锭染色紫外灯下观察。系列稀释的总RNA的RT-PCR产物电泳后Southern吸印，80℃干烤，42℃预杂交，再用生物素标记的探针42℃杂交过夜，经抗生物素碱性磷酸酶和NBT、BCIP显色，鉴定RT-PCR产物特异性和敏感性。
三、统计学处理方法
以内参照GAPDH吸光度值标化TNF-α吸光度值，得到TNF-α相对含量，结果用
±s表示，同组同侧不同部位(海马、皮质)及同组左、右侧样本均数作配对t检验，同侧各组动态比较作方差分析。
结 果
一、RT-PCR半定量检测新生大鼠HIBD后TNF-α mRNA(表1)
, 百拇医药
表1 新生大鼠脑缺氧缺血后TNF-α mRNA表达动态变化及与对照组比较(±s) 组别
海马
皮质
两部位配对t值
左(病侧)
右(健侧)
自身对比t值
左(病侧)
右(健侧)
自身对比t值
左
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右
正常对照组
0.59±0.05
0.64±0.04
1.75
0.77±0.09
0.75±0.07
0.67
3.74*
3.12*
假手术组
1.42±0.05
, http://www.100md.com
1.26±0.06
3.98*
1.18±0.04
1.23±0.05
1.75
11.80**
1.47
手术组术后
1小时
1.15±0.06
1.18±0.04
0.74
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0.75±0.03
1.19±0.06
13.39**
16.33**
2.73*
3小时
2.99±0.07
1.27±0.03
104.66**
1.27±0.03
1.33±0.04
, http://www.100md.com
16.43**
47.23**
6.21**
6小时
3.46±0.10
1.35±0.09
30.41**
3.07±0.08
1.26±0.09
29.16**
7.48**
, http://www.100md.com
1.73
12小时
2.12±0.08
1.20±0.09
14.82**
1.58±0.06
1.15±0.08
13.08**
11.90**
1.14
48小时
, 百拇医药 1.69±0.06
1.21±0.08
9.39**
1.61±0.04
1.14±0.07
26.84**
2.19
1.80
5天
0.70±0.03
0.99±0.04
11.34**
, 百拇医药
0.99±0.03
0.71±0.04
11.69**
14.15**
10.24**
组间比较F值
1917.25**
93.54**
1399.34**
116.52**
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* P<0.05，** P<0.01
由表1可见，正常时TNF-α mRNA即有少量表达，HIBD后1小时开始增高，6小时达高峰，5天基本恢复至正常。高峰表达时左脑皮质、海马TNF-α mRNA水平分别为正常组4.3～5.2倍(P<0.01)，为右脑2.5～3.5倍(P<0.01)，左海马TNF-α mRNA表达水平高于脑皮质(P<0.01)(图1)。
图1 新生大鼠HIBD后海马TNF-α mRNA表达 1为MarkerΦ×174/HaeⅢ；2为正常对照L；3为RH(1小时)；4为LH(1小时)；5为RH(3小时)；6为LH(3小时)；7为RH(6小时)；8为LH(6小时)；9为RH(12小时)；10为LH(12小时)；11为RH(48小时)；12为LH(48小时)；13为RH(5天)；14为LH(5天)；15为假手术对照R；16为假手术对照L；17为正常对照R；18为正常对照R；19为正常对照L；20为空白对照
, 百拇医药
图2 新生大鼠HIBD后皮质TNF-α mRNA表达 1为MarkerΦ×174/HaeⅢ；2为正常对照L；3为RC(1小时)；4为LC(1小时)；5为RC(3小时)；6为LC(3小时)；7为RC(6小时)；8为LC(6小时)；9为RC(12小时)；10为LC(12小时)；11为RC(48小时)；12为LC(48小时)；13为RC(5天)；14为LC(5天)；15为假手术对照R；16为假手术对照L；17为正常对照R；18为正常对照L；19为正常对照R；20为空白对照
