细胞内信号传递对脐血淋巴细胞凋亡的影响
作者：刘恩梅 李成荣 杨锡强 王莉佳 吴仕孝
单位：400014 重庆医科大学附属儿童医院(第二作者现在深圳市儿童医院工作)
关键词：胎血；白细胞，单核；脱噬作用；信号传递
中华儿科杂志990607 【摘要】 目的 探讨新生儿T淋巴细胞内信号传递与脐血淋巴细胞凋亡的关系。方法 以健康成人(14例)外周血单个核细胞(PBMC)为对照，测定19例足月新生儿脐血淋巴细胞胞内钙离子浓度，蛋白激酶A(PKA)活性和蛋白激酶C(PKC)激动剂PMA对脐血淋巴细胞凋亡的影响。结果 (1)经抗-CD3刺激前或刺激后脐血单个核细胞(CBMC)和PBMC细胞内钙离子浓度差异无显著意义；(2)PMA可纠正抗CD3诱导的CBMC凋亡；(3)培养2小时，CBMC PKA活性自发显著升高，而PBMC PKA活性下降。结论 细胞内信号传导不平衡可能是抗CD3诱导CBMC凋亡的主要原因，而CBMC自发凋亡可能与PKA活性升高有关。
, http://www.100md.com
The effect of intracellular signal transduction on apoptosis of cord blood mononuclear cells LIU Enmei, LI Chengrong, YANG Xiqiang, et al. Children′s Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400014
【Abstract】 Objective In order to explore the effect of intracellular signal transduction on apoptosis of cord blood mononuclear cells. Methods Intracellular calcium concentration, protein kinase A (PAK) activity, and the effect of PMA, which is the activator of protein kinase C (PKC) on apoptosis of cord blood mononuclear cells (CBMC) were determined in CBMC with the control of normal adult peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Results There were no differences in calcium concentrations between CBMC and PBMC before or after stimulation of anti-CD3. PMA could completely correct the CBMC apoptosis induced by anti-CD3. Spontanous PKA activities in CBMC cultured for 2 hours in absence of mitogen increased from 1.99 to 2.37 (P<0.01). While PKA activities in PBMC decreased. Conclusion The imbalance of intracellular signal transduction might be the main cause of apoptosis induced by anti-CD3 in CBMC. But spontanous apoptosis in CBMC might related to increased PKA activities.
, http://www.100md.com
【Key words】 Tetal blood Leukocytes, mononuclear Apoptosis Signal transduction
细胞通过一系列酶促反应，将刺激信号传递至细胞核触发基因表达，合成相应的蛋白质调控细胞活化、增殖、分化。近年来作为细胞增殖、分化的重要信号分子钙离子[Ca2+]蛋白激酶C(PKC)与凋亡的关系日趋引人注目，腺苷环化酶(AC)活化后产生的环磷酸腺苷(cAMP)及其依赖性的蛋白激酶A(PKA)也参与多种细胞的凋亡。文献报道新生儿T淋巴细胞(TL)经TL受体(TCR)信号传递有障碍[1]。我们的研究已证实脐血单个核细胞(CBMC)较成人外周血单个核细胞(PBMC)易发生凋亡[2]。本研究拟通过检测活化前后细胞内Ca2+浓度、PKA活性变化以及PKC激动剂PMA对CBMC凋亡的影响，探讨新生儿TL信号传导与凋亡的关系。
, http://www.100md.com 对象和方法
一、对象
