非甲基化胞嘧啶-腺嘌呤DNA的免疫调节作用
作者：王晓川 郭履赒
单位：200032上海医科大学儿科医院
关键词：
中华儿科杂志990634 以往人们认为DNA很少具有免疫原性。然而近年来的研究表明DNA是刺激免疫反应的重要成分之一。特别是具有特定序列的细菌DNA或经化学修饰的DNA确能刺激极为强烈的免疫应答。这类DNA可以导致一些免疫细胞的增殖和分化。也具有重要的免疫调节作用。本研究拟就上述研究现状及可能的应用前景论述如下。
1.细菌DNA与脊椎动物DNA的区别：细菌DNA与脊椎动物DNA有多方面的不同。其中之一是细菌DNA中存在随机机率的非甲基化胞嘧啶-腺嘌呤(CpG)双脱氧核苷酸(1/16)，其中95%胞嘧啶为非甲基化；脊椎动物中CpG双脱氧核苷酸仅1/50(CpG抑制)，CpG中仅10-30%胞嘧啶为非甲基化[1]。脊椎动物存在的CpG中甲基化的胞嘧啶容易被其它碱基所取代，被认为是‘突变热点’，这也是脊椎动物‘CpG抑制’的原因之一。产生免疫调节作用的基础正是这些非甲基化的CpG。基于此，通过人工合成的含有CpG双脱氧核肽寡脱氧核苷酸(ODNs)也可产生与细菌DNA相同的免疫调节效应。除了非甲基化CpG之外，调节免疫反应的DNA还必须含有特定的基序，即在CpG相邻的5′端是两个嘌呤碱，3′端是两个嘧啶碱。为方便叙述，我们将上述细菌及人工合成的具有免疫调节作用的DNA统称为CpG DNA。
, 百拇医药
2.CpG DNA作用于免疫细胞的分子机制：B细胞及一些其他细胞表面有CpG DNA的特异受体，细胞对CPG DNA的摄取是通过受体起作用的。CpG DNA对B细胞和单核细胞产生的最早效应之一是产生反应性的氧簇(reactive oxygen species ROS)，可发生在5分钟内。ROS可作为第二信号，是激活核因子κB(NFκB)的信号之一。CpG DNA刺激B细胞和单核细胞后15分钟NFκB被激活。并能降解NFκB抑制因子IκBα和β。
3. CpG DNA的免疫调节作用：激活B细胞：CpG DNA激活B细胞为非T细胞依赖性，使其进入细胞分裂周期。CpG DNA具有B细胞丝裂原的作用。CpG DNA可促进B细胞抗原特异性的免疫应答，提示CpG DNA可能成为极为有价值的疫苗免疫佐剂。
细胞因子产生：CpG DNA可以直接激活单核/巨噬细胞和树突样细胞等，使其分泌多种细胞因子，包括高水平的IL-12、IFN-γ及一些促炎症细胞因子…。通过IL-12和IFN-γ等细胞因子CpG DNA间接导致TH1型细胞因子产生，增强CTL和NK细胞的活性；使促炎症细胞因子分泌增加。对TNF-α敏感小鼠使用CpG DNA后可使小鼠产生休克反应，其机制是CpG DNA使小鼠单核/巨噬细胞大量分泌TNF-α。我们的研究也观察到大肠杆菌DNA可促使人类单核/巨噬细胞株U937分泌TNF-α，这一反应不同于细菌脂多糖(LPS)的作用。CpG DNA使促炎症细胞因子分泌的现象在感染性疾病中所起的作用还不清楚。
, 百拇医药
4.CpG DNA作为预防接种免疫佐剂：蛋白和灭活疫苗：目前疫苗中的一个重要缺欠是只能产生十分弱的TH1免疫应答，这类疫苗通常含氢氧化铝作为免疫佐剂，铝制剂更易导致TH2应答，干扰了CTL的产生。在小鼠实验中，铝制剂可以选择性阻断HBsAg 免疫中CD8+CTL的激活。CpG DNA可促进TH1应答，有利于克服上述不足。此外，CTL与抗体应答相比，更有利于清除细胞胞内感染微生物。灭活微生物或其亚单位等外源性抗原，由于缺乏MHCI类的递呈可能不会诱导活化特异性CTL。CpG DNA通过促进IL-12等细胞因子的产生有利于激发机体对外来抗原产生CTL应答反应。
