沙眼衣原体母婴垂直传播的研究
作者：鲁继荣 李玉梅 傅文永 单秀娟 李善玉 刘元洁 成焕吉 娄若康 李姗山 宋涛
单位：鲁继荣 李玉梅 傅文永 李善玉 成焕吉 宋涛 长春，白求恩医科大学第一临床学院儿科 130021；单秀娟 刘元洁 娄若康 吉林省计划生育科研所；李姗山 长春白求恩医科大学第一临床医学院皮肤科
关键词：衣原体；沙眼；衣原体感染；细菌外膜蛋白质类；疾病传播；垂直；多态性；限制性片段长度
中华儿科杂志991209 【摘要】 目的 从基因水平证实沙眼衣原体(CT)存在母婴间的垂直传播。方法 对106对母婴标本(宫颈标本106份，婴儿眼结膜、鼻咽部标本212份)用培养法证实CT的感染，PCR扩增CT的大部分主要外膜蛋白(MOMP)基因，并做限制性片段长度多态性(RFLP)分析，将母婴相对的标本通过PCR-RFLP分析法鉴定基因型。结果 106例孕妇宫颈标本培养及PCR阳性26例，从26例阳性孕妇所生新生儿中检出10例CT感染，证实垂直传播率为38%。该10对母婴眼部及鼻咽部各检出CT 8例及2例的标本经鉴定，证实每对母婴感染的CT基因型一致。结论 CT有很高的母婴垂直传播率，应早期筛查，降低新生儿CT感染率。
, 百拇医药
The study on vertical transmission of chlamydia trachomatis
LU Jirong, LI Yumei, FU Wenyong, et al. Department of Pediatrics,The First Clinical Medical College, Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130021
【Abstract】 Objective To confirm the vertical transmission of chlamydia trachomatis (CT) at the gene level among 106 pairs of mother-infants. Methods The cell culture method was applied to isolate CT. Most of the gene of major outer membrane protein (MOMP) in CT was amplified by polymerase chain reaction (PCR), and then analyzed by restriction fragment length polymorphism (RFLP). Results Twenty six of 106 pregnant women were positive for CT. Ten infants of the 26 mothers who were CT positive were confirmed to be infected with CT. The rate of vertical transmission was 38%. The 10 strains of CT from the infected infants were identified to be the same genotype as their mothers′. Conclusion The incidence of CT vertical transmission is high, so the infection of CT should be detected early to reduce the chance of CT infection in newborns.
, 百拇医药
【Key words】 Chlamydia trachomatis Chlamydia infections Bacterial outer membrane protein gene Disease transmission, vertical Polymorphism, restriction fragment length
沙眼衣原体(chlamydia trachomatis, CT)引起的泌尿生殖道感染逐渐受到重视，近年研究认为，母婴间存在CT的垂直传播。为了从基因水平给予证实，本研究对106对母婴标本进行CT检测，并应用PCR和限制性片段长度多态性(RFLP)分析法，对母婴相对应的阳性标本进行基因型鉴定，现报道如下。
对象和方法
一、对象
1.标本来源：对106例孕晚期妇女临产前(未破水)取宫颈标本106份，其新生儿于出生后3～7天采集睑结膜、鼻咽部标本212份。
, 百拇医药
