地塞米松对大鼠星形胶质细胞诱导型一氧化氮合酶表达的影响
作者：高峰 水泉祥
单位：高峰(杭州，浙江医科大学附属儿童医院内科神经组 310003)；水泉祥(杭州，浙江医科大学附属儿童医院内科神经组 310003)
关键词：星形细胞；一氧化氮合酶；地塞米松
中华儿科杂志000106 摘 要：目的 观察内毒素诱导对体外培养的大鼠星形胶质细胞一氧化氮(NO)及其诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达的变化，以及地塞米松(DEX)对其的影响。方法 采用Griess法和半定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法，对正常、内毒素诱导后及加入DEX的内毒素诱导后大鼠星形胶质细胞NO及其iNOS mRNA表达进行检测。结果 (1)内毒素诱导的星形胶质细胞NO产生增加，且呈内毒素剂量和时间依赖性；(2)DEX对内毒素诱导的星形胶质细胞NO产生有抑制作用；(3)内毒素能诱导星形胶质细胞iNOS mRNA的表达，而DEX对其具有抑制作用。结论 内毒素能刺激星形胶质细胞iNOS的表达，DEX对其具有负调节作用，其机制是通过抑制iNOS mRNA转录实现的。
, 百拇医药
The effect of dexamethasone on the expression of inducible nitric oxide synthase in rat astrocytes
GAO Feng
(Department of Neurology, Children′s Hospital, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310003, China)
SHUI Quanxiang
(Department of Neurology, Children′s Hospital, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310003, China)
Abstract：Objective To explore the change of nitric oxide (NO), the mRNA expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) induced by endotoxin in cultured rat astrocytes, and the effect of dexamethasone on it. Methods NO was detected by Griess method and iNOS mRNA expression was semiquantitated by RT-PCR techniques in normal astrocytes, endotoxin induced astrocytes and dexamethasone treated endotoxin induced astrocytes. Results (1) NO increased in a dose and time-dependent manner when cells were induced by endotoxin. (2) Dexamethasone inhibited the production of NO induced by endotoxin in astrocytes. (3) The iNOS mRNA was expressed in astrocytes by endotoxin inducement, and down-regulated by dexamethasone. Conclusion Endotoxin could stimulate the release of NO and the expression of iNOS mRNA in rat astrocytes, which could be down-regulated by dexamethasone. The mechanism might contribute to the inhibition of iNOS mRNA transcription.
, 百拇医药
Key words：Astrocytes; Nitric-oxide synthase; Dexamethasone▲
近年来，随着对一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)研究的深入，已证明体内有多种细胞(如巨噬细胞、内皮细胞、神经元细胞等)能够产生NOS，但是有关星形胶质细胞NOS尤其是诱导型NOS(iNOS)的研究报道尚不多见。我们以内毒素成分脂多糖(LPS)诱导体外培养的星形胶质细胞NO、iNOS mRNA的表达以及地塞米松(DEX)对其影响进行研究。
材料和方法
一、细胞培养