足月顺产新生儿19例，平均胎龄40周，出生体重平均3 200g，其母无异常妊娠史。健康成人14例，平均年龄23岁，采血前4周无明显感染史，无血制品及免疫抑制剂或增强剂用药史。
二、细胞培养
常规分离肝素抗凝CBMC(CBMC组)与PBMC(PBMC组)，用含10%小牛血清RPMI-1640培养基将细胞调至1×106/ml，取2 ml加入24孔培养板中，37℃、5%CO2培养24小时，在以下4种条件下观察凋亡细胞率：(1)空白对照组；(2)抗CD3对照组；(3)PMA刺激组；(4)抗CD3加PMA刺激组。
三、凋亡细胞计数
, 百拇医药 按Mishell等[3]介绍的方法计数凋亡细胞，在荧光显微镜下观察丫啶橙、溴化乙啶染色的细胞，核固缩为圆点、新月形、杆状者为凋亡细胞，计数200个细胞并计算凋亡细胞率。
四、片段DNA分析
在实验设计的时间收集细胞，按Sellins等[4]描述的方法提取片段DNA，经1%琼脂糖电泳分析，紫外灯下观察结果及照相。
五、细胞内钙离子测定
CBMC或PBMC洗涤后重悬于Hank′s液中，2×106/ml加入5 μl Fura-2/Am至终浓度5 μmol/L，置37℃负载45分钟，洗涤后用Hank′s液将细胞浓度稀释为2×105/ml，在Hitachi-3010 荧光分光光度计测定荧光强度，激发波长340 nm，发射波长500 nm，狭缝10 nm，测定样本荧光强度F值后，加入0.1%TritonX-100测最大荧光强度(Fmax)，再加入3 mol EDTA 测最小荧光强度(Fmin)。
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抗-CD3刺激5分钟、10分钟后，再测定[Ca2+]浓度。
六、PKA活性测定
新鲜分离的新生儿CBMC或成人PBMC 4×106/ml，培养0小时、2小时测定PKA活性，后者分为两组：(1)空白对照组；(2)抗CD3刺激组。用PKA活性测定试剂盒(Gibico，USA)测定PKA活性，用Lowry法测定标本的蛋白质含量，按每毫克蛋白质计算。
七、统计学处理
实验数据以均值±标准差(
±s)表示，两样本作t检验。因所得的PKA活性值不是正态分布，首先将其作数据转换后，作t检验。
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结 果
一、细胞内Ca2+浓度
自发和经抗-CD3刺激5或10分钟，成人PBMC与CBMC细胞内Ca2+浓度上升幅度差异均无显著意义(P>0.05,表1)。
表1 CBMC和PBMC在抗-CD3刺激前后细胞内Ca2+浓度变化 试验阶段
细胞内Ca2+浓度(nm)
0 h的倍数
两组比较
t值
CBMC(n=19)
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PBMC(n=14)
CBMC
PBMC
0 h
8.9±35
108±34
1.00
1.00
1.58
抗-CD3刺激后
5 min
144±53
195±43
, 百拇医药
1.7±0.6
1.9±0.8
0.88*
10 min
182±82
235±50
2.1±0.7
2.3±0.7
0.93*
*P均>0.05
二、PMA对CBMC凋亡的影响
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PMA不能纠正CBMC自发凋亡，可纠正抗CD3诱导的CBMC凋亡(表2，图1)。
表2 CBMC和PBMC在不同条件下的凋亡细胞百分率(%) 组别
例数
0 h
24 h
空白
抗-CD3
抗-CD3+PMA
CBMC组
14
3.6±1.4
, 百拇医药
18.8±2.3
27.6±7.6
6.2±1.9
PBMC组
8
3.1±1.1
5.8±1.9
5.9±1.9
6.0±1.8
t值
0.87
13.36
, 百拇医药 7.86
0.23
P值
>0.05
<0.001
<0.001*
>0.05*
*t′检验结果
1：CBMC经抗-CD3+PMA刺激24小时
2：CBMC经PMA刺激24小时
3：CMBC经抗-CD3刺激24小时
, 百拇医药
4：CBMC培养24小时
5：CBMC培养0小时
6：入DNA EcoRI/HindⅢ
图1 PMA对CBMC凋亡的影响
三、PKA活性
培养前CBMC与PBMC PKA活性差异无显著意义(P>0.05)，培养后CBMC PKA活性较培养前升高,且高于成人PBMC(P<0.05)，经抗-CD3刺激后CBMC PKA活性下降，而成人PBMC的PKC活性则升高(表3)。 表3 CBMC和PBMC在培养前后及抗-CD3刺激前后PKA活性变化比较 培养时间
PKA活性(log±s log )(%)
, 百拇医药
为培养前倍数
两组比较
t值
CBMC (n=13)
PBMC (n=10)
CBMC
PBMC
培养前(0 h)
1.99±0.25
2.15±0.24