2.12种CT标准株：A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L1由本院皮肤科李珊山博士惠赠(A/G-17/OT，B/TW-5/OT，C/TW-3/OT，E/UW-5/Cx，F/UW-55/Ur，G/UW-57/Ur，I/UW-12/Ur，HDJK L1/LLCM440)。
二、方法
1.标本采集：采用棉签拭子(宫颈标本可采用消毒刮片)用力擦拭后，迅速洗入2-蔗糖磷酸盐传送液中，放入冰盒内迅速送至研究室，-70℃保存(3天左右进行接种)。
2.细胞培养：采用Hela229细胞，按我室目前采用的方法进行[1]。
3.PCR扩增：CT的主要外膜蛋白(MOMP)引物由Frost等[2]设计，序列为5′-AT GA AA AA AC TC TT GA AA TC GG-3′(相当于MOMP序列的前20个核苷酸)和5′-TT TC TA GA TT TC AT TT TG TT -3′(相当于MOMP序列的1 058～1 077个核苷酸)。扩增片段长度为1 077碱基对(bp)。引物由大连宝泰克生物公司合成。
, 百拇医药
将培养阳性的标本液以4℃ 20 000 r/min离心10分钟，吸除上清后，沉淀中加入标本裂解液15 μl(裂解液主要成分为0.5%乙基苯基聚乙二醇-40，0.5%吐温-20，蛋白酶K 200 μg/ml)于65℃ 15分钟，95℃ 10分钟完成标本的处理。50 μl PCR反应体积中，含10×PCR缓冲液2.5 μl，4种dNTP 2 μl (2 mmol)，上下游引物0.3 μmol/L，加入标准株及临床株各5 μl及10 μl，于95℃ 5分钟预变性后，加入TaqDNA聚合酶1.5 U(购自华美生物工程公司)，于93℃ 1分钟，50℃ 1分钟，72℃ 2分钟共36个循环后72℃延伸10分钟。取10 μl扩增产物在2%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml溴化乙啶)中电泳分离，并设立标准分子量对照，在紫外灯下，于预定的1 077 bp出现一条清晰亮带。
4.RFLP分析：取临床标本的PCR阳性产物及标准株各5 μl，加限制性核酸内切酶AluⅠ、MspⅠ和HinfⅠ各5 U(购自大连宝泰克公司)，37℃过夜消化，采用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，硝酸银染色：10%冰乙酸固定20分钟，双蒸水洗涤3次后放入0.1%硝酸银染色液中染色30分钟，加入预冷的3%碳酸钠显色液，5分钟左右，条带清晰，加入10%冰乙酸终止显色。
, 百拇医药
结果
一、标本检测结果
106例孕妇宫颈标本培养及PCR检测阳性26例，感染率24.5%。26例孕妇所生新生儿眼部及鼻咽部各检出CT 8例及2例，均为经阴道分娩，垂直传播率为38%。
二、10例感染CT新生儿的临床资料
10例中Apgar评分≤7分3例，早产1例，低出生体重(<2500 g)2例，围产期死亡1例，正常3例。
10例CT阳性患儿有1例死亡，此患儿为鼻咽部CT阳性，于采集标本当日死于重症肺炎引起的呼吸衰竭。余9例给予0.5%红霉素滴眼液滴眼，并口服阿奇霉素(商品名为希舒美)(10 mg/kg)，连用3天，追踪4个月无一例发生CT结膜炎、肺炎。
三、基因型鉴定结果
, 百拇医药
10例CT阳性患儿及其母的临床标本经PCR-RFLP分析法鉴定基因型，证实每对母婴标本为同一基因型，与标准株比较在同一部位出现特征DNA带谱，据阳性多少依次为E型5例，D型2例，F型2例，J型1例。
讨论
泌尿生殖道CT感染是性传播性疾病，由于其感染的隐蔽性、持续性、广泛性及危害性，从80年代起便引起人们的高度重视，美国每年有300～400万受感染人群。有20%～70%的盆腔炎与CT感染有关。我国不同城市妇科门诊统计CT感染率在15%～20%左右。孕期由于淋巴细胞增殖受抑制对CT更易感，感染率高达20%～30%，本组阳性率为24.5%，与文献报道相符。有研究报道，孕晚期与孕早、中期相比，CT感染率偏高，考虑检出24.5%的高感染率，与采集孕晚期标本有关，进一步证实孕期宫颈CT感染率较高，提示长春地区孕妇CT感染同样流行，应引起妇科及儿科医师的重视[3]。
母婴垂直传播途径可有宫内感染及分娩过程中感染，其中以分娩过程中经产道感染最为重要。26例宫颈CT阳性的孕妇，24例为阴道分娩，其新生儿从眼及鼻咽部检测出10例阳性，2例剖宫产的新生儿CT检测阴性，垂直感染率为39%，低于文献报道[4]。考虑与我们采样时间较早有关，有些CT隐匿于泪腺中未能下行进入鼻咽部；同时也与分娩方式有关，有文献报道，宫颈CT阳性孕妇行剖宫产，新生儿也有感染CT的危险，但非常罕见，多于宫内感染或有胎膜早破提示上行感染。10例CT阳性新生儿眼部检出8例，鼻咽部2例，证实结膜为CT感染最易侵犯部位，与文献报道一致[5]。受感染的新生儿20%～50%发生CT结膜炎，10%～20%发生CT肺炎。由于我们给予红霉素预防治疗，目前无一例结膜炎、肺炎发生。由于CT肺炎可迟至生后6个月出现，仍需进一步追踪。