参照文献[1]的方法，在无菌条件下，取0～2 d的SD大鼠的大脑皮层，剔除软脑膜及血管，在37℃条件下，用0.125%胰蛋白酶消化30 min，加入含20%小牛血清的达氏修正依氏培养液(DMEM)中止胰酶消化，经200目钢丝网筛过滤，利用差速粘附纯化单细胞悬液后，以108/L的密度接种至预先涂布有鼠尾胶原的培养瓶中。 培养条件为37℃、5% CO2。培养液成分为DMEM和小牛血清。每隔2～3 d换液1次，待原代细胞长满培养瓶底后去除旧培养液，加入0.125%胰蛋白酶，37℃消化10 min，用吸管反复吹打细胞从瓶壁脱落，收集细胞悬液，接种至培养板或有盖玻片的培养皿中，在上述条件下继续培养。
, 百拇医药
二、星形胶质细胞的鉴定
间接荧光抗体染色法：将长有细胞的盖玻片经丙酮固定10 min，PBS洗3 min，共3次。1∶160兔抗、DEX为10-7 mol/L鼠胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗血清(Sigma产品)，37℃，40 min，PBS洗3 min，共3次。1∶100稀释羊抗兔IgG-FITC(Sigma产品)，37℃，40 min，PBS洗3 min，共3次。0.1%伊文兰衬染3～5 min，PBS洗2 min，共3次，缓冲甘油封片，最后荧光显微镜下观察细胞。
三、实验分组
经传代的星形胶质细胞呈融合状态后，吸去含血清的培养液，Hank′s液洗涤后，分别加入含不同浓度的LPS(Sigma产品)或(和)DEX的无血清DMEM(无酚红)中继续培养。将实验分为3组：(1)对照组；(2)LPS组；(3)LPS+DEX组；每点作5个复孔。于不同时间收集上层培养液，-20℃保存，待测NO，细胞层抽提RNA。
, http://www.100md.com
四、NO的测定
以NO的稳定性代谢产物-亚硝酸盐作为检测NO的指标，用Griess法试剂盒(美国Promega公司)测定，严格按产品说明书操作。
五、iNOS mRNA的表达
1.cDNA引物由上海生工生物工程所合成。iNOS cDNA引物序列：(1)5′-CTGCATGGAACAAGT ATAAGGCAAAC-3′；(2)5′-CAGACAGTTTCTGGT CGATGTCATGA-3′，反应产物229 bp。β-actin cDNA引物序列 ：(1)5′-GTGGGCCGCTCTAGGCACCA-3′；(2)5′-CTTTAGCACGCACTGTAGTTTCTC-3′，反应产物540 bp。β-actin用作被检RNA样本质和量的对照。
2.RNA的抽提：用Tripure法分离试剂盒(德国宝灵曼公司)抽提RNA，严格按说明书操作。
, 百拇医药
3.反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)过程：用一管法RT-PCR试剂盒(德国宝灵曼公司)，在同一试管中进行(50 μl反应体积内)RT- PCR：4种dNTP 各200 μmol/L，引物浓度各0.4 μmol/L，DTT溶液5 mmol/L，5×RT-PCR反应液(1.5 mmol/L MgCl2)，样本RNA 1 μg，混合酶1 μl，RNA酶抑制剂10 U，无RNA酶水补至总反应体系为50 μl。反转录条件：55℃，30 min 。PCR条件：94℃，2 min；94℃，30 s、55℃，30 s、68℃，1 min；共35个循环，最后68℃ 7 min。
4.结果观察：反应产物20 μl加上样缓冲液(含溴酚兰等)2 μl ，与PCR 标记一起在2%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5 μg/ml)电泳(50 V，3 h)，紫外线灯下观察结果并摄像。胶片经光密度扫描仪扫描iNOS cDNA与β-actin cDNA阳性条带，结果以两者的吸光度比值表示。
, 百拇医药
六、统计学处理
实验数据用均数±标准差(
±s)表示，采用计算机统计软件(spss 7.5 for windows)对数据进行F、q及t检验。
结果
一、星形胶质细胞NO产生的变化
传代后的细胞经GFAP免疫荧光染色为阳性。星形胶质细胞不加LPS，仅加不含小牛血清的DMEM中培养36 h后，能测得一定量的NO[(0.7±0.5)μmol/L]。加入LPS后，随LPS浓度增高，NO产生随之增加[LPS浓度为0.01、0.1和1 mg/L时，NO分别为(7.9±1.9)、(17.6±3.0)和(27.2±3.9) μmol/L]。LPS浓度为10 mg/L时NO达到高峰(40.0±2.5)μmol/L(不同浓度间比较F值=177.72，P<0.001)。
, 百拇医药
星形胶质细胞分别加入LPS或LPS+DEX不同时间后，可见NO随培养时间延长而增高，12 h后尤为明显。12 h后对照组、LPS组、LPS+DEX组各时间点之间差异均有显著意义(表1)。
表1 对照组、LPS组和LPS+DEX组不同培养时
间对星形胶质细胞NO产生的影响(±s，μmol/L) 组别
培养时间(h)
不同时间
比较F值
0
3
, 百拇医药 12
24
36
48
对照组
3.8±1.0
3.3±1.1
4.2±1.5
5.3±1.2
3.7±1.2
3.4±1.8
0.87
LPS+DEX组
, 百拇医药
2.5±0.5
4.9±0.4
5.5±1.2