1.00
1.00
, 百拇医药
1.55
培养2 h
空白对照组
2.37±0.42
1.83±0.40
1.24±0.35
0.86±0.21
3.03*
抗-CD3对照组
1.90±0.27
2.23±0.30
1.90±0.27
, 百拇医药
2.23±0.30
4.15*
*P<0.01
讨 论
TCR与抗原或丝裂原结合后，通过一系列酪氨酸磷酸化活化磷脂酶Cr(PLCr)，PLCr催化4，5-磷脂酰二磷酸肌醇分解为三磷酸肌醇(IP3)和甘油二醇(DAG)。IP3使细胞内Ca2+储存池中Ca2+释放，DAG则活化PKC。Ca2+释放后通过钙神经蛋白，活化转录因子活化T细胞核因子(NF-AT)，产生IL-2，而PKC则通过NF-KB或直接将信号传导至核内，协同Ca2+诱导细胞活化和增殖。
近年来细胞内信号传递与凋亡的关系已成为细胞生物学研究的重点，其中Ca2+、PKC和PKA对凋亡的作用尤其引人注目。McConkey等[5]发现抗-CD3诱导的人或鼠胸腺细胞凋亡伴有Ca2+升高，可通过PMA激活PKC纠正其凋亡，推测抗-CD3刺激后细胞内Ca2+升高与PKC不足或转位异常引起的细胞内信号传导不平衡是胸腺细胞发生凋亡的原因。本研究发现经抗-CD3刺激后，可导致CBMC凋亡，虽然伴有CBMC细胞内Ca2+浓度上升，但其上升幅度与成人PBMC无显著差异，加用PKC激动剂PMA可纠正抗-CD3诱导的CBMC凋亡，提示CBMC经TCR通道活化后，其Ca2+/PKC信号传导的失衡所致的凋亡主要为PKC不足，而非细胞内Ca2+升高。推测新生儿CBMC PKC不足与发育不成熟及特殊的表型有关。大于90%以上的CBMC是CD 45 RA+细胞，其DAG基础水平低，需要较高的PKC活化，才能达到信号传递所需的阈值[6]。
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前列腺素E2(PGE2)通过活化AC而产生cAMP及PKA，文献报道cAMP相似物dbcAMP，激动剂forskin诱导或促进人外周血BL和胸腺细胞凋亡。有人报道在PGE2作用下CBMC较成人PBMC易发生凋亡。本组资料表明：未经抗-CD3刺激体外培养的CBMC PKA活性明显高于成人PBMC，提示CBMC自发凋亡可能与PKA活性升高有关。CBMC PKA活性自发升高的原因不清楚，推测与CBMC所处的特定微环境有关，是否受抗原提呈细胞产生的内源性PGE2或其它激素的影响有待进一步研究。
本课题接受国家自然科学基金(项目编号：39670675)与四川省卫生厅科研基金资助
参考文献
1 Bertotto A, Gerli R, Lanfrancone L, et al. Activation of cord T lymphocytes, cellular and molecular analysis of the defective response induced by anti-CD3 monoclonal antibody. Cell Immunology, 1990, 127: 247-259.
, 百拇医药
2 刘恩梅，李成荣，杨锡强，等.脐血淋巴细胞凋亡及其影响因素.中华儿科杂志，1998，36：334-336.
3 Mishell BB, Shiqi SM, Henry C, et al. Preparation of mouse cell suspensions. In: selected methods in cellular immunology. New York: Free man, 1980. 21-22.
4 Sellins KS, Cohen JJ. Gene induction by gamma-irradiation leads to DNA fragmentation in lymphocytes. J Immunol, 1987, 139: 3199-3206.
5 McConkey DJ, Hartzell P, Aador-Perez JF, et al. Calcium-dependent killing of immature thymocytes by stimulation via the CD3/T cell receptor complex. J Immunol, 1989, 141: 1801-1806.
6 Schwinzer R, Siefken R, Frankin RA, et al. Human CD45 RA+ and CD45 RO+ T cells exhibit similar CD3/T cell receptor-mediated transmembrane signaling capacities but differ in respones to costimulatory signals. Eur J Immunol, 1994, 24: 1391-1395.