已证实，在蛋白抗原和亚单位的流感疫苗中加入CpG DNA可强烈促进抗原特异性TH1免疫应答。CpG DNA是对HBsAg产生抗体和CTL应答强烈的免疫佐剂。按此推论，CPG DNA也可用于肿瘤疫苗的佐剂。
, 百拇医药
基因免疫：在基因免疫过程中，目前主要是通过肌注质粒DNA，供肌细胞、抗原递呈细胞(如树突样细胞)摄取并表达。含有CpG特征序列的DNA载体可使APC产生协同刺激因子，诱导针对病毒、细菌和原虫的特异性CTL应答反映。在肿瘤疫苗中也有类似的效果，这类具有佐剂效应的DNA骨架必须有非甲基化的CpG特征序列，如果使用CpG甲基化酶使DNA载体甲基化则无此效应。也就是说富含非甲基化的CpG特征序列是有效的基因疫苗的免疫佐剂。
实际上以质粒为载体的基因疫苗的免疫反应由两种途径介导：一是质粒中插入编码特异的DNA通过转录与翻译产生一定量的蛋白质导致特异性免疫应答；二是DNA骨架中CpG 基序直接刺激免疫活性表达，并导致APCs细胞表达协同刺激分子从而产生对编码蛋白质的应答。提示可以通过提高质粒载体中插入的CpG基序数量以提高基因疫苗的免疫效果。
5.临床应用前景：促进机体免疫发育：尽管脊椎动物DNA的免疫原性微弱，但在实验与应用中观察到其具有一定的促进机体免疫发育的作用，尤以婴幼儿时期为著。奶粉中加入与母乳相同成分的单核苷酸(母乳化)，可以有效增进婴儿第一年内机体对破伤风、白喉等疫苗的抗体反应。由于CpG DNA强烈的免疫调节作用，也许可成为婴儿期有效的促进免疫发育、增进疫苗免疫效应的有效手段。
, 百拇医药
过敏性疾病：TH1和TH2应答的平衡是机体免疫状态正常的必要条件之一。TH2应答过于优势是机体处于过敏状态的重要条件。现代治疗试图通过细胞因子以调节机体的TH1和TH2失衡达到治疗与预防过敏性疾病的目的，但至今还没有令人满意的措施。CpG DNA所致强烈的TH1样应答反应，进而抑制TH2应答或许可用于预防和治疗过敏性疾病。
特殊感染性疾病：一些感染性疾病的临床表现是因TH2的强烈应答所致的病理过程。例如小鼠致死性利什曼原虫感染模型表现为机体强烈的TH2应答。通过使用CpG DNA可以使TH2向TH1应答转化。其机理是通过提高IL-12产量以及增加IL-12R β链表达抑制了过强的 TH2应答，减轻了临床症状。
, 百拇医药
肿瘤治疗：CpG DNA可激活NK细胞和明显促进抗体依赖性细胞毒性细胞(ADCC)作用。联合使用CpG DNA及抗肿瘤单克隆抗体治疗肿瘤效果更明显且副作用少。动物实验表明：患有B细胞淋巴瘤的小鼠使用一次CpG DNA之后，注射抗肿瘤单克隆抗体，长期存活率达70-80%。而反复使用IL-12和抗肿瘤单克隆抗体，长期存活率仅40%。现正计划联合CpG DNA和抗肿瘤单克隆抗体进行人类肿瘤治疗的临床试验。
6.结语：DNA作为最重要的生物大分子之一，具有重要的免疫调节作用，可能为今后提供新的免疫治疗手段。尽管对其在免疫系统中的作用尚不完全了解，但已显示了广泛的应用前景。
(收稿：1999-01-22 修回：1999-2-09), 百拇医药