12.8±1.0*
16.9±2.2*
21.7±1.2*
109.16**
LPS组
3.3±1.0
6.0±0.5*
6.9±0.5*
, 百拇医药
27.7±1.5*△
29.2±6.1*△
29.4±1.6*△
111.67**
不同组间比较F值
2.72
10.82**
6.94**
321.42**
56.08**
, http://www.100md.com
470.54**
注：与对照组比较，* P<0.05；** P<0.05；与LPS+DEX组比较，△ P<0.01；LPS为5 mg/L 不同浓度DEX对NO产生有明显的影响，LPS浓度为5 mg/L，培养24 h时，NO产生随DEX浓度的升高(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L)而逐渐降低[NO分别为(29.8±8.4)、(30.3±1.5)、(22.2±6.5)、(15.2±1.3)、(13.6±1.3)和(14.4±1.8)μmol/L，不同浓度间比较F=14.32、P<0.001]。
二、星形胶质细胞iNOS mRNA的表达
, http://www.100md.com 用RT-PCR检测星形胶质细胞在LPS刺激后培养的不同时间的结果表明：0 h iNOS mRNA不表达，3 h已可见表达，于12 h表达明显增高，并达高峰，24 h表达下降。虽然LPS+DEX组也可见iNOS mRNA表达，但较同时间LPS组的强度明显减弱(表2、图1)。
表2 星形胶质细胞不同时间iNOS mRNA的表达(±s) 组别
iNOS/β-actin积分光度比值
不同浓度间
比较F值
3 h
12 h
24 h
, 百拇医药
LPS组
0.49±0.07
0.88±0.07
0.76±0.07
22.69**
LPS+DEX组
0.29±0.07
0.63±0.05
0.36±0.09
19.20**
两组间比较t值
, 百拇医药
4.04*
7.02**
5.01**
* P<0.05，** P<0.01；LPS为5 mg/L，DEX为10-7 mol/L
注：A: PCR标记；B: 对照组；C: 0 h LPS；D: 3 h LPS；E: 3 h LPS+DEX；F: 12 h LPS；G: 12 h LPS+DEX；H: 24 h LPS；I: 24 h LPS+DEX
图1 星形胶质细胞不同时间iNOS mRNA的表达(LPS为5 mg/L、DEX为10-7mol/L)
, 百拇医药
讨论
近年来的研究表明，星形胶质细胞除具有支持、营养、调节神经递质、合成神经活性物质等功能外，还具有免疫细胞的功能，与其他外周免疫细胞一样能够分泌、合成炎性细胞因子，表达主要组织相容性复合物(MHC)，参与了神经系统疾病的病理过程[2、3]。哺乳动物体内NOS至少可分为3种类型：神经元性、内皮细胞性和诱导性，三者的核苷酸和氨基酸序列约50%是同源性的。已经证明巨噬细胞、平滑肌细胞等在内毒素和细胞因子等诱导刺激下能够激活iNOS。而iNOS介导的NO主要作为细胞毒性和免疫信息分子，具有杀伤、清除和免疫调节作用。同时，也引起组织、细胞损伤等病理过程[4]。
本研究以NO的稳定性代谢产物-亚硝酸盐作为检测NO和iNOS活性的指标。结果表明，星形胶质细胞在细菌成分LPS的刺激下，NO产生增加，呈LPS剂量和时间依赖性，结果与Park等[5]研究的相一致。LPS作用后 3～12 h可见NO少量增高，24 h后明显增加。由于体外培养的星形胶质细胞中刺激原的持续存在和无清除NO的场所，因此，NO随时间依赖性增加。 糖皮质激素具有抗炎作用，能够抑制炎性细胞释放肿瘤坏死因子(TNF)、IL-6等细胞因子。本研究发现，DEX也能抑制受LPS刺激的星形胶质细胞过度产生NO，这为我们临床应用DEX治疗中枢神经系统感染性疾病提供了新的依据。
, 百拇医药
我们应用RT-PCR方法证实星形胶质细胞在静息状态下iNOS mRNA不表达，经LPS刺激后表达的峰值时间在12 h，以后明显减弱。说明LPS对星形胶质细胞iNOS的诱导是首先通过mRNA的转录实现的[6]。从LPS刺激后iNOS mRNA表达的时间曲线看，与Park等[7]以Northern blotting方法证明iNOS mRNA表达的峰值时间在4～8 h不一致。两者在时间上的差异，可能是因为方法学的不同所致。Northern blotting法比本研究所采用的半定量RT-PCR法更适于定量分析。本研究还发现DEX能明显减弱星形胶质细胞iNOS mRNA的表达，这一结果提示了DEX对iNOS的表达也是通过分子机制调节的。
总之，细菌内毒素LPS能刺激星形胶质细胞iNOS的表达，且呈时间和剂量依赖性。DEX对其具有负调节作用，这种作用可能是通过抑制iNOS mRNA转录实现的。
基金项目：浙江省卫生厅基金资助项目(98A056)；浙江省教委基金资助项目(97069)
, 百拇医药
参考文献：
[1]薛庆善, 郭畹华. 大鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养及其促神经突起生长作用研究. 神经解剖学杂志，1996，12：151-155.