, 百拇医药
由于泌尿生殖道CT感染多无症状，成为隐性传染者，少数有炎症表现，女性生殖道CT感染与盆腔炎、子宫内膜炎、卵管性不孕及异位妊娠有关。有学者报道，孕期CT感染与胎膜早破、早产、流产、窒息、低体重、围产儿死亡等密切相关[6]。本组资料中26例CT阳性孕妇中，2例有盆腔炎病史，1例有异位妊娠史，1例有流产史，6例出现胎膜早破。但追问病史，26例孕妇从未进行过CT检测，表明我们对该病认识不足。10例CT阳性新生儿，出生时有窒息史3例，早产1例，低体重2例，并有1例在生后3天死亡，说明孕期CT感染可对新生儿造成严重影响。
CT迄今为止已发现18种血清型，包括最新命名的Da、La、L2a。D～K8血清型引起泌尿生殖道感染、新生儿结膜炎(包涵体性结膜炎)、小婴儿肺炎。血清型检测，以往采用的免疫分型，不但在多次传代标本中容易丢失抗原，而且检测所需一大组价格昂贵的单克隆抗体，使此种方法的应用受到限制。核酸序列分析检测准确，但繁琐费时，成本较高，难以进行快速分型及临床普及。研究发现，CT的MOMP携带区分不同血清型的抗原决定簇，利用PCR扩增CT的MOMP基因，然后分析编码MOMP基因的多态性，每一血清型产生一特征性酶切带谱，将每一临床株的DNA图谱与标准株比较，即可确定其基因型。根据国外学者计算机分析结果，AluⅠ和MspⅠ可区分13种基因型。我们选用这两种酶，并同时应用HinfⅠ区分C、J型的带谱，短时间完成了标本检测，证实每对母婴感染的CT均为同一基因型，从基因水平证实了垂直传播的存在[7]。国外报道E型最多，F型和D型次之，三者可占60%～70%，我们的研究也证实了这一点[8]。
, 百拇医药
PCR-RFLP分析法操作简单，同一标本反复酶切均获一致带谱，证实此方法具有极好的重复性，与免疫分型、序列分析相比，经济、快速，尤其在检测CT的混合型感染中很实用，故此方法可作为目前鉴定CT基因型的重要方法，可推广使用。
参考文献
1 傅文永, 刘桂英, 张玉乾, 等. 婴儿沙眼衣原体肺炎病原学和临床的研究. 中华儿科杂志, 1995, 33:344-346.
2 Frost EH, Deslandes S, Veilleux S, et al. Typing chlamydia trachomatis by detection of restriction fragment length polymorphism in the gene encoding the major outer membrane protein. J Infect Dis, 1991, 163:1103-1107.
, 百拇医药
3 葛百明, 陈治东, 周亚东, 等. 孕产妇感染CT的相关研究. 中国实用妇科与产科杂志, 1997,13:37-38.
4 McGregor JA, French JI. Chlamydia trachomatis infection during pregnancy. Am J Obstet Gynecol, 1991, 164:1782-1789.
5 Heggie AD, Lumicao GG, Stuart LA, et al. Chlamydia trachomatis infection in mothers and infants. Am J Dis Child, 1981,135:507-511.
6 Faro S. Chlamydia trachomatis: female pelvic infection. Am J Obstet Gynecol, 1991, 164: 1767-1770.
, http://www.100md.com
7 Rodriguez P, Vekris A, de Barbeyrac B, et al. Typing of chlamydia trachomatis by restriction endonuclease analysis of the amplified major outer membrane protein gene. J Clin Microbiol, 1991, 29:1132-1136.
8 Poole E, Lamont I. Chlamydia trachomatis serovar differentiation by direct sequence analysis of the variable segment 4 region of the major outer membrane gene. Infect Immun, 1992,60:1089-1094.