(收稿：1998-02-26 修回：1998-09-10), 百拇医药
单位：400014 重庆医科大学附属儿童医院(第二作者现在深圳市儿童医院工作)
关键词：胎血；白细胞，单核；脱噬作用；信号传递
中华儿科杂志990607 【摘要】 目的 探讨新生儿T淋巴细胞内信号传递与脐血淋巴细胞凋亡的关系。方法 以健康成人(14例)外周血单个核细胞(PBMC)为对照，测定19例足月新生儿脐血淋巴细胞胞内钙离子浓度，蛋白激酶A(PKA)活性和蛋白激酶C(PKC)激动剂PMA对脐血淋巴细胞凋亡的影响。结果 (1)经抗-CD3刺激前或刺激后脐血单个核细胞(CBMC)和PBMC细胞内钙离子浓度差异无显著意义；(2)PMA可纠正抗CD3诱导的CBMC凋亡；(3)培养2小时，CBMC PKA活性自发显著升高，而PBMC PKA活性下降。结论 细胞内信号传导不平衡可能是抗CD3诱导CBMC凋亡的主要原因，而CBMC自发凋亡可能与PKA活性升高有关。
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The effect of intracellular signal transduction on apoptosis of cord blood mononuclear cells LIU Enmei, LI Chengrong, YANG Xiqiang, et al. Children′s Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400014
【Abstract】 Objective In order to explore the effect of intracellular signal transduction on apoptosis of cord blood mononuclear cells. Methods Intracellular calcium concentration, protein kinase A (PAK) activity, and the effect of PMA, which is the activator of protein kinase C (PKC) on apoptosis of cord blood mononuclear cells (CBMC) were determined in CBMC with the control of normal adult peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Results There were no differences in calcium concentrations between CBMC and PBMC before or after stimulation of anti-CD3. PMA could completely correct the CBMC apoptosis induced by anti-CD3. Spontanous PKA activities in CBMC cultured for 2 hours in absence of mitogen increased from 1.99 to 2.37 (P<0.01). While PKA activities in PBMC decreased. Conclusion The imbalance of intracellular signal transduction might be the main cause of apoptosis induced by anti-CD3 in CBMC. But spontanous apoptosis in CBMC might related to increased PKA activities.
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【Key words】 Tetal blood Leukocytes, mononuclear Apoptosis Signal transduction
细胞通过一系列酶促反应，将刺激信号传递至细胞核触发基因表达，合成相应的蛋白质调控细胞活化、增殖、分化。近年来作为细胞增殖、分化的重要信号分子钙离子[Ca2+]蛋白激酶C(PKC)与凋亡的关系日趋引人注目，腺苷环化酶(AC)活化后产生的环磷酸腺苷(cAMP)及其依赖性的蛋白激酶A(PKA)也参与多种细胞的凋亡。文献报道新生儿T淋巴细胞(TL)经TL受体(TCR)信号传递有障碍[1]。我们的研究已证实脐血单个核细胞(CBMC)较成人外周血单个核细胞(PBMC)易发生凋亡[2]。本研究拟通过检测活化前后细胞内Ca2+浓度、PKA活性变化以及PKC激动剂PMA对CBMC凋亡的影响，探讨新生儿TL信号传导与凋亡的关系。