[2]Montgomery DL. Astrocytes： form， function and roles in disease. Vet Pathol, 1994： 31, 145-167.
[3]Chandler LJ, Kopnisky K, Richards E, et al. Angiotensin II decreases inducible nitric oxide synthase expression in rat astroglial cultures. Am J Physiol, 1995, 268:700-707.
[4]Knowles RG, Moncada S. Nitric oxide synthases in mammals. Biochem J, 1994, 298:249-258.
, http://www.100md.com
[5]Park SK, Murphy S. Duration of expression of inducible nitric oxide synthase in glial cells. J Neurosci Res, 1994, 39:405-411.
[6]Galea E, Reis DJ, Feinstin DL. Cloning and expression of inducible nitric oxide synthase from rat astrocytes. J Neurosci Res, 1994, 37:406-414.
[7]Park SK，Grzybicki D, Lin HL, et al. Modulation of inducible nitric oxide synthase expression in astroglial cell. Neuropharmacology, 1994, 33:1419-1423.
收稿日期：1998-12-09, http://www.100md.com
单位：高峰(杭州，浙江医科大学附属儿童医院内科神经组 310003)；水泉祥(杭州，浙江医科大学附属儿童医院内科神经组 310003)
关键词：星形细胞；一氧化氮合酶；地塞米松
中华儿科杂志000106 摘 要：目的 观察内毒素诱导对体外培养的大鼠星形胶质细胞一氧化氮(NO)及其诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达的变化，以及地塞米松(DEX)对其的影响。方法 采用Griess法和半定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法，对正常、内毒素诱导后及加入DEX的内毒素诱导后大鼠星形胶质细胞NO及其iNOS mRNA表达进行检测。结果 (1)内毒素诱导的星形胶质细胞NO产生增加，且呈内毒素剂量和时间依赖性；(2)DEX对内毒素诱导的星形胶质细胞NO产生有抑制作用；(3)内毒素能诱导星形胶质细胞iNOS mRNA的表达，而DEX对其具有抑制作用。结论 内毒素能刺激星形胶质细胞iNOS的表达，DEX对其具有负调节作用，其机制是通过抑制iNOS mRNA转录实现的。
, 百拇医药
The effect of dexamethasone on the expression of inducible nitric oxide synthase in rat astrocytes
GAO Feng
(Department of Neurology, Children′s Hospital, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310003, China)
SHUI Quanxiang
(Department of Neurology, Children′s Hospital, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310003, China)
Abstract：Objective To explore the change of nitric oxide (NO), the mRNA expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) induced by endotoxin in cultured rat astrocytes, and the effect of dexamethasone on it. Methods NO was detected by Griess method and iNOS mRNA expression was semiquantitated by RT-PCR techniques in normal astrocytes, endotoxin induced astrocytes and dexamethasone treated endotoxin induced astrocytes. Results (1) NO increased in a dose and time-dependent manner when cells were induced by endotoxin. (2) Dexamethasone inhibited the production of NO induced by endotoxin in astrocytes. (3) The iNOS mRNA was expressed in astrocytes by endotoxin inducement, and down-regulated by dexamethasone. Conclusion Endotoxin could stimulate the release of NO and the expression of iNOS mRNA in rat astrocytes, which could be down-regulated by dexamethasone. The mechanism might contribute to the inhibition of iNOS mRNA transcription.