(收稿：1998-09-14 修回：1998-12-22), 百拇医药
单位：鲁继荣 李玉梅 傅文永 李善玉 成焕吉 宋涛 长春，白求恩医科大学第一临床学院儿科 130021；单秀娟 刘元洁 娄若康 吉林省计划生育科研所；李姗山 长春白求恩医科大学第一临床医学院皮肤科
关键词：衣原体；沙眼；衣原体感染；细菌外膜蛋白质类；疾病传播；垂直；多态性；限制性片段长度
中华儿科杂志991209 【摘要】 目的 从基因水平证实沙眼衣原体(CT)存在母婴间的垂直传播。方法 对106对母婴标本(宫颈标本106份，婴儿眼结膜、鼻咽部标本212份)用培养法证实CT的感染，PCR扩增CT的大部分主要外膜蛋白(MOMP)基因，并做限制性片段长度多态性(RFLP)分析，将母婴相对的标本通过PCR-RFLP分析法鉴定基因型。结果 106例孕妇宫颈标本培养及PCR阳性26例，从26例阳性孕妇所生新生儿中检出10例CT感染，证实垂直传播率为38%。该10对母婴眼部及鼻咽部各检出CT 8例及2例的标本经鉴定，证实每对母婴感染的CT基因型一致。结论 CT有很高的母婴垂直传播率，应早期筛查，降低新生儿CT感染率。
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The study on vertical transmission of chlamydia trachomatis
LU Jirong, LI Yumei, FU Wenyong, et al. Department of Pediatrics,The First Clinical Medical College, Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130021
【Abstract】 Objective To confirm the vertical transmission of chlamydia trachomatis (CT) at the gene level among 106 pairs of mother-infants. Methods The cell culture method was applied to isolate CT. Most of the gene of major outer membrane protein (MOMP) in CT was amplified by polymerase chain reaction (PCR), and then analyzed by restriction fragment length polymorphism (RFLP). Results Twenty six of 106 pregnant women were positive for CT. Ten infants of the 26 mothers who were CT positive were confirmed to be infected with CT. The rate of vertical transmission was 38%. The 10 strains of CT from the infected infants were identified to be the same genotype as their mothers′. Conclusion The incidence of CT vertical transmission is high, so the infection of CT should be detected early to reduce the chance of CT infection in newborns.
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【Key words】 Chlamydia trachomatis Chlamydia infections Bacterial outer membrane protein gene Disease transmission, vertical Polymorphism, restriction fragment length
沙眼衣原体(chlamydia trachomatis, CT)引起的泌尿生殖道感染逐渐受到重视，近年研究认为，母婴间存在CT的垂直传播。为了从基因水平给予证实，本研究对106对母婴标本进行CT检测，并应用PCR和限制性片段长度多态性(RFLP)分析法，对母婴相对应的阳性标本进行基因型鉴定，现报道如下。
对象和方法
一、对象
1.标本来源：对106例孕晚期妇女临产前(未破水)取宫颈标本106份，其新生儿于出生后3～7天采集睑结膜、鼻咽部标本212份。
, 百拇医药
2.12种CT标准株：A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L1由本院皮肤科李珊山博士惠赠(A/G-17/OT，B/TW-5/OT，C/TW-3/OT，E/UW-5/Cx，F/UW-55/Ur，G/UW-57/Ur，I/UW-12/Ur，HDJK L1/LLCM440)。