二、RT-PCR的特异性与敏感性
系列稀释的总RNA标本RT-PCR扩增后结果表明RT-PCR最低可检出为100 fg总RNA(图2)。系列稀释的总RNA标本经RT-PCR扩增后产物进行的Southern杂交提示：TNF-α的RT-PCR扩增产物只与生物素标记的TNF-α DNA探针呈阳性反应，与其它细胞因子(GAPDH)探针反应结果均为阴性，其产物位置与预先设定相符(图3，4)。
, 百拇医药
图3 RT-PCR敏感性 1为MarkerΦ×174/HaeⅢ；2～5为100 pg、1 pg、10pg、100fg总RNA
图4 RT-PCR的特异性(与图2对应) (Sourthern杂交结果)
讨 论
TNF-α在外周组织主要源于单核-巨噬细胞系，CNS中主要源于胶质细胞，有关它在CNS中作用的文献近年才出现，且围产期HIBD中报道较少。本研究用RT-PCR技术结合凝胶成像及分析系统半定量观察了新生大鼠HIBD后不同时间TNF-α的表达，结果表明TNF-α mRNA在HIBD后1小时开始增高，6小时达高峰，5天后基本恢复至正常水平，与Szaflarski等[2]报告的结果类似。实验中TNF-α mRNA在HIBD后随时间不同而变化，而内参照GAPDH mRNA的转录水平的量不变，提示TNF-α mRNA转录水平的变化是对HIBD的特异反应。因此本研究提示TNF-α是与HIBD早期反应相关的细胞因子，在新生大鼠HIBD后其mRNA较早出现且迅速达到高峰，在脑损伤后可能启动炎症反应过程。
, 百拇医药
TNF-α为多功能的细胞因子，在感染和免疫反应中有广泛的生物学效应。它能介导表皮粘附分子[3]和其他感染介质的表达，因此在HIBD后促进了白细胞穿入和组织损伤。有文献报道颅内注射TNF-α能导致ω3结合位点的表达[4](脑损伤标志)并产生软膜血管收缩引起血脑屏障通透性增高。TNF-α在炎性细胞进入缺血区前出现表达增高的研究也为TNF-α在HIBD中的致炎作用提供了依据[5]。
本课题为国家“九五”攻关课题内容之一，课题号：96-902-06-04
参考文献
1 Feuerstein GZ, Liu T, Barone FK. Cytokine, inflammation, and brain injury: role of tumor necrosis factor-α. Cereb Blood Flow Metab Rev, 1994, 6:341-360.
, http://www.100md.com
2 Szaflarski J, Burtrum D, Siverstein FS. Cerebral hypoxia-ischemia stimulates cytokines gene expression in perinatal rats. Stroke, 1995, 26:1093-1110.
3 Hurwitz AA, Lyman WD, Guida MP, et al. Tumour necrosis factor α induces adhesion molecule expression in human fetal astrocytes. J Exp Med, 1992, 176:1631-1636.
4 Bourdiol F, Toulmond S, Senano A, et al. Increase in ω3 (peripheral type benzodiazepine) binding sites in the rat cortex and striatum after local injection of interleukin-1, tumour necrosis factor and lipopolysaccharide. Br Res, 1991, 543:194-200.
5 Del Zoppo GJ, Schmid-Schonbein GW, Mon E, et al. Polymorphonnuclear leukocytes occlude capillaries following middle cerebral artery occlusion and reperfusion in baboons. Stroke, 1991, 22:1276-1283.