, http://www.100md.com 对象和方法
一、对象
足月顺产新生儿19例，平均胎龄40周，出生体重平均3 200g，其母无异常妊娠史。健康成人14例，平均年龄23岁，采血前4周无明显感染史，无血制品及免疫抑制剂或增强剂用药史。
二、细胞培养
常规分离肝素抗凝CBMC(CBMC组)与PBMC(PBMC组)，用含10%小牛血清RPMI-1640培养基将细胞调至1×106/ml，取2 ml加入24孔培养板中，37℃、5%CO2培养24小时，在以下4种条件下观察凋亡细胞率：(1)空白对照组；(2)抗CD3对照组；(3)PMA刺激组；(4)抗CD3加PMA刺激组。
三、凋亡细胞计数
, 百拇医药 按Mishell等[3]介绍的方法计数凋亡细胞，在荧光显微镜下观察丫啶橙、溴化乙啶染色的细胞，核固缩为圆点、新月形、杆状者为凋亡细胞，计数200个细胞并计算凋亡细胞率。
四、片段DNA分析
在实验设计的时间收集细胞，按Sellins等[4]描述的方法提取片段DNA，经1%琼脂糖电泳分析，紫外灯下观察结果及照相。
五、细胞内钙离子测定
CBMC或PBMC洗涤后重悬于Hank′s液中，2×106/ml加入5 μl Fura-2/Am至终浓度5 μmol/L，置37℃负载45分钟，洗涤后用Hank′s液将细胞浓度稀释为2×105/ml，在Hitachi-3010 荧光分光光度计测定荧光强度，激发波长340 nm，发射波长500 nm，狭缝10 nm，测定样本荧光强度F值后，加入0.1%TritonX-100测最大荧光强度(Fmax)，再加入3 mol EDTA 测最小荧光强度(Fmin)。
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抗-CD3刺激5分钟、10分钟后，再测定[Ca2+]浓度。
六、PKA活性测定
新鲜分离的新生儿CBMC或成人PBMC 4×106/ml，培养0小时、2小时测定PKA活性，后者分为两组：(1)空白对照组；(2)抗CD3刺激组。用PKA活性测定试剂盒(Gibico，USA)测定PKA活性，用Lowry法测定标本的蛋白质含量，按每毫克蛋白质计算。
七、统计学处理
实验数据以均值±标准差(
±s)表示，两样本作t检验。因所得的PKA活性值不是正态分布，首先将其作数据转换后，作t检验。, http://www.100md.com
结 果
一、细胞内Ca2+浓度
自发和经抗-CD3刺激5或10分钟，成人PBMC与CBMC细胞内Ca2+浓度上升幅度差异均无显著意义(P>0.05,表1)。
表1 CBMC和PBMC在抗-CD3刺激前后细胞内Ca2+浓度变化 试验阶段
细胞内Ca2+浓度(nm)
0 h的倍数
两组比较
t值
CBMC(n=19)
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PBMC(n=14)
CBMC
PBMC
0 h
8.9±35
108±34
1.00
1.00
1.58
抗-CD3刺激后
5 min
144±53
195±43
, 百拇医药
1.7±0.6
1.9±0.8
0.88*
10 min
182±82
235±50
2.1±0.7
2.3±0.7
0.93*
*P均>0.05
二、PMA对CBMC凋亡的影响
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PMA不能纠正CBMC自发凋亡，可纠正抗CD3诱导的CBMC凋亡(表2，图1)。
表2 CBMC和PBMC在不同条件下的凋亡细胞百分率(%) 组别
例数
0 h
24 h
空白
抗-CD3
抗-CD3+PMA
CBMC组
14
3.6±1.4
, 百拇医药
18.8±2.3
27.6±7.6
6.2±1.9
PBMC组
8
3.1±1.1
5.8±1.9
5.9±1.9
6.0±1.8
t值
0.87
13.36
, 百拇医药 7.86
0.23
P值
>0.05
<0.001
<0.001*
>0.05*
*t′检验结果
1：CBMC经抗-CD3+PMA刺激24小时2：CBMC经PMA刺激24小时
3：CMBC经抗-CD3刺激24小时
, 百拇医药
4：CBMC培养24小时
5：CBMC培养0小时
6：入DNA EcoRI/HindⅢ
图1 PMA对CBMC凋亡的影响
三、PKA活性
培养前CBMC与PBMC PKA活性差异无显著意义(P>0.05)，培养后CBMC PKA活性较培养前升高,且高于成人PBMC(P<0.05)，经抗-CD3刺激后CBMC PKA活性下降，而成人PBMC的PKC活性则升高(表3)。 表3 CBMC和PBMC在培养前后及抗-CD3刺激前后PKA活性变化比较 培养时间
PKA活性(log
±s log )(%), 百拇医药
为培养前倍数
两组比较
t值
CBMC (n=13)
PBMC (n=10)
CBMC
PBMC
培养前(0 h)
1.99±0.25
2.15±0.24
1.00
1.00
, 百拇医药