二、方法
1.标本采集：采用棉签拭子(宫颈标本可采用消毒刮片)用力擦拭后，迅速洗入2-蔗糖磷酸盐传送液中，放入冰盒内迅速送至研究室，-70℃保存(3天左右进行接种)。
2.细胞培养：采用Hela229细胞，按我室目前采用的方法进行[1]。
3.PCR扩增：CT的主要外膜蛋白(MOMP)引物由Frost等[2]设计，序列为5′-AT GA AA AA AC TC TT GA AA TC GG-3′(相当于MOMP序列的前20个核苷酸)和5′-TT TC TA GA TT TC AT TT TG TT -3′(相当于MOMP序列的1 058～1 077个核苷酸)。扩增片段长度为1 077碱基对(bp)。引物由大连宝泰克生物公司合成。
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将培养阳性的标本液以4℃ 20 000 r/min离心10分钟，吸除上清后，沉淀中加入标本裂解液15 μl(裂解液主要成分为0.5%乙基苯基聚乙二醇-40，0.5%吐温-20，蛋白酶K 200 μg/ml)于65℃ 15分钟，95℃ 10分钟完成标本的处理。50 μl PCR反应体积中，含10×PCR缓冲液2.5 μl，4种dNTP 2 μl (2 mmol)，上下游引物0.3 μmol/L，加入标准株及临床株各5 μl及10 μl，于95℃ 5分钟预变性后，加入TaqDNA聚合酶1.5 U(购自华美生物工程公司)，于93℃ 1分钟，50℃ 1分钟，72℃ 2分钟共36个循环后72℃延伸10分钟。取10 μl扩增产物在2%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml溴化乙啶)中电泳分离，并设立标准分子量对照，在紫外灯下，于预定的1 077 bp出现一条清晰亮带。
4.RFLP分析：取临床标本的PCR阳性产物及标准株各5 μl，加限制性核酸内切酶AluⅠ、MspⅠ和HinfⅠ各5 U(购自大连宝泰克公司)，37℃过夜消化，采用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，硝酸银染色：10%冰乙酸固定20分钟，双蒸水洗涤3次后放入0.1%硝酸银染色液中染色30分钟，加入预冷的3%碳酸钠显色液，5分钟左右，条带清晰，加入10%冰乙酸终止显色。
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结果
一、标本检测结果
106例孕妇宫颈标本培养及PCR检测阳性26例，感染率24.5%。26例孕妇所生新生儿眼部及鼻咽部各检出CT 8例及2例，均为经阴道分娩，垂直传播率为38%。
二、10例感染CT新生儿的临床资料
10例中Apgar评分≤7分3例，早产1例，低出生体重(<2500 g)2例，围产期死亡1例，正常3例。
10例CT阳性患儿有1例死亡，此患儿为鼻咽部CT阳性，于采集标本当日死于重症肺炎引起的呼吸衰竭。余9例给予0.5%红霉素滴眼液滴眼，并口服阿奇霉素(商品名为希舒美)(10 mg/kg)，连用3天，追踪4个月无一例发生CT结膜炎、肺炎。
三、基因型鉴定结果
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10例CT阳性患儿及其母的临床标本经PCR-RFLP分析法鉴定基因型，证实每对母婴标本为同一基因型，与标准株比较在同一部位出现特征DNA带谱，据阳性多少依次为E型5例，D型2例，F型2例，J型1例。
讨论
泌尿生殖道CT感染是性传播性疾病，由于其感染的隐蔽性、持续性、广泛性及危害性，从80年代起便引起人们的高度重视，美国每年有300～400万受感染人群。有20%～70%的盆腔炎与CT感染有关。我国不同城市妇科门诊统计CT感染率在15%～20%左右。孕期由于淋巴细胞增殖受抑制对CT更易感，感染率高达20%～30%，本组阳性率为24.5%，与文献报道相符。有研究报道，孕晚期与孕早、中期相比，CT感染率偏高，考虑检出24.5%的高感染率，与采集孕晚期标本有关，进一步证实孕期宫颈CT感染率较高，提示长春地区孕妇CT感染同样流行，应引起妇科及儿科医师的重视[3]。
母婴垂直传播途径可有宫内感染及分娩过程中感染，其中以分娩过程中经产道感染最为重要。26例宫颈CT阳性的孕妇，24例为阴道分娩，其新生儿从眼及鼻咽部检测出10例阳性，2例剖宫产的新生儿CT检测阴性，垂直感染率为39%，低于文献报道[4]。考虑与我们采样时间较早有关，有些CT隐匿于泪腺中未能下行进入鼻咽部；同时也与分娩方式有关，有文献报道，宫颈CT阳性孕妇行剖宫产，新生儿也有感染CT的危险，但非常罕见，多于宫内感染或有胎膜早破提示上行感染。10例CT阳性新生儿眼部检出8例，鼻咽部2例，证实结膜为CT感染最易侵犯部位，与文献报道一致[5]。受感染的新生儿20%～50%发生CT结膜炎，10%～20%发生CT肺炎。由于我们给予红霉素预防治疗，目前无一例结膜炎、肺炎发生。由于CT肺炎可迟至生后6个月出现，仍需进一步追踪。