, 百拇医药
Key words：Astrocytes; Nitric-oxide synthase; Dexamethasone▲
近年来，随着对一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)研究的深入，已证明体内有多种细胞(如巨噬细胞、内皮细胞、神经元细胞等)能够产生NOS，但是有关星形胶质细胞NOS尤其是诱导型NOS(iNOS)的研究报道尚不多见。我们以内毒素成分脂多糖(LPS)诱导体外培养的星形胶质细胞NO、iNOS mRNA的表达以及地塞米松(DEX)对其影响进行研究。
材料和方法
一、细胞培养
参照文献[1]的方法，在无菌条件下，取0～2 d的SD大鼠的大脑皮层，剔除软脑膜及血管，在37℃条件下，用0.125%胰蛋白酶消化30 min，加入含20%小牛血清的达氏修正依氏培养液(DMEM)中止胰酶消化，经200目钢丝网筛过滤，利用差速粘附纯化单细胞悬液后，以108/L的密度接种至预先涂布有鼠尾胶原的培养瓶中。 培养条件为37℃、5% CO2。培养液成分为DMEM和小牛血清。每隔2～3 d换液1次，待原代细胞长满培养瓶底后去除旧培养液，加入0.125%胰蛋白酶，37℃消化10 min，用吸管反复吹打细胞从瓶壁脱落，收集细胞悬液，接种至培养板或有盖玻片的培养皿中，在上述条件下继续培养。
, 百拇医药
二、星形胶质细胞的鉴定
间接荧光抗体染色法：将长有细胞的盖玻片经丙酮固定10 min，PBS洗3 min，共3次。1∶160兔抗、DEX为10-7 mol/L鼠胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)抗血清(Sigma产品)，37℃，40 min，PBS洗3 min，共3次。1∶100稀释羊抗兔IgG-FITC(Sigma产品)，37℃，40 min，PBS洗3 min，共3次。0.1%伊文兰衬染3～5 min，PBS洗2 min，共3次，缓冲甘油封片，最后荧光显微镜下观察细胞。
三、实验分组
经传代的星形胶质细胞呈融合状态后，吸去含血清的培养液，Hank′s液洗涤后，分别加入含不同浓度的LPS(Sigma产品)或(和)DEX的无血清DMEM(无酚红)中继续培养。将实验分为3组：(1)对照组；(2)LPS组；(3)LPS+DEX组；每点作5个复孔。于不同时间收集上层培养液，-20℃保存，待测NO，细胞层抽提RNA。
, http://www.100md.com
四、NO的测定
以NO的稳定性代谢产物-亚硝酸盐作为检测NO的指标，用Griess法试剂盒(美国Promega公司)测定，严格按产品说明书操作。
五、iNOS mRNA的表达
1.cDNA引物由上海生工生物工程所合成。iNOS cDNA引物序列：(1)5′-CTGCATGGAACAAGT ATAAGGCAAAC-3′；(2)5′-CAGACAGTTTCTGGT CGATGTCATGA-3′，反应产物229 bp。β-actin cDNA引物序列 ：(1)5′-GTGGGCCGCTCTAGGCACCA-3′；(2)5′-CTTTAGCACGCACTGTAGTTTCTC-3′，反应产物540 bp。β-actin用作被检RNA样本质和量的对照。
2.RNA的抽提：用Tripure法分离试剂盒(德国宝灵曼公司)抽提RNA，严格按说明书操作。
, 百拇医药
3.反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)过程：用一管法RT-PCR试剂盒(德国宝灵曼公司)，在同一试管中进行(50 μl反应体积内)RT- PCR：4种dNTP 各200 μmol/L，引物浓度各0.4 μmol/L，DTT溶液5 mmol/L，5×RT-PCR反应液(1.5 mmol/L MgCl2)，样本RNA 1 μg，混合酶1 μl，RNA酶抑制剂10 U，无RNA酶水补至总反应体系为50 μl。反转录条件：55℃，30 min 。PCR条件：94℃，2 min；94℃，30 s、55℃，30 s、68℃，1 min；共35个循环，最后68℃ 7 min。
4.结果观察：反应产物20 μl加上样缓冲液(含溴酚兰等)2 μl ，与PCR 标记一起在2%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5 μg/ml)电泳(50 V，3 h)，紫外线灯下观察结果并摄像。胶片经光密度扫描仪扫描iNOS cDNA与β-actin cDNA阳性条带，结果以两者的吸光度比值表示。