(收稿：1997-12-11 修回：1998-07-24), 百拇医药
单位：110003 沈阳，中国医科大学第二临床学院
关键词：大鼠；脑缺氧；脑缺血；肿瘤坏死因子；基因表达
中华儿科杂志990207 【摘要】 目的 研究肿瘤坏死因子(TNF)α在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后脑内基因转录水平的变化。方法 制备左脑HIBD的新生大鼠模型。利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测新生大鼠HIBD后不同时间海马、皮质TNF-α基因转录水平的表达，经凝胶成像及分析系统扫描RT-PCR扩增产物，以内参照半定量分析TNF-α mRNA的动态变化。系列稀释的总RNA经RT-PCR扩增后行Southern杂交鉴定产物特异性。结果 (1)RT-PCR技术敏感特异，最低可检出100 fg总RNA，RT-PCR扩增产物只能特异地与其相应核酸探针杂交。(2)HIBD后1小时TNF-α mRNA开始增高，其高峰表达时间为HIBD后6小时，5天基本恢复至正常水平，高峰表达时左脑皮质、海马TNF-α mRNA水平分别为正常组的4.3～5.2倍(P<0.01)，为右脑的2.5～3.5倍(P<0.01)。损伤侧海马表达明显高于皮质(P<0.01)。结论 TNF-α在HIBD后早期出现转录，可能在HIBD发病过程中起重要作用。
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A study on tumour necrosis factor-α gene expression in newborn rats after injury of cerebral hypoxic-ischemia. SHI Jinyang, HAN Yukun, SUN Guilian, et al. Second Hospital of China Medical University, Shenyang 110003
【Abstract】 Objective To study gene expression of tumour necrosis factor (TNF) α after hypoxic-ischemic brain damage (HIBD) in neonatal rats, in order to probe into the pathogenesis of HIBD. Methods A model of HIBD in newborn rats was established. TNF-α mRNA in the ischemic cortex and hippocampus was detected at different times after HIBD with reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Semiquantitative analysis of RT-PCR products was done with a White/UV transilluminator. Southern blot hybridization was used to identify the specificity of RT-PCR products amplified with sequential diluted total RNA. Results RT-PCR was a sensitive and specific technique. The expression of TNF-α mRNA was increased as early as 1 h after hypoxic-ischemia in both cortex and hippocampus, reached the peak level in 6 hrs, and returned to normal level in 5 days. The maximum expression of TNF-α mRNA was 4.3～5.2 times higher at the left side of cortex and hippocampus in HIBD rats than that in normal rats (P<0.01), and 2.5～3.5 times higher at the left side than that at the right (P<0.01). In the left hippocampus TNF-α mRNA expression was higher than that in the left cortex (P<0.01). Conclusion TNF-α transcribed at an early time after HIBD. It may play an important role in the process of developing HIBD.
, 百拇医药
【Key words】 Rats Cerebral anoxia Cerebral ischemia Tumor necrosis factor Gene expression