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由于泌尿生殖道CT感染多无症状，成为隐性传染者，少数有炎症表现，女性生殖道CT感染与盆腔炎、子宫内膜炎、卵管性不孕及异位妊娠有关。有学者报道，孕期CT感染与胎膜早破、早产、流产、窒息、低体重、围产儿死亡等密切相关[6]。本组资料中26例CT阳性孕妇中，2例有盆腔炎病史，1例有异位妊娠史，1例有流产史，6例出现胎膜早破。但追问病史，26例孕妇从未进行过CT检测，表明我们对该病认识不足。10例CT阳性新生儿，出生时有窒息史3例，早产1例，低体重2例，并有1例在生后3天死亡，说明孕期CT感染可对新生儿造成严重影响。
CT迄今为止已发现18种血清型，包括最新命名的Da、La、L2a。D～K8血清型引起泌尿生殖道感染、新生儿结膜炎(包涵体性结膜炎)、小婴儿肺炎。血清型检测，以往采用的免疫分型，不但在多次传代标本中容易丢失抗原，而且检测所需一大组价格昂贵的单克隆抗体，使此种方法的应用受到限制。核酸序列分析检测准确，但繁琐费时，成本较高，难以进行快速分型及临床普及。研究发现，CT的MOMP携带区分不同血清型的抗原决定簇，利用PCR扩增CT的MOMP基因，然后分析编码MOMP基因的多态性，每一血清型产生一特征性酶切带谱，将每一临床株的DNA图谱与标准株比较，即可确定其基因型。根据国外学者计算机分析结果，AluⅠ和MspⅠ可区分13种基因型。我们选用这两种酶，并同时应用HinfⅠ区分C、J型的带谱，短时间完成了标本检测，证实每对母婴感染的CT均为同一基因型，从基因水平证实了垂直传播的存在[7]。国外报道E型最多，F型和D型次之，三者可占60%～70%，我们的研究也证实了这一点[8]。
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PCR-RFLP分析法操作简单，同一标本反复酶切均获一致带谱，证实此方法具有极好的重复性，与免疫分型、序列分析相比，经济、快速，尤其在检测CT的混合型感染中很实用，故此方法可作为目前鉴定CT基因型的重要方法，可推广使用。
参考文献
1 傅文永, 刘桂英, 张玉乾, 等. 婴儿沙眼衣原体肺炎病原学和临床的研究. 中华儿科杂志, 1995, 33:344-346.
2 Frost EH, Deslandes S, Veilleux S, et al. Typing chlamydia trachomatis by detection of restriction fragment length polymorphism in the gene encoding the major outer membrane protein. J Infect Dis, 1991, 163:1103-1107.
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3 葛百明, 陈治东, 周亚东, 等. 孕产妇感染CT的相关研究. 中国实用妇科与产科杂志, 1997,13:37-38.
4 McGregor JA, French JI. Chlamydia trachomatis infection during pregnancy. Am J Obstet Gynecol, 1991, 164:1782-1789.
5 Heggie AD, Lumicao GG, Stuart LA, et al. Chlamydia trachomatis infection in mothers and infants. Am J Dis Child, 1981,135:507-511.
6 Faro S. Chlamydia trachomatis: female pelvic infection. Am J Obstet Gynecol, 1991, 164: 1767-1770.
, http://www.100md.com
7 Rodriguez P, Vekris A, de Barbeyrac B, et al. Typing of chlamydia trachomatis by restriction endonuclease analysis of the amplified major outer membrane protein gene. J Clin Microbiol, 1991, 29:1132-1136.
8 Poole E, Lamont I. Chlamydia trachomatis serovar differentiation by direct sequence analysis of the variable segment 4 region of the major outer membrane gene. Infect Immun, 1992,60:1089-1094.
(收稿：1998-09-14 修回：1998-12-22), 百拇医药