单位：200032上海医科大学儿科医院
关键词：
中华儿科杂志990634 以往人们认为DNA很少具有免疫原性。然而近年来的研究表明DNA是刺激免疫反应的重要成分之一。特别是具有特定序列的细菌DNA或经化学修饰的DNA确能刺激极为强烈的免疫应答。这类DNA可以导致一些免疫细胞的增殖和分化。也具有重要的免疫调节作用。本研究拟就上述研究现状及可能的应用前景论述如下。
1.细菌DNA与脊椎动物DNA的区别：细菌DNA与脊椎动物DNA有多方面的不同。其中之一是细菌DNA中存在随机机率的非甲基化胞嘧啶-腺嘌呤(CpG)双脱氧核苷酸(1/16)，其中95%胞嘧啶为非甲基化；脊椎动物中CpG双脱氧核苷酸仅1/50(CpG抑制)，CpG中仅10-30%胞嘧啶为非甲基化[1]。脊椎动物存在的CpG中甲基化的胞嘧啶容易被其它碱基所取代，被认为是‘突变热点’，这也是脊椎动物‘CpG抑制’的原因之一。产生免疫调节作用的基础正是这些非甲基化的CpG。基于此，通过人工合成的含有CpG双脱氧核肽寡脱氧核苷酸(ODNs)也可产生与细菌DNA相同的免疫调节效应。除了非甲基化CpG之外，调节免疫反应的DNA还必须含有特定的基序，即在CpG相邻的5′端是两个嘌呤碱，3′端是两个嘧啶碱。为方便叙述，我们将上述细菌及人工合成的具有免疫调节作用的DNA统称为CpG DNA。
, 百拇医药
2.CpG DNA作用于免疫细胞的分子机制：B细胞及一些其他细胞表面有CpG DNA的特异受体，细胞对CPG DNA的摄取是通过受体起作用的。CpG DNA对B细胞和单核细胞产生的最早效应之一是产生反应性的氧簇(reactive oxygen species ROS)，可发生在5分钟内。ROS可作为第二信号，是激活核因子κB(NFκB)的信号之一。CpG DNA刺激B细胞和单核细胞后15分钟NFκB被激活。并能降解NFκB抑制因子IκBα和β。
3. CpG DNA的免疫调节作用：激活B细胞：CpG DNA激活B细胞为非T细胞依赖性，使其进入细胞分裂周期。CpG DNA具有B细胞丝裂原的作用。CpG DNA可促进B细胞抗原特异性的免疫应答，提示CpG DNA可能成为极为有价值的疫苗免疫佐剂。
细胞因子产生：CpG DNA可以直接激活单核/巨噬细胞和树突样细胞等，使其分泌多种细胞因子，包括高水平的IL-12、IFN-γ及一些促炎症细胞因子…。通过IL-12和IFN-γ等细胞因子CpG DNA间接导致TH1型细胞因子产生，增强CTL和NK细胞的活性；使促炎症细胞因子分泌增加。对TNF-α敏感小鼠使用CpG DNA后可使小鼠产生休克反应，其机制是CpG DNA使小鼠单核/巨噬细胞大量分泌TNF-α。我们的研究也观察到大肠杆菌DNA可促使人类单核/巨噬细胞株U937分泌TNF-α，这一反应不同于细菌脂多糖(LPS)的作用。CpG DNA使促炎症细胞因子分泌的现象在感染性疾病中所起的作用还不清楚。
, 百拇医药
4.CpG DNA作为预防接种免疫佐剂：蛋白和灭活疫苗：目前疫苗中的一个重要缺欠是只能产生十分弱的TH1免疫应答，这类疫苗通常含氢氧化铝作为免疫佐剂，铝制剂更易导致TH2应答，干扰了CTL的产生。在小鼠实验中，铝制剂可以选择性阻断HBsAg 免疫中CD8+CTL的激活。CpG DNA可促进TH1应答，有利于克服上述不足。此外，CTL与抗体应答相比，更有利于清除细胞胞内感染微生物。灭活微生物或其亚单位等外源性抗原，由于缺乏MHCI类的递呈可能不会诱导活化特异性CTL。CpG DNA通过促进IL-12等细胞因子的产生有利于激发机体对外来抗原产生CTL应答反应。