肿瘤坏死因子(TNF)α是参与中枢神经系统(CNS)炎症反应和免疫反应的多功能细胞因子[1]。它在CNS发育和脑损伤起重要作用。缺氧和(或)缺血是新生大鼠脑损伤的重要致病因素，我们用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法研究新生大鼠脑缺氧缺血后不同时间TNF-α mRNA表达水平，为探讨TNFα在未成熟脑损伤参与致病的可能机理奠定基础。
对象及方法
一、对象
1.新生大鼠左脑缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型的制作：于本院动物部选择7日龄新生Wistar大鼠54只，平均体重120 g，乙醚麻醉下无菌行左颈总动脉结扎术，1小时后于含8%氧气的氮气仓中缺氧2小时，测氧仪监测氧浓度为8±0.5%，仓温36±1℃。
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2.实验分组：新生大鼠HIBD后于1、3、6、12、48小时和5天分别断头处死大鼠，取其双侧大脑立即置于无RNA酶管中-196℃液氮中保存，每组大鼠各6只，设假手术对照组和正常对照组。
二、实验方法
1.总RNA提取：用TRIZOL总RNA提取试剂按说明书操作。分别提取双侧脑海马、皮质的总RNA，经紫外分光光度计(Shimadzu UV 1201)测定OD260和OD280值，计算总RNA含量。
2.反转录合成cDNA第一链及PCR扩增：取总RNA1 μg用于cDNA第一链合成。在20 μl反转录体系中，加入：AMV、RNAsin、dNTPs、Oligo(dT)15。5×RT Buffer，混匀后42℃保温60分钟，95℃ 5分钟灭活AMV，RT-PCR试剂购自Promega公司。取cDNA 3 μl用于PCR扩增。TNF-α引物和生物素5′末端标记的寡核苷酸探针根据基因库提供序列按引物设计原则自行设计，内参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物和探针序列参照文献[2]，均由上海细胞生物所合成，序列：TNF-α上游5′AGAACTCCAGGCGGTG TCTGTG3′下游5′GTGGCAAATCGGCTGACGGTGT3′探针5′-Biotin-GCTCCCTCTCATCAGGTTCCATGGCCCAG ACCCTCACACTCAGATCATCTT3′。GAPDH引物上游5′ACCACCATGGAGAAGGCTGG3′下游5′CTCAGTGTA GCCCAGGATGC3′探针5′-Biotin-GTGGAAGGGCTCAT GACCACAGTCCATGCCATCACTGCCACTCAGAAGAC3′
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按以下程序扩增：94℃30秒钟、55℃45秒钟、72℃60秒钟、35个循环后72℃延伸5分钟。RT-PCR扩增产物经琼脂糖电泳、溴化乙锭染色紫外灯下观察。系列稀释的总RNA的RT-PCR产物电泳后Southern吸印，80℃干烤，42℃预杂交，再用生物素标记的探针42℃杂交过夜，经抗生物素碱性磷酸酶和NBT、BCIP显色，鉴定RT-PCR产物特异性和敏感性。
三、统计学处理方法
以内参照GAPDH吸光度值标化TNF-α吸光度值，得到TNF-α相对含量，结果用
±s表示，同组同侧不同部位(海马、皮质)及同组左、右侧样本均数作配对t检验，同侧各组动态比较作方差分析。结 果
一、RT-PCR半定量检测新生大鼠HIBD后TNF-α mRNA(表1)
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表1 新生大鼠脑缺氧缺血后TNF-α mRNA表达动态变化及与对照组比较(
±s) 组别海马
皮质
两部位配对t值
左(病侧)
右(健侧)
自身对比t值
左(病侧)
右(健侧)
自身对比t值
左
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右
正常对照组
0.59±0.05
0.64±0.04
1.75
0.77±0.09
0.75±0.07
0.67
3.74*
3.12*
假手术组
1.42±0.05
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1.26±0.06
3.98*
1.18±0.04
1.23±0.05
1.75
11.80**
1.47
手术组术后
1小时
1.15±0.06
1.18±0.04
0.74
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0.75±0.03
1.19±0.06
13.39**
16.33**
2.73*
3小时
2.99±0.07
1.27±0.03
104.66**
1.27±0.03
1.33±0.04
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16.43**
47.23**
6.21**
6小时
3.46±0.10
1.35±0.09
30.41**
3.07±0.08
1.26±0.09
29.16**
7.48**
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1.73