, 百拇医药
六、统计学处理
实验数据用均数±标准差(
±s)表示，采用计算机统计软件(spss 7.5 for windows)对数据进行F、q及t检验。结果
一、星形胶质细胞NO产生的变化
传代后的细胞经GFAP免疫荧光染色为阳性。星形胶质细胞不加LPS，仅加不含小牛血清的DMEM中培养36 h后，能测得一定量的NO[(0.7±0.5)μmol/L]。加入LPS后，随LPS浓度增高，NO产生随之增加[LPS浓度为0.01、0.1和1 mg/L时，NO分别为(7.9±1.9)、(17.6±3.0)和(27.2±3.9) μmol/L]。LPS浓度为10 mg/L时NO达到高峰(40.0±2.5)μmol/L(不同浓度间比较F值=177.72，P<0.001)。
, 百拇医药
星形胶质细胞分别加入LPS或LPS+DEX不同时间后，可见NO随培养时间延长而增高，12 h后尤为明显。12 h后对照组、LPS组、LPS+DEX组各时间点之间差异均有显著意义(表1)。
表1 对照组、LPS组和LPS+DEX组不同培养时
间对星形胶质细胞NO产生的影响(
±s，μmol/L) 组别培养时间(h)
不同时间
比较F值
0
3
, 百拇医药 12
24
36
48
对照组
3.8±1.0
3.3±1.1
4.2±1.5
5.3±1.2
3.7±1.2
3.4±1.8
0.87
LPS+DEX组
, 百拇医药
2.5±0.5
4.9±0.4
5.5±1.2
12.8±1.0*
16.9±2.2*
21.7±1.2*
109.16**
LPS组
3.3±1.0
6.0±0.5*
6.9±0.5*
, 百拇医药
27.7±1.5*△
29.2±6.1*△
29.4±1.6*△
111.67**
不同组间比较F值
2.72
10.82**
6.94**
321.42**
56.08**
, http://www.100md.com
470.54**
注：与对照组比较，* P<0.05；** P<0.05；与LPS+DEX组比较，△ P<0.01；LPS为5 mg/L 不同浓度DEX对NO产生有明显的影响，LPS浓度为5 mg/L，培养24 h时，NO产生随DEX浓度的升高(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L)而逐渐降低[NO分别为(29.8±8.4)、(30.3±1.5)、(22.2±6.5)、(15.2±1.3)、(13.6±1.3)和(14.4±1.8)μmol/L，不同浓度间比较F=14.32、P<0.001]。
二、星形胶质细胞iNOS mRNA的表达
, http://www.100md.com 用RT-PCR检测星形胶质细胞在LPS刺激后培养的不同时间的结果表明：0 h iNOS mRNA不表达，3 h已可见表达，于12 h表达明显增高，并达高峰，24 h表达下降。虽然LPS+DEX组也可见iNOS mRNA表达，但较同时间LPS组的强度明显减弱(表2、图1)。
表2 星形胶质细胞不同时间iNOS mRNA的表达(
±s) 组别iNOS/β-actin积分光度比值
不同浓度间
比较F值
3 h
12 h
24 h
, 百拇医药
LPS组
0.49±0.07
0.88±0.07
0.76±0.07
22.69**
LPS+DEX组
0.29±0.07
0.63±0.05
0.36±0.09
19.20**
两组间比较t值
, 百拇医药
4.04*
7.02**
5.01**
* P<0.05，** P<0.01；LPS为5 mg/L，DEX为10-7 mol/L
注：A: PCR标记；B: 对照组；C: 0 h LPS；D: 3 h LPS；E: 3 h LPS+DEX；F: 12 h LPS；G: 12 h LPS+DEX；H: 24 h LPS；I: 24 h LPS+DEX
图1 星形胶质细胞不同时间iNOS mRNA的表达(LPS为5 mg/L、DEX为10-7mol/L)
, 百拇医药
讨论