已证实，在蛋白抗原和亚单位的流感疫苗中加入CpG DNA可强烈促进抗原特异性TH1免疫应答。CpG DNA是对HBsAg产生抗体和CTL应答强烈的免疫佐剂。按此推论，CPG DNA也可用于肿瘤疫苗的佐剂。
, 百拇医药
基因免疫：在基因免疫过程中，目前主要是通过肌注质粒DNA，供肌细胞、抗原递呈细胞(如树突样细胞)摄取并表达。含有CpG特征序列的DNA载体可使APC产生协同刺激因子，诱导针对病毒、细菌和原虫的特异性CTL应答反映。在肿瘤疫苗中也有类似的效果，这类具有佐剂效应的DNA骨架必须有非甲基化的CpG特征序列，如果使用CpG甲基化酶使DNA载体甲基化则无此效应。也就是说富含非甲基化的CpG特征序列是有效的基因疫苗的免疫佐剂。
实际上以质粒为载体的基因疫苗的免疫反应由两种途径介导：一是质粒中插入编码特异的DNA通过转录与翻译产生一定量的蛋白质导致特异性免疫应答；二是DNA骨架中CpG 基序直接刺激免疫活性表达，并导致APCs细胞表达协同刺激分子从而产生对编码蛋白质的应答。提示可以通过提高质粒载体中插入的CpG基序数量以提高基因疫苗的免疫效果。
5.临床应用前景：促进机体免疫发育：尽管脊椎动物DNA的免疫原性微弱，但在实验与应用中观察到其具有一定的促进机体免疫发育的作用，尤以婴幼儿时期为著。奶粉中加入与母乳相同成分的单核苷酸(母乳化)，可以有效增进婴儿第一年内机体对破伤风、白喉等疫苗的抗体反应。由于CpG DNA强烈的免疫调节作用，也许可成为婴儿期有效的促进免疫发育、增进疫苗免疫效应的有效手段。
, 百拇医药
过敏性疾病：TH1和TH2应答的平衡是机体免疫状态正常的必要条件之一。TH2应答过于优势是机体处于过敏状态的重要条件。现代治疗试图通过细胞因子以调节机体的TH1和TH2失衡达到治疗与预防过敏性疾病的目的，但至今还没有令人满意的措施。CpG DNA所致强烈的TH1样应答反应，进而抑制TH2应答或许可用于预防和治疗过敏性疾病。
特殊感染性疾病：一些感染性疾病的临床表现是因TH2的强烈应答所致的病理过程。例如小鼠致死性利什曼原虫感染模型表现为机体强烈的TH2应答。通过使用CpG DNA可以使TH2向TH1应答转化。其机理是通过提高IL-12产量以及增加IL-12R β链表达抑制了过强的 TH2应答，减轻了临床症状。
, 百拇医药
肿瘤治疗：CpG DNA可激活NK细胞和明显促进抗体依赖性细胞毒性细胞(ADCC)作用。联合使用CpG DNA及抗肿瘤单克隆抗体治疗肿瘤效果更明显且副作用少。动物实验表明：患有B细胞淋巴瘤的小鼠使用一次CpG DNA之后，注射抗肿瘤单克隆抗体，长期存活率达70-80%。而反复使用IL-12和抗肿瘤单克隆抗体，长期存活率仅40%。现正计划联合CpG DNA和抗肿瘤单克隆抗体进行人类肿瘤治疗的临床试验。
6.结语：DNA作为最重要的生物大分子之一，具有重要的免疫调节作用，可能为今后提供新的免疫治疗手段。尽管对其在免疫系统中的作用尚不完全了解，但已显示了广泛的应用前景。
(收稿：1999-01-22 修回：1999-2-09), 百拇医药