12小时
2.12±0.08
1.20±0.09
14.82**
1.58±0.06
1.15±0.08
13.08**
11.90**
1.14
48小时
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1.21±0.08
9.39**
1.61±0.04
1.14±0.07
26.84**
2.19
1.80
5天
0.70±0.03
0.99±0.04
11.34**
, 百拇医药
0.99±0.03
0.71±0.04
11.69**
14.15**
10.24**
组间比较F值
1917.25**
93.54**
1399.34**
116.52**
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* P<0.05，** P<0.01
由表1可见，正常时TNF-α mRNA即有少量表达，HIBD后1小时开始增高，6小时达高峰，5天基本恢复至正常。高峰表达时左脑皮质、海马TNF-α mRNA水平分别为正常组4.3～5.2倍(P<0.01)，为右脑2.5～3.5倍(P<0.01)，左海马TNF-α mRNA表达水平高于脑皮质(P<0.01)(图1)。
图1 新生大鼠HIBD后海马TNF-α mRNA表达 1为MarkerΦ×174/HaeⅢ；2为正常对照L；3为RH(1小时)；4为LH(1小时)；5为RH(3小时)；6为LH(3小时)；7为RH(6小时)；8为LH(6小时)；9为RH(12小时)；10为LH(12小时)；11为RH(48小时)；12为LH(48小时)；13为RH(5天)；14为LH(5天)；15为假手术对照R；16为假手术对照L；17为正常对照R；18为正常对照R；19为正常对照L；20为空白对照
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图2 新生大鼠HIBD后皮质TNF-α mRNA表达 1为MarkerΦ×174/HaeⅢ；2为正常对照L；3为RC(1小时)；4为LC(1小时)；5为RC(3小时)；6为LC(3小时)；7为RC(6小时)；8为LC(6小时)；9为RC(12小时)；10为LC(12小时)；11为RC(48小时)；12为LC(48小时)；13为RC(5天)；14为LC(5天)；15为假手术对照R；16为假手术对照L；17为正常对照R；18为正常对照L；19为正常对照R；20为空白对照
二、RT-PCR的特异性与敏感性
系列稀释的总RNA标本RT-PCR扩增后结果表明RT-PCR最低可检出为100 fg总RNA(图2)。系列稀释的总RNA标本经RT-PCR扩增后产物进行的Southern杂交提示：TNF-α的RT-PCR扩增产物只与生物素标记的TNF-α DNA探针呈阳性反应，与其它细胞因子(GAPDH)探针反应结果均为阴性，其产物位置与预先设定相符(图3，4)。
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图3 RT-PCR敏感性 1为MarkerΦ×174/HaeⅢ；2～5为100 pg、1 pg、10pg、100fg总RNA
图4 RT-PCR的特异性(与图2对应) (Sourthern杂交结果)
讨 论
TNF-α在外周组织主要源于单核-巨噬细胞系，CNS中主要源于胶质细胞，有关它在CNS中作用的文献近年才出现，且围产期HIBD中报道较少。本研究用RT-PCR技术结合凝胶成像及分析系统半定量观察了新生大鼠HIBD后不同时间TNF-α的表达，结果表明TNF-α mRNA在HIBD后1小时开始增高，6小时达高峰，5天后基本恢复至正常水平，与Szaflarski等[2]报告的结果类似。实验中TNF-α mRNA在HIBD后随时间不同而变化，而内参照GAPDH mRNA的转录水平的量不变，提示TNF-α mRNA转录水平的变化是对HIBD的特异反应。因此本研究提示TNF-α是与HIBD早期反应相关的细胞因子，在新生大鼠HIBD后其mRNA较早出现且迅速达到高峰，在脑损伤后可能启动炎症反应过程。
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TNF-α为多功能的细胞因子，在感染和免疫反应中有广泛的生物学效应。它能介导表皮粘附分子[3]和其他感染介质的表达，因此在HIBD后促进了白细胞穿入和组织损伤。有文献报道颅内注射TNF-α能导致ω3结合位点的表达[4](脑损伤标志)并产生软膜血管收缩引起血脑屏障通透性增高。TNF-α在炎性细胞进入缺血区前出现表达增高的研究也为TNF-α在HIBD中的致炎作用提供了依据[5]。
本课题为国家“九五”攻关课题内容之一，课题号：96-902-06-04
参考文献
1 Feuerstein GZ, Liu T, Barone FK. Cytokine, inflammation, and brain injury: role of tumor necrosis factor-α. Cereb Blood Flow Metab Rev, 1994, 6:341-360.
, http://www.100md.com
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(收稿：1997-12-11 修回：1998-07-24), 百拇医药