近年来的研究表明，星形胶质细胞除具有支持、营养、调节神经递质、合成神经活性物质等功能外，还具有免疫细胞的功能，与其他外周免疫细胞一样能够分泌、合成炎性细胞因子，表达主要组织相容性复合物(MHC)，参与了神经系统疾病的病理过程[2、3]。哺乳动物体内NOS至少可分为3种类型：神经元性、内皮细胞性和诱导性，三者的核苷酸和氨基酸序列约50%是同源性的。已经证明巨噬细胞、平滑肌细胞等在内毒素和细胞因子等诱导刺激下能够激活iNOS。而iNOS介导的NO主要作为细胞毒性和免疫信息分子，具有杀伤、清除和免疫调节作用。同时，也引起组织、细胞损伤等病理过程[4]。
本研究以NO的稳定性代谢产物-亚硝酸盐作为检测NO和iNOS活性的指标。结果表明，星形胶质细胞在细菌成分LPS的刺激下，NO产生增加，呈LPS剂量和时间依赖性，结果与Park等[5]研究的相一致。LPS作用后 3～12 h可见NO少量增高，24 h后明显增加。由于体外培养的星形胶质细胞中刺激原的持续存在和无清除NO的场所，因此，NO随时间依赖性增加。 糖皮质激素具有抗炎作用，能够抑制炎性细胞释放肿瘤坏死因子(TNF)、IL-6等细胞因子。本研究发现，DEX也能抑制受LPS刺激的星形胶质细胞过度产生NO，这为我们临床应用DEX治疗中枢神经系统感染性疾病提供了新的依据。
, 百拇医药
我们应用RT-PCR方法证实星形胶质细胞在静息状态下iNOS mRNA不表达，经LPS刺激后表达的峰值时间在12 h，以后明显减弱。说明LPS对星形胶质细胞iNOS的诱导是首先通过mRNA的转录实现的[6]。从LPS刺激后iNOS mRNA表达的时间曲线看，与Park等[7]以Northern blotting方法证明iNOS mRNA表达的峰值时间在4～8 h不一致。两者在时间上的差异，可能是因为方法学的不同所致。Northern blotting法比本研究所采用的半定量RT-PCR法更适于定量分析。本研究还发现DEX能明显减弱星形胶质细胞iNOS mRNA的表达，这一结果提示了DEX对iNOS的表达也是通过分子机制调节的。
总之，细菌内毒素LPS能刺激星形胶质细胞iNOS的表达，且呈时间和剂量依赖性。DEX对其具有负调节作用，这种作用可能是通过抑制iNOS mRNA转录实现的。
基金项目：浙江省卫生厅基金资助项目(98A056)；浙江省教委基金资助项目(97069)
, 百拇医药
参考文献：
[1]薛庆善, 郭畹华. 大鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养及其促神经突起生长作用研究. 神经解剖学杂志，1996，12：151-155.
[2]Montgomery DL. Astrocytes： form， function and roles in disease. Vet Pathol, 1994： 31, 145-167.
[3]Chandler LJ, Kopnisky K, Richards E, et al. Angiotensin II decreases inducible nitric oxide synthase expression in rat astroglial cultures. Am J Physiol, 1995, 268:700-707.
[4]Knowles RG, Moncada S. Nitric oxide synthases in mammals. Biochem J, 1994, 298:249-258.
, http://www.100md.com
[5]Park SK, Murphy S. Duration of expression of inducible nitric oxide synthase in glial cells. J Neurosci Res, 1994, 39:405-411.
[6]Galea E, Reis DJ, Feinstin DL. Cloning and expression of inducible nitric oxide synthase from rat astrocytes. J Neurosci Res, 1994, 37:406-414.
[7]Park SK，Grzybicki D, Lin HL, et al. Modulation of inducible nitric oxide synthase expression in astroglial cell. Neuropharmacology, 1994, 33:1419-1423.
收稿日期：1998-12-09, http://www.100md.com