1.55
培养2 h
空白对照组
2.37±0.42
1.83±0.40
1.24±0.35
0.86±0.21
3.03*
抗-CD3对照组
1.90±0.27
2.23±0.30
1.90±0.27
, 百拇医药
2.23±0.30
4.15*
*P<0.01
讨 论
TCR与抗原或丝裂原结合后，通过一系列酪氨酸磷酸化活化磷脂酶Cr(PLCr)，PLCr催化4，5-磷脂酰二磷酸肌醇分解为三磷酸肌醇(IP3)和甘油二醇(DAG)。IP3使细胞内Ca2+储存池中Ca2+释放，DAG则活化PKC。Ca2+释放后通过钙神经蛋白，活化转录因子活化T细胞核因子(NF-AT)，产生IL-2，而PKC则通过NF-KB或直接将信号传导至核内，协同Ca2+诱导细胞活化和增殖。
近年来细胞内信号传递与凋亡的关系已成为细胞生物学研究的重点，其中Ca2+、PKC和PKA对凋亡的作用尤其引人注目。McConkey等[5]发现抗-CD3诱导的人或鼠胸腺细胞凋亡伴有Ca2+升高，可通过PMA激活PKC纠正其凋亡，推测抗-CD3刺激后细胞内Ca2+升高与PKC不足或转位异常引起的细胞内信号传导不平衡是胸腺细胞发生凋亡的原因。本研究发现经抗-CD3刺激后，可导致CBMC凋亡，虽然伴有CBMC细胞内Ca2+浓度上升，但其上升幅度与成人PBMC无显著差异，加用PKC激动剂PMA可纠正抗-CD3诱导的CBMC凋亡，提示CBMC经TCR通道活化后，其Ca2+/PKC信号传导的失衡所致的凋亡主要为PKC不足，而非细胞内Ca2+升高。推测新生儿CBMC PKC不足与发育不成熟及特殊的表型有关。大于90%以上的CBMC是CD 45 RA+细胞，其DAG基础水平低，需要较高的PKC活化，才能达到信号传递所需的阈值[6]。
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前列腺素E2(PGE2)通过活化AC而产生cAMP及PKA，文献报道cAMP相似物dbcAMP，激动剂forskin诱导或促进人外周血BL和胸腺细胞凋亡。有人报道在PGE2作用下CBMC较成人PBMC易发生凋亡。本组资料表明：未经抗-CD3刺激体外培养的CBMC PKA活性明显高于成人PBMC，提示CBMC自发凋亡可能与PKA活性升高有关。CBMC PKA活性自发升高的原因不清楚，推测与CBMC所处的特定微环境有关，是否受抗原提呈细胞产生的内源性PGE2或其它激素的影响有待进一步研究。
本课题接受国家自然科学基金(项目编号：39670675)与四川省卫生厅科研基金资助
参考文献
1 Bertotto A, Gerli R, Lanfrancone L, et al. Activation of cord T lymphocytes, cellular and molecular analysis of the defective response induced by anti-CD3 monoclonal antibody. Cell Immunology, 1990, 127: 247-259.
, 百拇医药
2 刘恩梅，李成荣，杨锡强，等.脐血淋巴细胞凋亡及其影响因素.中华儿科杂志，1998，36：334-336.
3 Mishell BB, Shiqi SM, Henry C, et al. Preparation of mouse cell suspensions. In: selected methods in cellular immunology. New York: Free man, 1980. 21-22.
4 Sellins KS, Cohen JJ. Gene induction by gamma-irradiation leads to DNA fragmentation in lymphocytes. J Immunol, 1987, 139: 3199-3206.
5 McConkey DJ, Hartzell P, Aador-Perez JF, et al. Calcium-dependent killing of immature thymocytes by stimulation via the CD3/T cell receptor complex. J Immunol, 1989, 141: 1801-1806.
6 Schwinzer R, Siefken R, Frankin RA, et al. Human CD45 RA+ and CD45 RO+ T cells exhibit similar CD3/T cell receptor-mediated transmembrane signaling capacities but differ in respones to costimulatory signals. Eur J Immunol, 1994, 24: 1391-1395.
(收稿：1998-02-26 修回：1998-09-10), 百拇医药